PCR扩增原理及过程课件

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《PCR详细讲解》课件

Oligo
《PCR详细讲解》
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Primer BLAST
《PCR详细讲解》
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《PCR详细讲解》
逆转录PCR
《PCR详细讲解》
逆转录PCR的原理
由一条RNA单链转录为互补DNA （cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
《PCR详细讲解》
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
《PCR详细讲解》
24个核苷酸。识别mRNA的3’端poly（A）尾，
因此仅mRNA可被逆转录。
《PCR详细讲解》
逆转录引物：
（3）特异性引物能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
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半定量 RT-PCR
《PCR详细讲解》
基本概念
半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。

实验三PCR扩增制备目的基因PPT课件

生物信息学分析
利用生物信息学软件对PCR产物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体，需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出人类基因突变，从而对遗传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确地检测出细菌、病毒等病原体，为疾病预防和控制提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出目的基因，并在体外进行表达和纯化，为基因工程研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致，并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。

PCR扩增原理及过程

产物变性
再次加热至95℃，使新合成的DNA 链变性，释放出结合在模板上的引物，为下一轮循环做准备。
结束阶段
产物检测
通过电泳、荧光检测等方法，对PCR 产物进行检测和分析，以确定扩增是否成功。
PCR产物的应用
根据实际需求，将PCR产物用于后续的分子生物学实验，如基因克隆、测序、突变分析等。
03 pcr扩增的应用
03
DNA聚合酶具有热稳定性，能够在高温下保持活性，这对于PCR过程中的温度循环是必要的。
温度变化对扩增的影响
在PCR过程中，温度循环是一个关键步骤，它决定了扩增的特异性和效率。
在温度循环中，精确控制每个阶段的温度和时间对于确保PCR扩增的准确性和特异性至关重要。
最后再次升温至72℃，使DNA聚合酶催化合成新的DNA链。
转基因食品检测
PCR技术可以用于转基因食品的检测，通过扩增特定的DNA片段，可以检测食品中的转基因成分，保障食品安全。
04 pcr扩增的优缺点
优点
高灵敏度
特异性
PCR技术具有极高的灵敏度，能够检测出极微量的DNA，使得疾病的早期诊断和病毒的微量检测成为可能。
通过设计特异的引物，PCR技术能够特异性地扩增目标DNA片段，避免非特异性扩增，提高检测的准确性。
广泛应用
荧光定量pcr技术广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
在遗传疾病诊断中的应用
遗传疾病诊断
PCR技术可以用于检测和诊断遗传疾病，通过扩增特定的DNA片段，可以检测基因突变和遗传变异，从而对遗传性疾病进行早期诊断和预防。
基因分型

PCR技术ppt课件

组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念：通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤：（1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA

《PCR扩增技术》课件

新技术与新方法
4
定性。
随着科学的进步，PCR技术将与其他技术相结合，产生更多的创新和突破。
PCR扩增技术的优势和局限
1 优势
PCR技术快速、灵敏，可以扩增微量DNA，对样本要求低，适用于各种类型的DNA。
2 局限
PCR技术受到DNA质量、引物设计和反应条件等因素的影响，可能引入偏倚和错误。
参考文献
1. Mullis, K. B. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American, 262(4), 56-65.
2. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., & Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732), 1350-1354.
《PCR扩增技术》PPT课件
欢迎来到《PCR扩增技术》PPT课件，本课程将带你深入了解聚合酶链式反应 (PCR)的原理、应用和前景。快速、精确、高效、灵敏的PCR技术正引领着分子生物学研究的潮流。
什么是PCR扩增技术
PCR：聚合酶链式反应，通过体外复制DNA片段，为现代生命科学研究和应用提供了强大的工具。快速、高效的PCR技术在基因诊断、基因重组、基因测序、基因治疗等领域取得了巨大的突破。

PCR扩增技术ppt课件

.
PCR仪
凝胶成像系统
.
三. 实验方法
１．向无菌的200μl Eppendorf管中依次加入以下溶液
反应物
体积
10×buffer
2.5μl *5 12.5
4×dNTP(1mM) 2.5μl *5 12.5
无菌水
18μl *5
90
Taq酶 (1U/l)
0.5μl *5
2.5
混合，吸取24.5μl
引物上
0.5μl *5
2.5
引物下
0.5μl *5
2.5
模板ＤＮＡ (20ng) 0.5μl
总体积
25μl
.
2. 反应体系混匀，离心 3. 在ＰＣＲ仪上按以下方式循环
９4℃变性 5分钟９4℃变性 45秒 30个循环 55℃退火 45秒 72℃延伸 1分钟７２℃延伸反应10分钟。 4. 取5μl反应液加4μl Loading buffer在１.５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 5. 在凝胶成像系统上观察记录实验结果
ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；② 退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。
.
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环30 次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：

PCR扩增的原理和操作步骤

PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。

PCR基本原理: 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。

反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。

1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。

故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。

对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。

PCR扩增原理和操作步骤

PCR扩增的原理和操作步骤[资料] PCR扩增反应的操作第一节 PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的2+DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg等。

反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态;然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火;再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’?3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

因此PCR循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见图)。

1(模板DNA的变性模板DNA加热到90~95?时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变G-C间由三个性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

变性温度与DNA中G-C含量有关，氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。

故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。

对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO)，并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97?，时间适当延长，即所谓的热启动。

