实验六蛋白质制备及含量测定微量凯氏(Mirco・Kjeldahl)定氮法一、实验目的要求1、了解蛋白质提取的一般方法和原理2、了解蛋白质含量测定的常用方法3、学习微量凯氏定氮法的原理4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸镭、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。
二、实验原理1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。
如果是胞内蛋白，首先必须要进展细胞破碎。
细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎(研磨、超声波等)、化学破碎(化学洛剂处理)、酶法破碎等。
如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进展提取别离纯化。
如果待提取的蛋口质是具有生物活性的蛋口质如酶，那么在样品处理、提取及别离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋白质含量测定蛋口质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩腺法、考马斯亮蓝染色法(Bradford法)、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。
3、凯氏定氮生物材料的含氮量测定在生物化学硏究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16%,测出含氮量那么可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法山于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。
其原理如下：(1)消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮一一硫酸镀。
为加快反响，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。
这一步约需2〜3d视样品的性质而定。
天然的含氮有机物(如蛋白质，核酸及氨基酸等)与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解，而有机氮那么变成氨(无机氮)，并进一步与硫酸作用生成硫酸镀。
此时程称之为“消化“。
但是，这个反响进展得比拟缓慢，通常需要参加硫酸钾或硫酸钠以提高反响的沸点，并参加硫酸铜作为催化剂，以促进反响的进展。
第一部分蛋白质组学操作规程一、蛋白质组学样品制备规程（01 ）P1. 双向电泳样品缓冲液选用的基本原则P3. 细胞样品制备（分步）操作规程P4. 细胞总蛋白提取操作规程P5. 螺旋藻组织蛋白质提取方法P6. 嗜热菌蛋白质提取方法P7. TCA- 丙酮沉淀法样品制备操作规程P9. 植物材料可溶性蛋白的双乙法制备流程P10. 动物细胞的样品制备P10. 动物组织的样品制备——胃P11. 肺癌组织样品制备P12. 食管癌样品制备P13. 羊绒/毛蛋白提取P13. 大鼠海马组织蛋白提取P14. 使用Cibacron Blue 3GA Agarose 去除小鼠血浆/血清中的白蛋白P15. E.Coli 样品制备方法P15. 微生物细胞样品制备操作规程P16. 去除血浆/血清中的白蛋白和Ig-GP17. 植物根蛋白提取方法P17. 2D-LC鼠肝样品shotgun消化实验路线P18. 小鼠肝组织蛋白质提取方法P18. 小鼠肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P25. 人肝蛋白质组织提取方法P27. 人肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体）P27. 丙酮丁醇菌蛋白质提取方法（选用嗜热菌蛋白质提取方法） P27. 嗜碱菌蛋白质提取方法（尚在摸索阶段）P27. 脑脊液蛋白质提取方法二、蛋白质定量标准操作规程（02 ）P1. 改良的Bradford 法测定蛋白质含量P3. Lowry 法（DC 试剂）测定蛋白质含量P5. Lowry 法测定蛋白质含量（自配试剂）P7. 安玛西亚定量试剂盒使用方法P8. 利用微板（96 孔板）定量测定蛋白质浓度P9. BIO-RAD PROTEIN ASSAY 使用方法P10. BCA Protein Assay Kit 使用操作规程三、蛋白质电泳及凝胶染色操作规程（03）P1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳P3. 固相pH 梯度-SDS 双向凝胶电泳实验操作程序P5. 