实验十保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定(精)

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。

这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。

近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。

过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。

生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。

植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。

抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。

SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。

二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。

如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。

H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。

六、本实验教学内的深化和拓展
通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联 系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物 SOD与动物SOD的区别，了解植物SOD的优势。
七、思考题，完成实验报告
1 什么是分段盐析，为什么要分段盐析？ 2 SOD有哪些用途？
三、材料与试剂
1. 材料
玉米籽粒
2. 主要试剂 1、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）,500mL 2、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 3、丙酮：用前需预冷至4-10℃ 4、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2） 5、0.1mol/LEDTA溶液
2.3 仪器 恒温水浴锅、 冷冻高速离心机、 可见分光光度计、 研钵、玻棒、烧杯、量筒，等。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心 15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积 的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心 15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于5560℃热处理15min，得到SOቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ酶液。
3.2 SOD活性测定
试剂（mL）
空白对照管 样品管
碳酸缓冲液
5.0
5.0
EDTA溶液
0.5
0.5
蒸馏水
0.5
—
样品液
—
0.5
混合均匀，在30℃水浴中预热5min，测定
OD480
3.3 结果计算
总酶活力=酶液总体积X稀释倍数/抑制 50%的酶液量X样品重
五、本实验教学内容的重点和难点
重点：粗提液的获得玉米SOD的提取 难点：提取条件的控制

三 、美国FDA（美国药品食品管理局）在大量科学试验数据和大众的 呼吁中，终于在1998年批准使用SOD产品。
四 、我国医学研究延缓衰老已有几千年的历史了，很多中药材中关 于衰老的成分被发现和应用，经检测证明，具有延缓衰老作用的中药均 是通过提高SOD数量及活力来达到抗氧化及抗衰老作用的。如人参、冬 虫夏草、灵芝、西洋参、红景天等。
医学研究证明：SOD与多种疾病相关，是百病之源，如肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病、骨关节炎、心肌炎、免疫 力低下疾病，特别是免疫下降引起的类风湿、红斑狼疮等病。
目前SOD作为药用酶在美国、德国、日本、澳大利亚等国已在临床应用在自身免疫疾病上，如类风湿性关节炎、 红斑狼疮等疾病治疗，不论是口服还是肌肉注射取得十分明显疗效。在治疗心肌缺血症与缺血再灌注综合症及某些 心血管疾病方面也取得重要成果。在用做抗辐射、抗肿瘤、心肌炎、早产婴儿氧中毒症的解毒药也取得重要进展。 在临床上，也开始应用SOD，用来辅助放疗和化疗，以降低大剂量照射引起副作用，效果极为明显。
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SOD—人类对抗自由基的第一道防线
SOD是人类对抗自由基的第一道防线，是一次性清除体内过剩自由基最有效的酶，功效 是常见维生素C、E的几十倍。能有效清除老年机体代谢过程中所产生的过量的氧自由基，从
而延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象。
SOD集清除、激活、再生、修复、自愈、供养六位为一体，对因免疫力低下引起的各处症状、 亚健康状态有突出功效。特别是通过提高人体免疫机能，完成清除体内垃圾(自由基) ，激活神经干细胞分化，促进脑神经及组织细胞再生，修复因免疫力低下对心、肾、 神经、大脑、皮肤等人体组织的损伤，增强机体伤后的自愈能力，供给营养补充。
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SOD（超氧化物歧化酶）—国内外临床应用

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。

在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。

按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。

酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器荧光灯管。

离心机。

分光光度计。

pH计。

3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。

4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定氮蓝四唑法一、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：o 2.-+H O 222+O H ＋反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。

据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx)(三)试剂(1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。

(3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。

(4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。

(5)20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到1000mL ，避光保存。

三、试验步骤(一)酶液的提取(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g ，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使体积为5mL。

