植物组织培养常用激素溶解方法

培养基母液配制中的若干关键环节培养基母液,也叫浓缩贮备液.它是以培养基配方配制成的高倍的浓缩液,不同组分母液,它的浓缩倍数不同,一般最低为10倍,高的有50倍、100倍、200倍,甚至1000倍.母液是一个方法比较简便、用量比较准确且被广泛采用的配制方法.本文就如何掌握培养基母液配制的操作要领作一阐述,以供参考.以MS培养基为例,其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类.(见表1)1 大量元素和微量元素母液的配制按规定用量,称取所需的各种药品,在配制时为减少工作量,可以把几种药品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（见表1）.但由于各种药品的混合,可能发生反应,生成沉淀物,以致母液失效.为避免类似现象发生,在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时,可采用如下2种做法加以解决：①将要配在同一母液的大量元素、微量元素和维生素及氨基酸等化合物,按“表1”所列药品的先后顺序溶解药品,待前一种药品完全溶解后再加入后一种化学药品,以此类推；②使每种成份分别完全溶解,再把它们彼此混合.2 铁盐母液的配制铁盐的成份含硫酸亚铁（F eSO4·7H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）.这两种化合物的溶解和混合较为严格,必须按如下方法配制,否则将会产生沉淀.该方法是：分别溶解FeSO4·7H2O和 Na2-EDTA,加热并不断搅拌,使之完全溶解,冷却,将2种溶液混合,调PH 至5.5,用蒸溜水加至所需容积,棕色瓶保存于冰箱之中.3 植物生长调节物质母液的配制植物生长调节物质是培养基的重要组分之一,一般是植物激素类物质,如生长素类的IAA、IBA、NAA,赤霉素类的GA3,细胞分裂素类的2,4-D、KT和6-BA等.由于大多数生长调节物质难溶于水,因此配制方法也各不相同：①IAA,IBA和GA3先用少量95%酒精溶解,再加水定容,摇匀后贮于试剂瓶中、贴上标签后,存放在冰箱中；②NAA可用热水或少量95%酒精溶解,再加水定容至所需容积；③2,4-D可溶于少许0.1mol·L-1的NaOH溶液中,然后加水定容；④KT和6-BA可用少量0.1mol·L-1的HCl溶解,再加水定容；⑤玉米素先溶于少量95%酒精中,然后加水定容.植物生长调节物质浓度通常用ppm（mg·ml-1）和mol·L-1表示,在配制母液时,常以ppm较为方便,一般配制成0.5ppm的母液,这个浓度既便于计算,也可避免冷藏时形成结晶.4 有机附加物母液的配制在植物组织培养时,培养基中往往要加入一些有机附加物,如椰子汁,以促进组织培养活性.由于椰子汁的活性成分是耐热的,在配制时,要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质,过滤,然后置塑料瓶中贮存于的-20℃的低温冰箱内.MS培养基配制中的五点注意1 母液配制必须严格分类配制高浓度的母液是植物组织培养的基本功。

常用激素溶解方法
1、吲哚乙酸（IAA)：溶于乙醇、热水、碱性溶液，碱性溶液中稳定；一般使用95%酒精、NaOH溶液溶解；
2、吲哚丁酸(IBA)：溶于乙醇、热水、碱性溶液，碱性溶液中稳定；一般使用95%酒精、NaOH溶液溶解；
3、萘乙酸（NAA）：溶于乙醇、碱性溶液；一般使用95%酒精或NaOH溶液溶解；
4、玉米素（ZT)：溶于乙醇或碱性溶液；一般使用95%酒精或NaOH溶液溶解
5、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）：溶于碱性溶液或酸性溶液；一般使用0.1molHCl或NaOH溶液溶解；
6、赤霉素（GA3）：溶于乙醇，使用95%酒精溶解
备注：生长素一般使用95%乙醇或NaOH 溶解；
分裂素一般使用NaOH溶液、95%乙醇或稀HCl溶解；。

公布时间 :[2012-08-16]点击率(164)跟着生物技术普及，植物组培技术，又称植物克隆技术，在农业生产上获取了宽泛应用，愈来愈多的客户也正计划涉及此领域，但对植物组培又不是很认识，对各种药品试剂的配制感觉很难掌握，为此，下边以 MS 培育基为例，对组培上使用的常用化学药剂特色及配制方法做些介绍：一大批元素类(1)硝酸铵：亦称硝铵。

