分光光度法测定夏枯草中总黄酮的含量【摘要】目的研究可见光及紫外光分光光度法测定夏枯草中总黄酮含量的方法。
方法可见光分光光度法是以芦丁为参照品，硝酸铝作显色剂，在510 nm波长处测定总黄酮含量；紫外光分光光度法是以芦丁为参照品，在357nm波长处测定总黄酮含量。
结果可见光法平均回收率为97.76%，紫外光法为99.10%，前者的RSD值是1.02%，后者的RSD值是0.88%。
结论紫外分光光度法具有简便、快速、准确、经济的优点，是一种较理想的测定夏枯草中总黄酮含量的方法。
【关键词】夏枯草；总黄酮；分光光度法Abstract：ObjectiveTo determine the total flavone content in Prunella vulgaris L. by VIS and UV Spectrophotometry.MethodsThe control sample of VIS Spectrophotometry was rutin，the revealing agent was Al(NO3)3 and the analyzed wavelength was 510 nm.The control sample of UV Spectrophotometry was rutin and the analyzed wavelength was 357nm.ResultsThe average recoveries of VIS and UV Spectrophotometry were 97.76% and 99.10%，the RSD were 1.02% and 0.88% respectively. ConclusionUV spectrophotometry is simple， rapid， accurate， economical and is suitable for content determination of total flavones in Prunella vulgaris L..Key words：Prunella vulgaris L.; Total flavones; Spectrophotometry中药夏枯草为唇形科夏枯草属植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，全国大部分地区均有分布，易栽培，资源丰富。
主要含有三萜及其苷类、苯丙素类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及其糖类等。
全草均可入药，其味辛、微苦，性微寒，具有清火、明目、散结、消肿之功效。
常用于治疗头痛、眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛、甲状腺肿大、淋巴结结核、乳腺增生症等疾病［1］。
目前，有关植物中黄酮类物质的测定方法主要有分光光度法和高效液相色谱法等［2～4］，其测定夏枯草总黄酮含量的方法还未见报道。
本文分别采用可见光和紫外光分光光度法测定夏枯草中总黄酮的含量，并对两种方法进行了比较，拟寻找出一种准确而简便的测定夏枯草中总黄酮含量的方法，为合理科学开发这一宝贵的中药资源，深入研究其确切的药理作用提供可靠的理论和实验依据。
1 器材与方法1.1 材料1.1.1 试剂与原料无水甲醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂均为分析纯；芦丁对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号：0080-9705)；夏枯草药材购于广州市药材公司（由广东药学院生药研究室鉴定），经粉碎后过60目筛，放入60～80℃烘箱中干燥12h后，稍加冷却，放入干燥器中备用。
1.1.2 仪器与设备上海惠普6010型紫外-可见分光光度计；上海二分7230G可见光分光光度计；北京赛多利斯电子分析天平；索氏提取器；F120型粉碎机；RE52286A型旋转蒸发器等。
1.2 方法1.2.1 药液的制备精确称取夏枯草干粉2.500 0 g置于索氏提取器中，石油醚回流以除去试样中的脂类及色素，至提取管中呈无色。
将石油醚提取后的残渣，用200 ml无水甲醇，抽提至无色。
提取液全部转移到250 ml容量瓶中，用无水甲醇定容作为实验用液，待测。
1.2.2 可见光分光光度法标准曲线的绘制［5］精确称取经120℃下干燥至恒重的芦丁对照品10.0 mg，用无水甲醇溶解，转移至100 ml容量瓶中，用无水甲醇定容，摇匀，即得芦丁对照品溶液(每毫升溶液含芦丁对照品0.1 mg)。
准确吸取0.1mg/ml的芦丁对照品溶液0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 ml，分别置于25 ml容量瓶中，各加甲醇至10 ml，分别加5%亚硝酸钠溶液1.00 ml，摇匀，放置6 min后分别加10%硝酸铝溶液1.00 ml，摇匀，放置6 min，再分别加1%氢氧化钠溶液10.00 ml，并用甲醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，以无水甲醇溶液为空白液，在波长510 nm处测各溶液的吸光度，得回归方程为：A=0.020 93C－0.012 1〔A为吸光度，C为浓度(mg/L）〕，相关系数r=0.999 6。