取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

O-. 2 、H2 O2、OH ·的产量增加； SOD、CAT 、POD活性降低； VtE 、VtC、CAR、GSH 含量降低； 从而伤害细胞。
什么叫逆境？
逆境的种类?
逆境是指对植物生存生长
不利的各种环境因素的总称.
为什么要测定 完全液和缺素 苗的SOD 活性？
二、目的要求：
1.了解SOD活力测定的实践意义； 2.掌握SOD测定的原理及操作要点； 3.比较完全液溶液和缺素溶液培养的
超氧化物歧化酶(SOD)
活性测定
(NBTБайду номын сангаас)
一、测定意义 二、目的要求 三、原理 四、仪器设备 五、试剂配制 六、植物材料 七、操作步骤 八、结果计算 九、注意事项 十、思考题
一、意义：
植物正常情况下
细胞内自由基的产生和消除处于动态平 衡状态，自由基水平很低，不会伤害细 胞。
植物逆境胁迫下
植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破
九、注意事项:
1.所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。 2. 照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。 3. 要多做对照消除日光灯管的光质差异。
4. 植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时 可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。 5. 结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。
石英砂
→研磨成匀浆→再加入3ml缓冲液,?研磨均匀后, 将匀浆液倒入聚乙烯离心 管中→低温(0～4℃)下、4800rpm 离心10min ─→上清液即为酶液， 将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供SOD活性测定。
? 2.SOD 活性测定：
取6支试管, 编号, 按下表加入试剂。将1号管用黑纸袋套上, 与其它试管 一起放荧光灯下, 光强3000Lx 照光10min, 到时间后关灯, 用黑布罩上试 管(如室内光线不强, 不罩黑布也可), 以1号试管溶液为参比, 测定样品在 560nm 处的吸光度。 ?不加酶的 2号试管溶液颜色最深 ; 加入酶的由于 SOD抑制了硝基四唑蓝的光还原,颜色变浅。

超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。

5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。

%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。

活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。

样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。

超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。

因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。

超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。

步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。

2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。

3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。

4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。

5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。

6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。

7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。

超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。

1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。

收稿日期:2004-09-02 作者简介:黎瑞珍(1974-),女,海南乐东人,琼州大学化学系讲师.第11卷　第5期琼州大学学报2004年10月28日V ol.11　N o.5Journal of Qiongzhou University Oct.28.2004超氧化物歧化酶(SOD )活性的测定及其应用研究黎瑞珍,杨庆建,陈贻锐(琼州大学化学系,海南五指山572200)摘　要:简述了超氧化物歧化酶(S OD )的种类分布和理化性质,着重介绍其活性的各种测定方法及其在医药、食品、化妆品、农业增产等方面的应用研究.关键词:超氧化物歧化酶;活性;测定;应用中图分类号:O656 文献标识码:A 文章编号:1008-6722(2004)05-0034-03 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,简称S OD )广泛存在于各类生物体中,能催化生物体内超氧自由基(O 2-)发生歧化反应,是机体内O 2-的天然消除剂,对机体细胞起保护作用。

因此,机体内S OD 在防御O 2-的毒性、抗衰老以及预防肿瘤和抗炎等方面起着重要的生理作用。

受到国内外医药日用化工,食品及生化界的极大关注。

在我国,S OD 研究和应用的深度及广度已居酶类生化制剂的首位[1]。

1　S OD 的种类及理化性质1.1S OD 的种类迄今为止,人们已从细菌、真菌、原生植物、藻类、昆虫、两栖动物和哺乳动物等生物体内分离得到了S OD 。

按其金属辅助基的不同,可分为Cu 、Zn -S OD 、Mn -S OD 、Fe -S OD 三种类型。

后两者性质相似,在蛋白质一级结构、空间结构、分子量、光谱性质及对不同抑制剂的敏感等方面与前者差别较大[2]。

1.2S OD 的理化性质S OD 是一种酸性蛋白,在酶分子上共价连结金属辅助基,因此它对热,PH 以及某些理化性质表现出异常的稳定性,S OD 的主要理化性质见表1。

表1　S OD 的某些理化性质S OD 类型分子量含有金属数最大光吸收/nm 紫外线　可见氨基酸组成特点1　m ol/L K C N 抑制H 2O 2处理Cu ,Zn 2S OD 320002Cu ,2Zn 258680酪氨酸和色氨酸缺乏明显抑制明显失活Mn 2S OD 440002Mn 280475含酪氨酸和色氨酸无无影响Mn 2S OD 800004Mn 280475含酪氨酸和色氨酸无无影响Fe 2S OD400002Fe280350含酪氨酸和色氨酸无明显失活 以上讨论了三种不同S OD 的种类分布及理化性质,可以看出,这三种S OD 都可以催化O 2-歧化为H 2O 2和O 2,但S OD 与一般酶不同之处在于其作用底物是一种寿命很短的自由基O 2-,这给S OD 的催化机理和反应动力学研究等主要实验方法中取得相互一致的结果。

- · O2 -· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定一、目的1．通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。

2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD ）的活力和比活力的方法。

3．掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。

二、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，简称SOD ），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD ，Mn-SOD ，Fe-SOD 。

SOD 催化如下反应：在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。

在玉米中，SOD 主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD 就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH 4）2SO 4去除杂蛋白部分，再用90%（NH 4）2SO 4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD 成分即被浓缩分离。