化学式为NH4NO3，式量为80.048，其纯品为无色透明菱形结晶，比重1.73，易溶于水，并汲取大批的热，在空气中简单潮解。

水溶液呈中性反应。

因为硝酸铵是一种易燃、易爆物，所以在使用中应当储存在阴冷之处。

已经结块的硝酸铵切忌敲打、撞击，可用水进行溶解。

(2)硝酸钾：亦称火硝。

化学式为KNO3，式量为101.104，其纯品为无色透明的棱柱结晶，比重2.10，易溶于水，几乎不溶于无水乙醇。

(3)氯化钙：亦称无水氯化钙。

化学式为CaCl2，式量为110.99，其纯品为白色结晶，比重2.15，在空气中具强吸湿性，易溶于水同时放出大批的热。

(4)硫酸镁：亦称泻盐。

化学式为MgSO4?7H2O，式量为246.50，其纯品为透明菱形结晶，比重1.68，具苦味，易溶于水，不溶于乙醇，在空气中稍风化。

(5)磷酸二氢钾：亦称磷酸钾复合肥。

化学式为KH2PO4，式量为136.09，其纯品为正方形无色结晶，比重2.33，有较强的酸味，易溶于水，不溶于乙醇。

溶液呈微酸性反响。

磷酸二氢钾在 96℃时会熔解成透明的液体，这样就会转变为偏磷酸钾，所以在使用时注意不要使它经受高温环境。

二微量元素类(6)碘化钾：化学式为 KI，式量为166.02，其纯品为透明的小块结晶，比重3.115，在干燥的空气中稳固，易溶于水，其水溶液在遇光后因析出游离碘而渐渐变黄。

(7)硼酸：亦称正硼酸。

化学式为H3BO3，式量为61.84，其纯品为六角形白色鳞片状结晶，具珠光，比重1.46，溶于水，易溶于乙醇，当加热至 107℃时会失掉部分的水，而转变为偏硼酸。

拟南芥植物组织培养 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】拟南芥组织培养一、种子消毒：方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。

方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。

消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。

方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接种。

二、选用的培养基选用1/2MS培养基对种子进行培养。

（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。

糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。

如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。

）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。

（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。

MS培养基配料表：三：接种方法拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。

（如不行，可适当添加琼脂）。

四、培养得无菌苗接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。

3天后即可取材用于器官离体再生实验。

萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。

植物组织培养期末复习题一、填空题（每空分）1. 植物组织培养按培养对象分为__组织培养__、_器官培养_、_胚胎培养_、__细胞培养_、_原生质体培养__等几种类型.2. 在分离原生质体的酶溶液内，需要加入一定量的Cacl2·2H2O 和葡聚糖硫酸钾_其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂.3. 1902年德国植物生理学家Haberlandt第一次提出植物__细胞具有全能性_____的理论概念；1943年White提出植物细胞“____全能性_____”学说，并出版了《植物组织培养手册》，从而使植物组织培养成为一门新兴的学科。

4. 用烘箱迅速干燥洗净后的玻璃器皿时温度可以设在_80_℃的温度范围内，而若用它高温干燥灭菌则需在__150__℃的温度下1-3小时；烘干植物材料的温度是_60_℃.5. 细胞全能性是指植物的每个细胞都具有该植物的__全部遗传信息__和___形成完整植株的潜在__的能力。

6. 1962年，Murashige和Skoog为培养烟草花叶细胞设计了__MS_培养基，其特点是_无机盐_浓度较高，且为较稳定的__________。

7. 7.6-BA / NAA的高低决定了外植体的发育方向，比值低时促进_根_的生长，这时_脱分化_占主导地位；比值高促进_芽_的生长，这时_分化占主导地位.9. 组织培养的特点是：__无菌_、__人工控制_、_离体_.10. 1962年印度Guha等人成功地培养毛叶曼陀罗花药获得__单倍体植株_，这促进了花药和花粉培养的研究。

11. 在组织培养中，不耐热的物质用__过滤__法灭菌，而培养基常用___湿热灭菌__法灭菌.13. 在组织培养中，非洲菊是靠_从生芽的方式进行繁殖的，而蝴蝶兰是以__原球茎_ 的方式进行快繁的。

