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油镜的使用和细菌的简单染色一、实验目的1、掌握油镜的使用方法2、掌握简单染色的原理及方法3、学习并掌握无菌操作技术二、实验原理⑴、油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。
所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。
但是，任何一项技术都不是完美无缺的。
染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。
⑵、染色剂和染色原理微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。
物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。
化学因素如：正负离子之间的相互吸引等。
染色剂染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。
2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。
3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。
4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
三、实验材料器材：显微镜、擦镜纸、吸水纸、载波片、盖玻片、接种环、酒精灯、废液缸、洗瓶等。
实验一油镜的使用、革兰染色及特殊结构的观察细菌个体微小，必须借助显微镜来观察其形态结构。
但是活细菌为无色半透明状态，在普通光学显微镜下不易观察清楚，常用染色的方法使细菌着色，使之与背景形成鲜明对比，再在显微镜下观察，可清晰的看到细菌的形态、大小、排列和某些特殊结构。
观察细菌的形态与结构是进行细菌鉴别的方法之一。
目的和要求：1、熟悉显微镜油镜的使用方法。
2、学习使用显微镜油镜观察细菌的特殊结构3、学习革兰染色法实验材料：标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。
实验原理：使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。
这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。
如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。
实验方法及注意事项：1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。
2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。
染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。
3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。
4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。
5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。
若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
显微镜油镜的使用方法
显微镜油镜是在显微镜观察透明样品时使用的一种特殊镜片，它能够提高显微镜的分辨率和清晰度。
正确使用显微镜油镜可以帮助用户获得更加精确的观察结果，下面将介绍显微镜油镜的正确使用方法。
首先，使用显微镜油镜之前，需要确保透明样品已经被放置在显微镜的载物台上，并且被调节至所需的放大倍数。
在确认样品已经准备就绪之后，可以开始使用显微镜油镜。
接下来，取出显微镜油镜并轻轻地滴一滴显微镜油在样品上。
显微镜油应该被滴在样品的中心位置，以确保油滴能够均匀地覆盖整个样品表面。
在滴油的过程中，需要小心操作，避免油滴过多或者滴到错误的位置。
然后，将显微镜油镜缓慢地放置在样品上。
在放置的过程中，需要注意避免产生气泡或者油滴移动。
正确的放置方法是先将显微镜油镜的一侧轻轻地放在样品上，然后慢慢地放下另一侧，直到整个显微镜油镜完全覆盖样品表面。
在使用显微镜油镜观察样品时，需要注意以下几点，首先，使
用油镜时要避免触碰样品表面，以免污染样品或者造成油滴移动。
其次，观察时要尽量保持显微镜油镜与样品表面的接触，以确保观
察结果的清晰度。
最后，在观察结束后，需要及时清洁显微镜油镜，以便下次使用。
总的来说，正确使用显微镜油镜可以帮助用户获得更加精确的
观察结果。
在使用过程中，需要小心操作，避免产生气泡或者油滴
移动，同时要注意保持显微镜油镜与样品表面的接触。
希望以上方
法能够帮助您更好地使用显微镜油镜，获得准确的观察结果。
微生物学实验报告(格式标准)(生命科学专业)教师:黎勇目录索引实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测与分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科实验日期: 指导教师:黎勇实验一油镜的使用与细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1、 N·A=n·sinα2、 D=λ/2N、A3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。
4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕:(一) 油镜的使用镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。
(二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察(三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。
光学显微镜的使用简单染色及革兰氏染色摘要显微镜的使用在我们学习微生物等课程中非常重要，历史上显微镜的创造和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的开展；给人类的生活带来了空前的拓展。
在提倡科技创新的今天，显微镜的使用已经成为我们的一项根本技能。
本次试验的主要目的是通过用油镜观察经过复染色的细菌玻片，分辨细菌的革兰氏阴阳性。
通过实验学习光学显微镜油镜的使用原理与方法、细菌的革兰氏染色法及分类鉴定的原理。
为了研究细菌的形态，微生物学家创造了对细菌的染色，用两种以上的称复染，革兰氏创造了复染色法；先后用两种染色剂和媒染剂、脱色剂组合，由此而命名为革兰氏染色。
革兰氏染色不仅可以观察细菌的形态，同时将细菌分为两大类。
一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。
由于细菌的构造上的差异，形成了不同的染色效果。
了解染色性能有助于临床用药和细菌的鉴定。
关键词显微镜的使用〔Use of Microscope〕革兰氏染色〔Gram stain〕复染〔counterstain〕媒染〔mordant dyeing〕脱色〔discoloration〕一、实验目的1、了解显微镜的构造及使用2、学习显微镜〔特别是白色圈标记的油镜〕的使用方法3、学习并掌握微生物制片及简单染色的根本技术4、初步了解不同细菌的形态特征5、了解革兰氏染色原理，并掌握其方法二、实验原理〔一〕、普通显微镜的根本原理1、根本原理显微镜的放大效能〔分辨率〕是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比拟窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率〔1.52〕相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
普通光学显微镜的油镜使用方法普通光学显微镜的油镜使用方法1. 介绍普通光学显微镜的油镜是一种常用于生物学和医学领域的镜头，通过使用油镜可以提高显微镜的分辨率和清晰度，使得微小细节更加清晰可见。
2. 准备工作在使用普通光学显微镜的油镜之前，需要准备以下材料： - 普通光学显微镜 - 干净的载玻片 - 油镜 - 镊子 - 实验用物品（如细胞标本或组织切片）3. 步骤下面是使用普通光学显微镜的油镜的步骤：准备载玻片1.使用镊子将细胞标本或组织切片放在干净的载玻片上。