超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。

利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD 浓缩液。

SOD 活性的测定：采用NBT 光还原法。

其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O 2-，当加入NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。

该产物在560nm 下有最大吸收峰。

当加入SOD 时，可以使超氧自由基与H +结合生成H 2O 2+O 2，从而抑制了NBT 光还原的进行，使兰色二甲月替 生成速度减慢。

SOD抑制剂的研究
寻找和设计能够抑制SOD活性的小分子 或大分子物质，用于研究SOD在生物体 内的功能和作用机制。
VS
SOD激活剂的研究
寻找和设计能够提高SOD活性的小分子 或大分子物质，用于抗氧化应激和治疗相 关疾病的研究。
05
SOD的应用和展望
SOD在医学领域的应用
疾病诊断
超氧化物歧化酶(SOD)水平可以 作为某些疾病的诊断指标，如癌
妆品等领域的应用。
新型SOD的研发
通过基因工程和蛋白质工程技术 ，研发具有特殊性质的新型SOD ，如热稳定型、高活性型等，以
满足不同领域的需求。
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超氧化物歧化酶(sod)简介课 件
目 录
• SOD的概述 • SOD的生物学功能 • SOD与疾病的关系 • SOD的检测和实验技术 • SOD的应用和展望
01
SOD的概述
SOD的定义
总结词
超氧化物歧化酶（SOD）是一种生物活性物质，具有抗氧化应激和保护细胞免 受损伤的重要功能。
详细描述
SOD是一种金属酶，其活性与金属离子（如铜、锌）有关。它能够催化超氧阴 离子自由基发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而消除超氧阴离子自由基 的毒性。
参与免疫反应
SOD在免疫反应中发挥重要作用，能够影响炎症反应和细 胞凋亡等过程。SOD能够清除超氧阴离子等自由基，抑制 炎症细胞的活化和聚集，从而减轻炎症反应。
同时，SOD能够抑制细胞凋亡和坏死，保护细胞免受损伤 。在感染和组织损伤等情况下，SOD的表达水平会升高， 有助于抵抗病原体和促进组织修复。
症、心血管疾病等。
药物治疗
SOD可以作为药物载体，用于传递 药物到靶部位，提高药物的疗效和 减少副作用。

Fe-SOD的活性中心 是由一个铁离子构成 的。
Mn-SOD的活性中心 是由一个锰离子构成 的。
03
SOD活性测定的方法
化学发光法
总结词
灵敏度高、检测范围广
详细描述
化学发光法是一种通过化学反应产生光子的方法，其灵敏度高，可以检测到超低浓度的超氧化物歧化 酶活性。该方法具有较宽的检测范围，适用于不同来源和不同浓度的超氧化物歧化酶活性测定。
3
反应时间
根据实验要求，控制反应时间，以便准确测定酶 活性。
数据处理与分析
数据记录
01
详细记录实验过程中的数据，如反应速率、吸光度等。
数据处理
02
对记录的数据进行适当的处理，如计算酶活性、绘制图表等。
结果分析
03
根据实验结果，分析超氧化物歧化酶的活性变化，并得出结论。
05
SOD活性测定的应用
医学领域
SOD活性测定可以用于某些疾 病的辅助诊断和防治。例如， 在一些疾病中，SOD活性可能 会降低，导致生物体抗氧化能 力下降，加速细胞损伤。通过 对SOD活性进行测定，可以为 疾病的诊断和防治提供依据。
药物研发与评价
SOD活性测定可以用于药物研 发和评价。一些药物可能会影 响SOD活性，通过对SOD活性 进行测定，可以评估药物对生 物体抗氧化系统的影响，从而 为药物研发和评价提供参考。
电化学法
总结词
快速、便携
详细描述
电化学法是一种通过测量电化学信号来测定 超氧化物歧化酶活性的方法。该方法具有快 速、便携的特点，适用于现场检测和实时监 测。电化学法可以通过设计不同的电极和电 化学反应，实现对超氧化物歧化酶活性的快 速、准确测定。
04
SOD活性测定的实验步骤

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定-----氮蓝四唑（NBT）法依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表2顺序加入试剂，注意核黄素要最后加入，共做6管。

表2 NBT法测定SOD酶活性50mM pH 7.8磷酸缓冲液（mL）130mM甲硫氨酸溶液（mL）750μM氮蓝四唑溶液（mL）100μMEDTA-Na2（mL）蒸馏水（mL）酶粗提液（mL）20μM核黄素溶液（mL）1 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.62 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.63 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.64 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.65 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.66 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6注：1号为不光照对照管，2号为光照对照管各溶液显色反应用量混合后，将1号管置于黑暗处，其余各管置于光照处，反应约10 min（温度低时，反应时间延长；光照强时，缩短反应时间）。

