大学课程有机溶剂差别溶解法课件

有机溶剂差别溶解的作用
有机溶剂差别溶解：
• 又称：有和正丁醇等
定义：
根据不同蛋白质其物理、化学性质 不一样，在有机溶剂中溶解度不一 样，控制加入蛋白质溶液的有机溶 剂种类和数量使目的蛋白质得到部 分提纯的方法。
降低溶剂 介电常数
操作时的pH值大多数控制在待沉 淀蛋白质的等电点附近，有机溶 剂在中性盐存在时能降低蛋白质 的溶解度，减少变性，提高分离 的效果
有机溶剂差别溶解分离提纯AKP
注意
(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，要在低温下 进行。溶剂应预冷，加入时要边搅拌边滴 加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。 (2)溶剂的pH 值最好控制在被分离物质的等 电点附近，以提高被分离物质的分离效果。 蛋白质浓度应控制在5-20 mg/m1，以防止高 浓度样品的共沉淀作用。 (3) 溶液的离子强度控制在0.05一0.1范围内。 (4)有机溶剂中有中性盐存在时能降低蛋白质 的溶解度，减少变性，提高分离效果。中 性盐浓度一般 0.05mo1/L 左右为好，过高影 响沉淀。
丙酮终浓度50% AKP 在终浓度为33％的丙酮或 30％的乙醇中溶解，而在终浓 度为50％（60%）的丙酮或60％ 的乙醇中不溶解 ——与介电常数的改变有关
可根据该性质用不同浓度的冷 丙酮和冷乙醇重复分离提纯
有机溶剂差别溶解分离提纯AKP
MgAC2的作用
（Mg(CH3COO)2·4H2O ）
有保护和稳定AKP 的作用，减少 与有机溶剂接触的时间
谢谢~
有机溶剂差别溶解分离提纯AKP
碱性磷酸酶
广泛分布于各脏器器官中，其中以 肝脏为最多
AKP
能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团， 从而使DNA或RNA片段的5’-P末端
转换成5’-OH末端
一组同功酶
在碱性环境有最大活力（最适PH为
10左右）
细菌AKP二级结构(蓝色为N 末端 红色为C末端)
有机溶剂差别溶解分离提纯AKP
兔肝匀浆
加2ml4℃预冷正丁醇
滤液
加等体积预冷丙酮
沉淀
悬液
上清液
加 MgAC2
加预冷95%乙醇至终 浓度30%
加预冷95%乙醇至 终浓度60%
有机溶剂差别溶解分离提纯AKP
正丁醇
•使细胞破碎、颗粒体（细胞核、 线粒体、微粒体、质膜）结构解体， 把酶释放出来 •去除杂蛋白
有机溶剂差别溶解分离提纯AKP
F=e1e2/εr2
破坏水 化膜
原理：
大分子蛋 白质聚集
沉淀
溶剂选择：
能与水互溶的有机溶剂，不与蛋白 质反应，沉淀效应良好，无毒，与 水亲和力大，常用的有乙醇、丙酮 正丁醇等
V－需加10 0％有机溶剂的体积； V0－原溶液的体积； S1－原溶液中有机溶剂的浓度； S2－要求达到的有机溶剂浓度； 100－指加入的有机溶剂浓度为100 ％。如所加入的有机溶剂的浓度为 95％，上式(100一S2)项应改为(95 一 S2)。