15. 在通过微茎尖培养脱毒时，外植体的大小应以成苗率和脱毒率综合确定，一般以、带__1-2__个叶原基为好。

16. 原生质体的分离有_机械法_和__酶解法_两种方法.17. 进行植物组织培养最基本的前提条件是__离体_。

植物的五大生长激素：一.吲哚乙酸（IAA）的生理作用：生长素的生理效应表现在两个层次上：1.在细胞水平上，生长素可刺激形成层细胞分裂；刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长；促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成。

2.在器官和整株水平上，生长素从幼苗到果实成熟都起作用。

生长素控制幼苗中胚轴伸长的可逆性红光抑制；当吲哚乙酸转移至枝条下侧即产生枝条的向地性；当吲哚乙酸转移至枝条的背光侧即产生枝条的向光性；吲哚乙酸造成顶端优势；延缓叶片衰老；施于叶片的生长素抑制脱落，而施于离层近轴端的生长素促进脱落；生长素促进开花，诱导单性果实的发育，延迟果实成熟。

二. 赤霉素（GA）的生理作用：1.促进麦芽糖的转化（诱导α—淀粉酶形成）；促进营养生长（对根的生长无促进作用，但显著促进茎叶的生长），防止器官脱落和打破休眠等。

2.赤霉素最突出的作用是加速细胞的伸长（赤霉素可以提高植物体内生长素的含量，而生长素直接调节细胞的伸长），对细胞的分裂也有促进作用，它可以促进细胞的扩大（但不引起细胞壁的酸化）三.细胞分裂素（CTK）的生理作用1.促进细胞分裂及其横向增粗2.诱导器官分化。

3.解除顶端优势，促进侧芽生长。

4.延缓叶片衰老。

四.脱落酸（ABA）的生理作用：1. 抑制与促进生长。

外施脱落酸浓度大时抑制茎、下胚轴、根、胚芽鞘或叶片的生长。

浓度低时却促进离体黄瓜子叶生根与下胚轴伸长，加速浮萍的繁殖，刺激单性结实种子发育。

2. 维持芽与种子休眠。

休眠与体内赤霉素与脱落酸的平衡有关。

3. 促进果实与叶的脱落。

4. 促进气孔关闭。

脱落酸可使气孔快速关闭，对植物又无毒害，是一种很好的抗蒸腾剂。

检验脱落酸浓度的一种生物试法即是将离体叶片表皮漂浮于各种浓度脱落酸溶液表面，在一定范围内，其气孔开闭程度与脱落酸浓度呈反比。

5. 影响开花。

在长日照条件下，脱落酸可使草莓和黑莓顶芽休眠，促进开花。

6. 影响性分化。

赤霉素能使大麻的雌株形成雄花，此效应可被脱落酸逆转，但脱落酸不能使雄株形成雌花。

组织培养成功率1.培养基配制注意事项植物组织培养最常用MS培养基，包含十几种化合物。

有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀，影响培养基的营养成分，所以MS培养基需要配制多种高倍母液。

配制母液时，尤其涉及大量元素的母液时，一定要等一种成分溶解之后，再缓慢的添加另一种成分；切记一锅煮，即不能将各种化合物一齐添加进去。

2.灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感，pH值低于5很难成胶或凝胶偏软，切记高压灭菌前调节培养基pH值（5.5-6.0）。

植物凝胶对二价阳离子浓度有要求，也就是相对于MS培养基，1/2MS培养基中植物凝胶要适当增加用量。

另外灭菌后，倒出培养基前一定将培养基摇匀（带防烫手套），因为琼脂密度大底层含量高，容易造成培养基强度不均匀。

3.水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用过程中有无区别？水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量在500 mg/L，不管是酸解还是酶解，作用都是一样的，酶解更有利于发挥其作用。

4.怎么溶解组培常用植物激素？IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量95%的乙醇中，再加水定容配制成母液。

如有结晶析出，可考虑用 1 / 10 体积的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于碱性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的浓度。

5.细胞分裂素使用浓度？一般情况下在培养基中加入 0.1～10.0 mg/L 的细胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多数用 1.0～2.0 mg/L，KT 浓度为 0.5～2 mg/L，浓度要根据实验材料来调整。

