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色谱基础知识1.名词狭义：色谱—1903俄国科学家茨维特提出，色谱就是色带。
广义：色谱系统—采用固定相和流动相分离混合物的系统。
载气－气体流动相carrier gas担体－色谱柱中的固定相，可以是颗粒物质，毛细管的管壁也可以起到担体的作用。
支持固定液or分离作用。
DEGS，硅藻土、固定液－涂布在担体表面的高沸点有机物。
OV225并不是每个色谱柱都需要担体和（或）固定液。
柱容量：色谱柱能一次有效分离的物质最大量。
决定了进入色谱柱的样品量。
内因由物质的种类决定，外因主要由色谱柱横断面上分离作用组分的量决定。
脉冲式进样器：分流装置：保留时间：（Rt reserve time）物质在色谱柱中的停留时间。
影响因素：一是固定液或者担体与被分析的物质之间作用力；二是色谱条件，包括使用的温度、载气种类及流速、升温方式（程序升温或者恒温条件）；Porapak Q2m,N2,30ml/min,110℃,140℃。
2.色谱分类固定相：纸色谱，薄层色谱，柱色谱，流动相：液相色谱liquid chromatograph（离子色谱），气相色谱gas chromatograph，电色谱，磁色谱，超临界流体色谱气固色谱－气体流动相和固定相（担体）组成的色谱系统gas solid chromatograph，GSC，担体的极性决定色谱柱的极性。
吸附色谱气液色谱－气体流动相、（担体和）固定液组成的色谱系统gas liquid chromatograph，GLC，固定液的极性决定色谱柱的极性。
分配色谱超临界流体色谱－介于气相色谱和液相色谱之间的一种色谱。
电色谱－毛细管电泳，凝胶电泳磁色谱－有待开发3.几种色谱柱径流效应：分离度：两种物质被分离开的程度。
分子结构相似度（内因），色谱条件（外因）：柱种类，温度，气体，柱长毛细管色谱柱－内径很小的色谱柱（一般在0.20mm，0.25mm，0.32mm，0.52mm左右），对上样操作要求比较高；把固定液直接涂布在色谱柱的（内）管壁上，固定液（se30）厚度一般在微米（0.25µm）数量级。
有关色谱图得概念图5-11给出了色谱图示意图,有关术语列于表5-1-1()。
2、有关保留值得术语色谱最常用得保留值就是保留时间。
在填充柱GC中,特别就是测定物化参数时,常用保留体积得概念。
表5-1-2列出了各种保留值得定义(参见图5-1-1)。
表5-1-2 有关保留值得术语()表5-1-2涉及到一个压力校正因子j。
因为色谱柱中各处得压力不同,故载气体积流量也不同,j就就是用来校正色谱柱中压力梯度得,其定义为式中,pi为柱入口处压力,即柱前压;po为柱出口压力,一般情况下(除使用MS外)为大气压力。
还有一个载气流速得问题。
通常用皂膜流量计测得得就是检测器或柱出口处得温度与压力条件下得载气体积流量F0,扣除水得蒸气压,并经温度校正后,就得到柱出口处得实际载气流量F∞:Fe为色谱柱中载气得平均流速。
由于气体就是可压缩得,虽然单位时间通过色谱柱中任一横截面得载气质量就是不变得,但由于柱中各处载气压力不同,密度不同,故体积流速也不同。
为求得色谱柱中载气得平均流速,还需对F∞进行压力校正:毛细管气相色谱中更多采用得就是载气平均线性流速u。
当Fe不变时,载气通过色谱柱得线速度随柱内径不同而不同。
为此采用载气线性流速(简称线流速)’ 来描述载气在色谱柱中得前进速度。
3、有关分离得参数(1)相对保留值αα又叫选择性或选择性因子。
即在一定得分离条件下,保留时间大得组分B与保留时间小得组分A 得调整保留值之比:这就是一个很常用得色谱参数。
当固定相与流动相一定时,一对物质得α可以认为只就是温度得函数,故α常用于色谱峰得定性,在动力学分离理论中,α用来描述一对物质得分离程度优劣。
(2)分配系数K 其定义为在平衡状态时,某一组分在固定液(CL)与流动相(CC)中得浓度之比:(3)容量因子k 也叫分配比或分配容量。
它定义为平衡状态时,组分在固定相与流动相中得质量之比:(4)分离度R 表示相邻两个色谱峰分离程度得优劣,其定义为(参见图5-1-1):当两峰得峰高相差不大,且峰形接近时,可认为WA=WB,这时R=△tR/W。
色谱学堂知识点总结图一、色谱分析的基本原理1. 色谱基本原理色谱是通过样品和固定相之间的相互作用来进行分离的一种方法。
在色谱中，样品首先与移动相（气相或液相）一起通过色谱柱，其中移动相被固定相吸附或分配，从而实现了分离。
通过控制固定相和移动相的性质，可以实现对不同成分的选择性分离。
2. 色谱柱选择色谱柱是色谱分析中的重要组成部分，不同的色谱柱具有不同的分离机制和适用范围。
常见的色谱柱类型包括气相色谱柱、液相色谱柱和超高效液相色谱柱。