平衡及SDS-PAGEP7. Western blotting Protocol（辣根标记ECL 显色方法碱性磷酸酶标记显色方法\DAB 等）P8. 考马斯亮蓝染色操作规程P8. 银染操作规程P10. ELISA 操作规程P12. 非变性聚丙烯跣胺蛋白质电泳操作方法P14. 梯度SDS-PAGE 的灌制及电泳四、图象分析软件操作规程（04）1. Phoretix 2D v2003.02 胶图分析软件操作规程2. Imagemaster platinum v5.0 操作指南.pdf五、蛋白质酶解操作规程（05）P1. 有还原烷基化蛋白质消化操作流程P2. 双向电泳考染点无还原烷基化胶内消化操作流程P3. 全蛋白溶液消化操作规程六、蛋白质组培训文档资料（06）1. 双向电泳培训班讲义（bio-rad ）2. 蛋白质电泳实验技术（书---郭绕军）3. GE 双向电泳中文手册七、实验仪器操作规范（07）P1. 超声波细胞破碎仪使用规范P1. 精密电子天平使用注意事项P2. 磁力搅拌器使用注意事项P2. PH 计使用注意事项P3. Ettan Dalt n System 操作规程（Amersham）P4. ETTAN DALT SIX 操作规程（Amersham）P6. 扫描仪使用规范P6. SE600 电泳系统操作规程（Amersham）P7. MINIVE 电泳系统操作规程（Amersham）P7. MP3 电泳系统操作规程（bio-rad）P8. Mp3 PROTEAN DODECA （7 厘米12道系统操作规程,bio-rad）P8. PROTEAN II XI 系统操作规程（bio-rad）P9. PROTEAN PLUS DODECA CELL 系统操作规程（bio-rad）P10. 国产制冰机使用方法P10. 国产恒温干燥箱使用方法P11. 国产脱色摇床使用方法P11. 干胶仪使用方法P11. 国产三孔水浴锅使用规范P11. 进口恒温水浴操作规程P12. HETO 冻干机操作规程P13. 小型低温离心机使用及保养程序八、肽质指纹图数据搜索操作规程（08）九、常用试剂配方表（09）1. 常用试剂配方表.xls2. 几种溶液的配制方法.doc十、质谱学实验方法（10）（1）Agilent LC-MSD 操作流程（01）（2）Autoflex tof 操作流程（02）（肽质指纹图数据搜索操作规程）（3）Ettan TOF 操作流程（03）（4）Finnigan LCQ 操作流程（04）（5）Ultraflex tof/tof 操作流程（05）（6）毛细管反相色谱柱制作流程（06）（7）柱效测试（07）Page 3 of 3。
蛋白考染流程蛋白考染是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的定位和表达水平。
它通过使用特定的抗体与目标蛋白结合，然后使用染色剂或荧光标记来检测和可视化蛋白质。
以下是蛋白考染的一般流程。
1. 样品制备蛋白考染的第一步是样品制备。
样品可以是细胞培养物、组织切片或裂解的细胞。
在制备样品时，需要遵循标准的实验室操作规程，确保样品的纯度和完整性。
2. SDS-PAGE接下来，样品通常会经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离。
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离方法，通过根据蛋白质的大小将其分离成不同的带状条带。
这一步可以将样品中的蛋白质分离，从而方便后续的蛋白考染。
3. 转膜分离后的蛋白质需要转移到固体膜上，通常是聚偏氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素膜。
转膜可以通过静电作用或半湿法转移。
转膜的目的是固定蛋白质在膜上，以便进行后续的抗体反应。
4. 阻断转膜后，需要进行阻断步骤，以防止非特异性结合。
通常使用的阻断剂包括非脂类干奶粉、BSA（牛血清白蛋白）或其他蛋白质。
阻断的时间和温度根据具体实验条件而定。
5. 一抗孵育在阻断之后，需要加入第一抗体进行孵育。
第一抗体是与目标蛋白结合的特异性抗体。
孵育的时间和温度也是根据具体实验条件确定的。
第一抗体的浓度需要进行优化，以确保足够的特异性结合。
6. 洗涤孵育完第一抗体后，需要进行多次洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合物。
洗涤的缓冲液通常是含有盐和洗涤剂的缓冲液。
洗涤的次数和时间也是根据具体实验条件设定的。
7. 二抗孵育洗涤后，需要加入与第一抗体结合的二抗进行孵育。
二抗是与第一抗体结合的抗体，通常是反对应物。
例如，如果第一抗体是兔抗小鼠IgG，那么二抗就是羊抗兔IgG。
二抗通常标记有染色剂或荧光标记物，以便后续的可视化。
8. 再次洗涤二抗孵育后，需要进行再次洗涤步骤，以去除未结合的二抗和其他非特异性结合物。
洗涤的次数和时间与之前的洗涤步骤相似。
9. 可视化最后一步是对蛋白质进行可视化。