反应结束后，全部移入暗处，以不光照对照管作为空白对照，在560nm处测定吸光度，记录数据。

以每变化0.1个吸光度为一个酶活单位SOD酶活计算公式：SOD（U/Pr.mg)=(Ack-Ae)/(Ack*0.1*C)式中：C-蛋白含量（mg）Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度Ae-样品管吸光度试剂配制方法：（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

91.5ml0.05MNa2HPO4（1.638582g）+8.5ml0.05M NaH2PO4(0.06630425g)（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

植物超氧化物歧化酶活性测量一、实验目的及要求（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

二、实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2. 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，糖果组合组织或者细胞破碎后，可用Ph7.8的磷酸缓冲液提取。

邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。

邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40秒-3分钟这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。

颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

三、实验材料、仪器设备及试剂1、实验材料：大蒜2、仪器：离心机3、试剂：(1)磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）)(PH8.3 Tris-HCl )（2）浓盐酸(3)邻苯三酚（50mmol.L-1）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

(5) 考马斯蓝G-250：100mg 考马斯蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)正磷酸，用蒸馏水稀释至1L，过滤。

（6）牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）四、实验方法1、材料准备：每组30g大蒜，加入90 ml pH7.8 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，匀浆机匀浆，两层纱布过滤，冷冻离心（5000 rpm，20min）得清液测体积，取少量清液进行SOD活性测量。

2、将上清液置于60℃20min,使杂蛋白变性，然后5000r.min-1冷冻离心20min，取上清液测体积，并进行SOD活性测量。

3、SOD活性测定（邻苯三酚法）采用改良的邻苯三酚自氧化法。

邻苯三酚自氧化速率为325 nm, 0.070D /min左右,以 1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。

实验十保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定一、实验原理根据GB/T5009.171-2003，将25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%所需的SOD定义为一个活力单位。

在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据SOD 抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。

二、实验试剂A液：pH 8.20的0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。

称取 1.2114g三羟甲基氨基甲烷和37.2mgEDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/l盐酸溶液中，用蒸馏水定溶至100ml。

B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。

称取邻苯三酚56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容至100ml。

盐酸溶液：10mmol/L 蒸馏水：二重石英蒸馏水三、实验仪器紫外-可见分光光度计精密酸度计（0.01pH）离心机10ml比色管10ml 离心管玻璃乳钵。

四、测定步骤⑴取茶叶样品1.00g置于研钵中，加入9.0ml蒸馏水研磨5分钟，移入10ml 离心管。

用少量蒸馏水冲洗研钵，洗液并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000r/min离心15分钟，取上清液测定。

⑵在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B 液0.15ml。

加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1Min后吸光度值，二者之差为邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1）为0.060。

⑶在25℃左右，于10ml比色管中依次加入20.0ul样液或酶液，A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。

加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm 波长条件下初始时和1分钟后吸光度值，二者之差为样液或酶液抑制邻苯三酚自氧化速率△A′325（min-1）。

加入样液或酶液的量使抑制邻苯三酚自氧化速率为1/2△A′325（min-1），即0.030。

植物生理学模块实验指导李玲主编科学出版社超氧化物歧化酶的测定方法【实验目的】学习测定超氧化物歧化酶活性的方法。

【实验原理】超氧化物歧化酶（SOD）普遍存在于动植物与微生物体内。

SOD是含金属辅基的酶。

高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。

SOD能够清除超氧阴离子自由基（O2—·），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。

超氧阴离子自由基（O2—·）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。

超氧化物歧化酶催化以下反应：2 O2—·+ 2H+ ═H2O2+O2超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD活性。

本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。

被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2—·。

当加入NBT 后，在光照条件下O2—·又可将NBT还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。

当加入SOD时，SOD可通过清除O2—·，而抑制NBT的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。

于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。

抑制NBT光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。

常常将抑制50%的NBT光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U）。

【器材与试剂】1.实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、微量移液枪、离心管、光照箱（光照度为4000lx）、指形玻璃管、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）2.实验试剂0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）：配制方法见附录。

酶提取缓冲液：称取77mg DTT、5g PVP，加入0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8），定容至100ml，摇匀，即得提取缓冲液（含5mmol/L DTT和5% PVP），低温（4℃）贮藏备用。

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。

跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。

实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。

一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。

分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。

在微生物中主存于需氧菌。

SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。

二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

SOD作为治因而受到医药界的关注。

目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。