选择合适的色谱柱对于获得良好的分离效果非常重要。
3. 色谱分离机理色谱分离是通过样品成分与固定相之间的相互作用来实现的。
常见的色谱分离机理包括吸附色谱、分配色谱和离子交换色谱。
不同的分离机理适用于不同类型的样品和分析需求。
二、色谱技术1. 气相色谱技术气相色谱是一种常用的色谱分析技术，它适用于易挥发性和热稳定的样品。
在气相色谱中，样品首先以气体状态注入色谱柱，然后通过气相载气移动，最终被固定相吸附或分配，从而实现分离。
2. 液相色谱技术液相色谱是一种应用广泛的色谱分析技术，它适用于非挥发性和热敏感的样品。
在液相色谱中，样品首先以溶液状态注入色谱柱，然后通过液相流动，最终被固定相吸附或分配，从而实现分离。
3. 超高效液相色谱技术超高效液相色谱是一种高效的色谱分析技术，它利用超高压将样品溶液通过色谱柱，从而实现快速、高分辨率的分离。
4. 色谱联用技术色谱联用是指将色谱分离技术与其他分析技术（如质谱、光谱等）结合起来，从而进行更为全面和准确的分析。
常见的色谱联用技术包括气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、气相色谱-光谱联用等。
三、色谱分析方法1. 样品前处理样品前处理是色谱分析中的重要步骤，它包括样品的提取、浓缩、净化等过程，旨在提高分析的灵敏度和准确性。
2. 色谱条件优化色谱条件的优化对于获得良好的分离效果非常重要。
包括固定相的选择、移动相的配比和流速、色谱柱温度等因素的优化。
色谱基础知识
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第一部分色谱基础知识
1、色谱起源
2、色谱定义
色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术
流动相：携带样品流过整个系统的流体
固定相：静止不动的一相，色谱柱
3、色谱分类
1、高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
2、气相色谱 Gas Chromatography (GC)
3、薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC)
4、毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE)
4、色谱优点
1、同时分析
2、分离性能好
3、灵敏度高 (ppm-ppb)
4、进样量小 (1-100uL)
HPLC vs GC
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法
1、适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析
2、流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
1、适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析
2、流动相只起运载样品分子的能力
5、HPLC分类
1、正相模式 (NP-LC)
2、反相模式 (RP-LC)
3、反相离子对色谱 (IPC)
4、离子交换色谱 (IEC)
5、尺寸排阻色谱 (GPC / GFC)
反相模式 (RP)
填料：C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基
相互作用力：
反相模式下流动相的选择：
优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要（甲醇，乙腈和THF 是常用的有机溶剂）
在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和pH值非常重要
增加流动相极性：
固定相极性变化对分离的影响：
固定相极性变化对分离的影响：
离子对色谱
离子对试剂
·阴离子化合物：氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵
·阳离子化合物：丁烷基磺酸钠(C4)、戊烷基磺酸钠(C5)、己烷基磺酸钠(C6）、庚烷基磺酸钠(C7)、辛烷基磺酸钠(C8)、癸烷基磺酸钠(C10)、十二烷基磺酸钠(SDS)
离子对色谱影响因素
·离子对试剂的类型
·离子对试剂的浓度
·流动相的pH
正相色谱
色谱柱：
·硅胶柱:常用
·氰基柱: 常用
·氨基柱: 分析糖
·二醇基柱: 分析蛋白质
相互作用力
氢键力
·如果样品有
–-COOH: 羧基
–-NH2: 氨基
–-OH: 羟基
则氢键力强.