细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。

6.哪些植物激素能高压灭菌，哪些不能高压灭菌？IBA、NAA、6-BA、2,4-D可高温高压灭菌。

IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌，否则会分解失效，该类植物激素配制母液后需用0.22微孔滤膜过滤除菌，待培养基冷却（50-60℃）后尚未凝胶前加入混匀。

植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。

当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

二、实验器材电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。

三、实验药品NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。

四、实验步骤每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制表1 MS 培养基大量元素母液制备序号 药品名称培养基浓度（mg/L ）扩大20称量(mg)备注1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml2 KNO3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 44004 MgSO 4·7H 2O 370 37005 KH 2PO 41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。

后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。

植物组织培养实训指导书《植物组织培养技术》是生物技术及应用专业的工学结合核心课程之一。

本课程采取“项目引领，任务驱动”的教学模式，使学生掌握植物组织培养技术的职业知识和职业技能，能够在实际工作中具备实验方案设计能力、培养基制备能力、无菌操作能力、组培苗驯化移栽能力及组培苗工厂化生产能力。

实训一：实训室的灭菌与玻璃器皿的清洗一、目的要求1.通过实训，使学生了解各种洗涤液的特性；2.掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器血的洗涤技术；3.通过实训，培养学生良好的卫生习惯，建立组织培养的无菌意识；4.会配制新杰尔灭溶液。

二、材料用具1.灭菌用具：2%新洁尔灭、高镒酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、各种培养血、工作服、口罩、手套、试管刷。

2.洗涤用具：肥皂液、洗衣粉、重铬酸钾粉末、1%HCL、70%酒精、瓶刷等。

三、方法步骤（一）培养室的灭菌1、地面、墙面和工作台的灭菌2、无菌室和培养室的灭菌（二）玻璃器皿的洗涤（酸洗）玻璃器血的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。

重铬酸钾洗涤（三种）液配制：重铬酸钾508，加工蒸馏水，加热溶化，冷却后再缓缓加入工业浓硫酸90ml。

1、新玻璃器血的洗涤用1%HCL的溶液浸泡一昼夜，再用清水反复洗涤，最后用蒸馏水冲淋一遍，干燥后备用。

2、用过的玻璃器血先将器血中得残留物质除去，用清水冲洗，再用洗衣粉洗涤，最后用清水冲洗3—4遍，把字迹擦洗干净，干燥后使用。

3、污染的培养瓶的处理首先经高压蒸汽灭菌，再按（2）的步骤洗涤。

4、用过的吸管、滴管、容量瓶先放在重铬酸钾溶液浸泡2h以上，取出后经流水冲洗30min左右，干燥后使用。

四、实训报告①.植物组织培养室的灭菌方法步骤。

②.写出洗涤液的配置步骤。

③.记录各种培养瓶的洗涤方法。

实训二：组织培养工厂的设计一、目的要求通过实训，使同学们对现代组培苗生产模式有一个更为深刻的认识，能熟练的根据生产规模设计合理的厂房及工艺流程。

二、材料用具组培苗生产小工厂、绘图纸、绘图笔三、方法步骤（-）组培工厂的参观1.参观组培实验中心2.组培工厂的组成：准备室、灭菌室、缓冲室、无菌室、培养室、驯化室3.各室内仪器设备的种类及摆放（二）设计一 200m2组培工厂，要求给出大概的布局图。

植物组织培养常用激素
溶解方法
公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
常用激素溶解方法
1、吲哚乙酸（IAA)：溶于乙醇、热水、碱性溶液，碱性溶液中稳定；一般使用95%酒精、NaOH溶液溶解；
2、吲哚丁酸 (IBA)：溶于乙醇、热水、碱性溶液，碱性溶液中稳定；一般使用95%酒精、NaOH溶液溶解；
3、萘乙酸（NAA）：溶于乙醇、碱性溶液；一般使用95%酒精或NaOH溶液溶解；
4、玉米素（ZT)：溶于乙醇或碱性溶液；一般使用95%酒精或NaOH溶液溶解
5、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）：溶于碱性溶液或酸性溶液；一般使用0.1molHCl或NaOH溶液溶解；
6、赤霉素（GA3）：溶于乙醇，使用95%酒精溶解
备注：生长素一般使用95%乙醇或NaOH 溶解；
分裂素一般使用NaOH溶液、95%乙醇或稀HCl溶解；。