实验五PCR扩增PPT课件

仪器误差
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关重要，应选择性能稳定、精度高的仪器，并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检测方向发展，能够同时检测多个基因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验器材灭菌处理，实验试剂储存得当，避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染，按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中，按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。

PCR技术PPT课件

一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
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28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):

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学习交流PPT
11
• 2.循环次数是否越多越好？为何？
• 很明显不是的，任何事都要有一个度。
• 一般循环在25到30次之间尔后循环数的进一步增加并不意味着产物的数量一定增加这是由于PCR扩增过程中后期会出现平台效应，这时期产物的积累按减弱的指数速率增长这时一些不利因素也会产生：如底物和引物浓度降低、dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低、产生的焦磷酸会产生末端产物抑制作用、非特异性产物或引物的二聚体会产生非特异性竞争、扩增产物的自身复性、高浓度扩增产物变性不彻底
(1)Taq DNA聚合酶
是目前实验室PCR中应用最多的酶。具有5’到3’合成活性和5’ 到3’外切酶活性，但无3’到5’外切酶活性。在95度的半衰期为40分钟。由于没有3’到5’外切酶活性，在扩增中有 8.9×10-5~~1.1×10-4的错配率。
学习交流PPT
9
• （2）TthDNA聚合酶
来自嗜热热细菌HB8在74度下进行扩增Mg+存在条件下，以DNA为模板合成DNA，Mncl2存在下可以RNA 为模板合成cDNA。
4、DNA聚合酶
PCR反应中使用的DNA聚合酶是耐高温的，在90度以上的高温下仍能有活性。也正是高温DNA聚合酶的应用才使得PCR 技术得以推广。选择聚合酶要从实验的具体要求考虑，高保真的酶成本较高，只有要求严格时选用。
学习交流PPT
8
Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少 3‘到5’外切核酸酶（校正）活性，但是产量高，是目前实验室应用最多的酶。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA 聚合酶低。
学习交流PPT
4
Tm (melting temperature)：50%DNA分子变性时温度称为熔解温度/解链温度。
一般生理条件下，Tm在85℃ -95℃之间。影响 Tm值的因素：
（G+C）含量增加，Tm值增高
溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形成增多）；
甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间的氢键不稳定，可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而失活）；
1
第一节 PCR技术原理和工作方式
• 一、PCR的基本原理 • 1、基本要素和扩增原理 • DNA的复制是生命活动中最基本的过程之一，PCR
的基本原理离不开DNA复制的基本规律。在PCR过程中模板可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增出来的是双链状态的。其中引物是DNA复制中不可缺少的。
2、脱氧三磷酸核苷（dNTP）
脱氧三磷酸核苷是DNA合成的底物，高浓度dNTP易产生错误掺入；但浓度过低，将降低反应产物的产量。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。
PCR中常用终浓度为200μM的dNTP
若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温度范围内.
学习交流PPT
5
二、PCR反应体系
PCR反应需要在一定的条件下才能完成，只有这些条件协调作用时才能达到很好的效果。 1、缓冲液 2、脱氧三磷酸核苷（dNTP） 3、引物 4、模板 5、DNA聚合酶
学习交流PPT
6
1、缓冲液：
缓冲液除了提供pH缓冲能力外，还有一些辅助反应进行的成分，主要是Mg2+。 Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率，直接影响扩增的成败，最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
• （3）VentDNA聚合酶
• （4）pwoDNA聚合酶
是使用较多具有3’到5’外切酶活性且具有高保真度的PCR酶
• （5）pfuDNA聚合酶
是目前使用最广范具有3’到5’外切酶活性的PCR 酶商用混合酶Βιβλιοθήκη 学习交流PPT10
学习本节课我们应该掌握以下问题
• 1.简述PCR反应的工作原理。
• 是在模板DNA、引物和dNTP的存在下依赖于DNA 聚合酶的酶促反应。由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；
PCR技术及应用
PCR技术是模拟体内DNA复制的的方式，在体外选择性的将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。其过程与普通DNA复制一样有三个步骤，首先是模板DNA变性，由双链状态变成单链状态;然后引物与模板结合，完成复制过程；最后在DNA聚合
酶和底物存在情况下合成与模板互补的DNA。
学习交流PPT
学习交流PPT
7
3、模板
模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是 PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，一般要有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应避免混有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影响扩增的效果，一般要求含量合适，3ⅹ105分子数（1μg）（提高产量，减少非特异性扩增）；
学习交流PPT
3
• 2、PCR扩增的步骤
首先将模板DNA置于92~96度进行变性处理，使双链DNA在高温下解链成为单链DNA此时的温度称为解链温度Tm，且热变性不改变其化学性质；染后退火，将温度降至37~72度，使引物与模板的互补区结合，最后在72度条件下，DNA聚合酶将 dNTP连续加到引物的3’羟基端合成DNA这个步骤称为延伸。这三个热反应过程的重复性称为一个循环经过20~40个循环可扩增得到大量位于两条引物序列之间的DNA片段。
学习交流PPT
2
• 与单纯的DNA复制不同的是，PCR扩增总是在两个引物的存在下对DNA的两条链同时进行复制，复制的结果得到一条双链DNA。通过仪器的自动控制，使这样的DNA复制重复进行，从而得到大量的位于两个引物之间的DNA片段，即目的片段。前一轮扩增得到的DNA产物可做下一轮扩增的模板，扩增产物以几何级别递增。