·如果样品没有任何官能团，象碳水化合物
·如果样品有大的基团, 由于空间障碍
则氢键力弱.
正相模式下流动相的选择：
·主要试剂：烷烃(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烃(苯, 甲苯, 二甲
苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳
·辅助试剂：甲基-t-丁基醚(MTBE)、乙醚、四氢呋喃(THF)、二氧杂环乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。
增加流动相极性：
反相色谱与正相色谱的对比：
反相：保留时间重复性好、固定相耐用
正相：对立体异构体有很好的分离(Vitamin E等)、保留时间重复性稍差
离子交换色谱：
离子交换色谱应用：
生物领域(蛋白质, 农药, 氨基酸分析)
离子分析
阳离子交换剂：强阳离子交换剂(SCX)(R-SO3-)
弱阳离子交换剂(WCX) (R-COO-)
阴离子交换剂：强阴离子交换剂(SAX) (R4N+)
弱阴离子交换剂(WAX)(DEAE)
尺寸排阻色谱法（SEC）
第二部分柱子基本性能参数
1、表征色谱柱的参数
硅胶纯度：填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度。
色谱柱尺寸：填料床的长度和内径。
颗粒形状：球型或不规则型。
粒径：平均颗粒直径,通常3-10μm。
表面积：颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示。
孔径：颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å。
碳百分率：与基体物质相连的键合相的量。
封尾：用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来。
2、表征色谱柱性能的参数
（1）容量因子, k'
（2）理论塔板数, N
（3）分离度, Resolution
完全分离时的分离度
（4）拖尾因子，T
第三部分 HPLC硬件基础知识
1、液相色谱简易流程图
2、流动相的选择
（1）采用“HPLC”级溶剂
（2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂
（3）对试样有适宜的溶解度
（4）溶剂粘度要小
（5）与检测器相匹配
水的等级
HPLC用水可以通过以下几个方法得到：
（1）专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过0.22μm的滤膜，除去热源、有机物、无机离子等。
（2）去离子水重蒸；
（3）二次或三次重蒸水；
不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水。
有机溶剂的等级
应选用HPLC级的有机溶剂。
缓冲盐
选择缓冲液的步骤：
1、确定最佳分离状态时的流动相pH
2、选择具有与流动相pH相近的pKa的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）
3、确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）
缓冲液的使用：
（1）使用前必须过滤。
（2）使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min。
（3）用纯水冲洗泵头清洗管路。
（4）易受到细菌和霉菌的影响。
流动相的更换
不互溶的流动相不能直接更换，缓冲盐不能直接用有机溶剂更换
溶剂的黏度
（1）乙腈黏度低在相同流速时有较低的柱压。
（2）当和水混合时黏度有变化柱压也相应有变化。
溶剂前处理
过滤
过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。
脱气
脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡
气泡对测定的影响：
（1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积
（2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
（3）检测器中的气泡产生基线波动
脱气方法：
1、超声脱气
2、减压脱气
3、在线脱气
3、样品前处理
（1）使用流动相溶解样品
--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要
--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中，
尤其在柱中产生沉淀
（2）进样前最好使用0.45um 的滤膜进行过滤，
如果样品很脏，要使用0.22um的滤膜进行过滤。
（3）对于含有复杂基质的样品，最好前处理后再进样。
4、进样
（1）进样器
·自动进样器
·手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入
（2）手动进样器的原理图
·部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20μl的定量环最多进样10μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同。
·全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。
5、洗脱
（1）等度洗脱
（2）梯度洗脱
使用梯度洗脱的原因：
梯度洗脱要点：
梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度
注意事项：
（1）溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差。
（2）梯度混合的溶剂互溶性要好。
（3）梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如
紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变
化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。
（4）查看空白实验的数据。
（5）遵守分析周期（最初的分析数据不采用）。
6、色谱柱的类型及适用范围
7、分析柱的维护
1、在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 ml/min)冲洗30 min，长时间未用的分析柱也要同样处理。
2、定期使用强溶剂冲洗柱子。
3、使用缓冲盐时，要先用含5%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。
4、净化样品。
5、分离条件。
6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸。
8、常用检测器
（1）紫外检测器（包括二极管阵列检测器）
（2）荧光检测器
（3）示差折光检测器
（4）电导检测器
（5）蒸发光散射检测器
（6）质谱检测器。