应用油镜1.将一滴油镜滴在待观察的标本上。
2.将载玻片放置在显微镜的物镜下，确保油镜与镜片紧密接触。
调试显微镜1.用目镜对焦实现清晰的目视观察。
2.依次转动物镜旋钮，调整显微镜的放大倍数，直到获得所需的放大倍数。
3.使用调焦旋钮来调整焦距，使图像变得清晰。
观察标本1.通过目镜观察载玻片上的标本区域。
2.可以调整光源的亮度和孔径来获得更好的视觉效果。
4. 注意事项在使用普通光学显微镜的油镜时，需要注意以下事项：•油镜应该与载玻片紧密接触，以免空气造成折射使得图像模糊。
•使用镊子小心操作，以避免损坏标本或载玻片。
•在观察完毕后，应及时将显微镜和油镜清洁干净，以备下次使用。
5. 结论通过使用普通光学显微镜的油镜，我们可以获得更高的分辨率和清晰度，进一步观察和研究微小细节。
正确的操作方法和注意事项能够确保获得准确和高质量的实验结果。
6. 其他常见问题和解决方法问题1：油镜与载玻片没有紧密接触导致图像模糊。
解决方法：调整载玻片位置，确保油镜与载玻片紧密接触，避免空气产生折射。
问题2：图像太暗或太亮。
解决方法：调整显微镜的光源亮度，找到合适的亮度。
调整孔径来调节光的进入量。
问题3：标本移动或失焦。
解决方法：使用调焦旋钮来调整焦距，使图像变得清晰。
固定载玻片，并保持稳定。
7. 结语掌握普通光学显微镜的油镜使用方法可以提高显微镜观察能力，进一步了解微观世界的细节。
实验一油镜的使用、简单染色法
一、实验目的
1、复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
2、掌握细菌简单染色及无菌操作技术。
二、实验原理
（一）普通光学显微镜的构造
普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、
镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
（二）油浸系的原理
浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。
油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95x、100x等。
其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”（Oil Immersion）或HI （homogeneous Immersion）表示。
而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。
其使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽
可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）。
图介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较
（三）细菌简单染色
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
三、实验用品
香柏油、二甲苯、擦镜纸、吕氏碱性美蓝染色液、石炭酸复红染色液、生理盐水、显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylocosccus aureus）的斜面菌种、滴管、烧杯、试管架。
四、实验内容与方法
（一）光学显微镜的使用
调节光源→低倍镜观察→高倍镜观察→油镜观察
1、观察前的准备
①将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。
坐正，练习用左眼观察。
②调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。
转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。
观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。
2、低倍镜观察染色装片
首先上升镜简，将大肠杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
3、高倍镜观察
眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。
再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部位移至视野中心，不要移动装片位置，准备用油镜观察。
4、油镜观察
①提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜部检位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。
②从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
③将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。
如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。
④再次观察提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。
重复观察时可比第一次少加香柏油。
5、镜检完毕后的工作
①移开物镜镜头，取出装片。
②清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。
擦镜头时要顺着镜头直径方向擦，不能沿圆周方向擦。
③擦净显微镜，将各部分还原。
将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。
最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。
* 注意事项：
（1）使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察
（2）下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。
（3）使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。
（4）注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。
（二）简单染色法
1、涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
* 无菌操作要点：
（1）无菌操作的试管或三角瓶在开塞后及回塞前，其口部应通过火焰2-3次，以烧去可能附着于管口或瓶口的微生物。
开塞后的管口及瓶口应尽量靠近火焰，平放，切忌口部向上及长时间暴露于空气中，以防污染。
（2）接种环（或针）每次使用前后，均应在火焰上彻底灼烧灭菌。
挑菌前，必须待接种环（或针）冷却后才能使用。
2、干燥：将涂片于室温中自然干燥。
3、固定：手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。
在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。
不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。
4、染色：将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。
5、水洗：倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。
6、干燥：自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体。
7、镜检：待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。
* 注意事项：
（1）涂片时，无菌水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀。
（2）水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。
五、思考题
1、用油镜便于观察细菌的依据是什么？
2、在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？
3、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？。
