植物蛋白质双向电泳样品制备研究进展

双向电泳分离水稻叶片蛋白实验教学的改进王琳，杨晓勤，陈云（扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州225009）目前，双向电泳技术是研究蛋白组学十分重要的技术手段，特别是以固相pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳技术是当前分辨率最高，信息量最大的电泳技术。

它具有结果直观，分辨率较高，信息量大，技术成熟等优点，因此，此实验也成为本科生生物化学实验中的基础性实验，是生物化学实验教学的重要内容。

在双向电泳中，上样量大小取决于样品中蛋白质的种类、数目、检测方法的灵敏度及胶条的pH梯度范围和长度。

不同样品中蛋白的种类、数目有一定差异，所以在检测方法相同，一向IPG胶条pH梯度范围和长度相同的条件下，不同样品的蛋白上样量有差异。

为了获得一个分辨效果好和重复性好的双向电泳图谱，得到质量高的水稻叶片蛋白电泳分离效果，找出合适的蛋白上样量很重要。

作者在使用双向双向分离水稻叶片蛋白实验的传统方法时发现，根据原来的蛋白上样量分离的蛋白斑点较少且模糊。

为了提高水稻叶片蛋白的电泳分离效果，本文对此进行了探讨。

一、方法（一）常规实验方法首先采用三氯乙酸-丙酮法提取水稻叶片蛋白。

将叶片研磨至叶片成粉末状，加入溶液A（10%三氯乙酸（TCA）和0.07%β-巯基乙醇的预冷丙酮溶07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液）悬浮沉淀。

4℃，11000rpm离心15min，弃上清，重复两次，将最终得到的沉淀真空冷冻干燥，然后用Bradford法测定蛋白质含量，最后通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离水稻叶片蛋白。

称取一定量的水稻叶片冻干样品，溶于裂解液中（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer4-7，1%DTT），样品超声波处理五次，每次3-5s，间隔3s，于冰水中裂解30min，14000rpm离心20min，取上清，再离心，取上清，以充分去除杂质，获得的蛋白样品除少量用作浓度测定外，其余进行分装，于-80℃保存。

油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
以甘蓝型油菜"扬油6号"的叶片为试验材料,分别采用传统的TCA/Acetone(三氯乙酸/丙酮沉淀法)和改进的PEG(polyethylene glycol)分步提取法提取叶片可溶性总蛋白,并利用条件一致的蛋白质双向电泳体系进行比较.TCA/Acetone法提取的蛋白质双向电泳图谱背景中由于高丰度"housekeeping"结构蛋白的存在,特别是叶片中参与光合作用的Rubisco蛋白的干扰,图谱中低丰度调控蛋白受到了高度覆盖和遮蔽现象,影响双向电泳图谱的质量.而PEG分步提取法提取的蛋白质样品,可以剔除Rubisco蛋白,使获得的双向电泳图谱清晰,无斑点间的遮蔽现象,为油菜叶片蛋白质组定量和定性分析提供了丰富的信息.
作者：孔芳蒋金金吴磊葛才林王幼平作者单位：扬州大学生物科学与技术学院,扬州,225009 刊名：生物技术通报PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年，卷(期)：2010 ""(5) 分类号：关键词：油菜叶片总蛋白双向电泳图谱。

现代生物学技术实验报告题目蛋白质双向电泳技术姓名学号专业小组成员指导教师中国·武汉年月联系方式：大肠杆菌组蛋白双向电泳技术摘要：蛋白质双向电泳是一种等电聚焦与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术，也是蛋白质组学研究中分离纯化蛋白质的主要方法之一。

双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在等电点上的差异，而垂直方向反映出他们在分子量上的差别。

本实验通过学习蛋白质双向电泳技术，熟悉了蛋白质双向电泳的简单流程。

可以根据电泳所得的图像分析，分离蛋白质。

关键字：蛋白质双向电泳等电聚焦电泳 SDS-PAGE前言：蛋白质组研究的发展以双向电泳技术（2-DE）作为核心。

双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点（spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。

本实验是要研究大肠杆菌中的蛋白质，并学习和初步掌握双向电泳技术。

正文：1)实验原理：从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。

目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。

这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。

双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。

在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。

第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。

双向电泳实验蛋白质样品制备要点1.选择适合的样品预处理方法：蛋白质样品预处理的方法包括提取、富集和纯化等。

常见的方法有溶细胞法、组织破碎法和亲和层析法等。

根据具体实验目的和样品特点，选择适合的方法进行样品预处理是确保蛋白质样品质量的重要因素。

2. 选择合适的蛋白质溶液：根据目的不同，选择适于蛋白质分离的缓冲液和胶液。

常用的缓冲液有Tris-Glycine、Tris-Tricine和Tris-Acetate等，常用的胶液有聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺/聚丙烯酰胺共聚物凝胶等。

根据蛋白质的特性和实验要求，选择合适的缓冲液和胶液可以提高分离效果和样品质量。

3. 蛋白质样品质量检测：在进行双向电泳实验前，需要对蛋白质样品进行质量检测。

常见的检测方法包括BCA法、Lowry法和Bradford法等。

这些方法可以测定样品中的蛋白质浓度，以确保实验的准确性和可重复性。

4.样品处理与加载：在进行双向电泳实验时，需要将蛋白质样品进行处理和加载，以便进行分离和鉴定。

样品处理的方法包括蛋白质还原、脱脂和蛋白质标记等。

蛋白质还原可使用还原剂如二巯基乙酸、巴布威和三丁基磺酸等，蛋白质脱脂可使用胰酶和胰酶胰凝乳酶等。

加载样品时，需要控制样品数量和均匀性，避免过多或过少的加载，以避免样品定位和分离差异。

5.电泳条件的优化：电泳条件的选择和优化是双向电泳实验的关键。

根据样品特性和实验目的，调整电场强度、升温速率和电泳时间等参数，以获得较好的分离效果。

此外，还需要注意电泳温度的控制，避免样品的热失活和电场影响。

6.截胶和染色：双向电泳实验结束后，需要进行截胶和染色步骤，以检测和鉴定分离的蛋白质。

截胶可使用染色剂如胭脂红和银染等，染色后可以通过人工或自动扫描仪对蛋白质进行定量和定位。

7. 数据分析和解释：双向电泳实验获得的数据需要进行分析和解释。

常见的数据分析方法包括质谱分析、2D胶电泳图像比较和蛋白质鉴定工具（如万得鉴定和Mascot等）。