表明芦丁对照品溶液浓度处于2～32 mg/L范围内时，吸光度与其浓度间呈现出良好的线性关系。
1.2.3 可见光分光光度法回收率实验精确称取6份已知总黄酮含量的夏枯草粉末2.500 g，加入一定量的芦丁对照品，按照“1.2.1”项所述制得实验液，按照“1.2.2”项所述显色并测定吸光度，由回归方程计算总黄酮含量，按下式计算回收率。
回收率（%）=混合后实测总黄酮含量－样品中总黄酮的含量芦丁标准加入量×100%（1）1.2.4 可见光分光光度法样品的总黄酮含量测定分别准确吸取1.00 ml实验用液入25 ml容量瓶中，按照“1.2.2”项所述方法显色后，在510 nm波长处测定吸光度A，由回归方程计算出样品中总黄酮的含量。
1.2.5 紫外光分光光度法标准曲线的绘制［6］精确称取在120℃干燥恒重的芦丁对照品10.0 mg于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.100 mg/ml芦丁对照品溶液。
精确量取上述溶液0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 ml，至于10 ml量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，制成芦丁含量为2～32 mg/L的系列标准溶液。
以甲醇为试剂空白，在357 nm波长处测定其吸光度，结果表明芦丁的甲醇溶液在2～32 mg/L浓度范围符合Beer定律，吸收度与其浓度呈良好的线性关系，其回归方程为：A= 0.031 7C－0.013 9〔A为吸光度，C 为浓度(mg/L）〕，相关系数r = 0.999 8。
1.2.6 紫外光分光光度法回收率实验精密称取6份已知总黄酮含量的夏枯草粉末2.500 g，加入一定量的芦丁对照品，按照“1.2.1”项所述制得样品液，用甲醇稀释样品液，在357 nm处测定吸光度A，由回归方程计算总黄酮含量，按公式（1）计算出回收率。
1.2.7 紫外光分光光度法样品的总黄酮含量测定分别准确吸取1.00 ml试验用液入25 ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，在357 nm波长处测定吸光度A，由回归方程计算出样品中总黄酮的含量。
2 结果2.1 样品的总黄酮含量测定黄酮类化合物具有特定的紫外吸收带，其结构中的肉桂酰环产生的Ⅰ带在300～400 nm内，而由苯甲酰环产生的Ⅱ带在240～285 nm内，不同的黄酮在这两个吸收带的吸收强度不同［7］。
含黄酮类化合物的原料经一定的方法提取纯化后，可直接于最大吸收波长处测定其吸收度，以芦丁为对照品对照计算其含量［8］。
本实验选择芦丁在Ⅰ带的最大吸收波长357 nm作为紫外光分光光度法的测量波长。
取不同产地的夏枯草样品，分别用可见光分光光度法和紫外光分光光度法对每个样品平行测定6次，得各个样品的总黄酮平均含量如表1所示。
表1 不同产地夏枯草样品的总黄酮含量（略）从表1可见，不同产地的夏枯草全草的总黄酮含量有一定差异，其中以贵州贵阳产夏枯草黄酮含量最高，而海南海口产夏枯草黄酮含量最低。
其次，用可见光分光光度法测得的总黄酮含量总是比用紫外光分光光度法测得的总黄酮含量要高，这可能是因为夏枯草的化学成分中含多种萜类，其中相当部分萜类的分子结构中含有能与铝离子络合显色的酚羟基，而可见光分光光度法是在强碱性溶液与铝离子反应后显色，酚羟基在该条件下能与铝离子结合，在510 nm处也容易被吸收，这样导致用可见光分光光度法测定出的结果有所偏高［9～11］。
2.2 回收率实验把一定量的芦丁对照品加入已知总黄酮含量的贵州夏枯草中做回收率实验。
结果见表2。
表2 贵州贵阳夏枯草总黄酮回收率实验结果（略）由表2可见，采用可见光分光光度法，回收率范围为96.43%～98.96%，其RSD值为1.02%；而用紫外光分光光度法，回收率范围为97.85 %～100.06%，其RSD值为 0.88%，两者均符合定量分析的要求。
3 讨论黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物当中，具有多种生物学活性，是中药材药物内的一类重要化学成分，具有多种药理作用，诸如抗氧化作用、消炎作用、抗癌和抗基因诱变作用等。
上述实验表明，夏枯草中含有极为丰富的黄酮类物质，但不同产地的夏枯草全草中所含有的总黄酮成分存在较大的差异，这可能与药材的生长环境、采收季节、提取方法以及贮藏条件等都有一定的关系。
实验结果进一步表明，采用可见光分光光度法和紫外光分光光度法这两种常规方法测定夏枯草中总黄酮的含量时，都有较好的线性关系。
但由于紫外光分光光度法能直接测定夏枯草总黄酮的含量，不需用硝酸铝显色，从而能够避免夏枯草中萜类化合物酚羟基的干扰，方法简便、快捷、准确而又经济，是测定夏枯草总黄酮含量更为可取的方法，适合于各基层单位推广采用。
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