基因操作原理与方法107页PPT

__T__4____DNA连接酶和__E_·_c_o_l_i _DNA连接酶。 (4)反转录作用的模板是__m__R__N_A_，产物是__c_D_N__A_______。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用__P_C__R___技术。
(5)基因工程中除质粒外，动_植___物__病__毒_和噬__菌__体__也可作为运载体。 (6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处 理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_未__处__理__的__大__肠__杆_。菌吸收
基考础点回探顾究
考点一 基因工程的原理及工具 [典例引领]
【典例】 (2012·课标，40)根据基因工程的有关知识，回答下 列问题。 (1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末 端类型有__平__末__端__和_黏__性__末__端_。 (2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下： AATT C……G G……CTTAA
分子杂交
抗原—抗体杂交 个体生物学水平
基考础点回探顾究
深度思考 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便 于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是— G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
请据图分析： 切割目的基因时宜选择限制酶Ⅰ还是限制酶Ⅱ切割质粒呢？ 请说明理由。
基考础点回探顾究
解析 (1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的 基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。(2)基因表达载体构建过程中， 需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使它们产生相同的 黏性末端，再用DNA连接酶把这两个DNA片段连接起来。 (3)农杆菌转化法导入目的基因时，首先必须用Ca2＋处理土壤 农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态；然后将重组质粒和感 受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。

这里所说的基因操作并不是一个法律概
念，除了包括基因克隆外，还包括基因
的表达，调控，检测等，与基因研究相 关的内容。
了解对基因的研究是如何实施的
二、本课程在学科发展中的地位
这门课以前叫“分子克隆I” 实验课为“分子克隆II”
利用分子生物学原理,为在分子或基因水 平的研究服务的学科
20世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于 认识了DNA的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学 研究的热潮。 在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过 程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平 同时由于遗传学的兴起与发展，DNA作为生命遗传 信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学 的诞生。
基因克隆的技术路线
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG... ...G ...CTTAA AATTC... G...
基因克隆的技术路线
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG... ...G ...CTTAA AATTC... G...
酶切 连接
酶切
基因克隆的技术路线
２．基因及其产物的非共线性
interrupted gene, intron
３．基因的重叠与可变性
三、基因的基本结构组成
• 编码区 ORF • 启动子 promoter
• RBS
ribosomal binding site
• 终止区 terminator
• flanking sequence
• upstream / downstream • Cap/tail
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG... ...G连接
酶切
基因克隆的技术路线

DNA重组的基本步骤包括：断裂DNA分子、交换DNA片段 和修复断裂的DNA。
克隆和重组技术的应用
克隆和重组技术广泛应 用于基因工程、生物制 药、农业和医学等领域 。
在基因工程中，克隆和 重组技术用于生产重组 蛋白、疫苗和抗体等生 物制品。
在农业中，克隆和重组 技术用于改良作物品种 和提高农作物的抗逆性 和产量。
生物科学研究
基因敲除和敲入技术可用于研究基因功能、细胞信 号转导、药物筛选等生物科学研究领域，有助于深 入了解生命活动的本质。
生物制药
基因敲除和敲入技术可用于生产基因工程药物，通 过改造或增强微生物、细胞或动物细胞中的基因表 达，生产具有特定功能的药物。
敲除和敲入技术的限制和挑战
80%
技术难度高
基因敲除和敲入技术需要精确的 操作和设计，对技术和实验条件 要求较高，且存在一定的失败率 和不确定性。
05
基因编辑新技术
CRISPR-Cas9系统
总结词
CRISPR-Cas9系统是一种高效、简单、低成本的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9 蛋白的引导，实现对特定DNA序列的切割和修复。
详细描述
CRISPR-Cas9系统利用向导RNA与目标DNA序列的特异性结合，将Cas9蛋白引导至目 标位置，通过切割DNA双链形成缺口，启动细胞内的DNA修复机制。在修复过程中， 插入、删除或替换特定DNA序列成为可能，从而实现基因敲除、敲入和点突变等基因
基因操作的历史与发展
基因操作技术的起源可以追溯到20 世纪70年代，当时科学家开始探索 限制性内切酶和DNA连接酶等工具 的应用。
随着技术的不断发展，基因操作逐渐 成为现代生物学和医学研究的重要手 段，广泛应用于基因克隆、基因治疗 、基因工程等领域。

连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN
在基因组编辑中的应用。
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ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成 的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂 (DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末 端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位 点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变 或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
端连接和同源重组修复 两条途径。
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4
• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修
复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随
机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的
基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的
基因敲入。
录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形
成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,
在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并
启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的
CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)
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基因编辑原理
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基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)
技术； 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like

原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生 在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
1.转化的原理与技术
（3）l噬菌体DNA的转染
感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600
吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟
5'
GCATGCCCCCC G
C GGGGGGACGTC
Klenow
Pst I
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
CTGCAGGGGGG C
5' 5'
5' 5'
3. 不同粘性末端的连接
5'
CTGCAG
GACGTC
PstI
5' 5'
5'
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5'
T4-DNA pol
切平
GGATCC CCTAGG
BamHI
5' GATCC G
Klenow
GGATCC
CCTAGG
5'
G CCTAG 5'
补平
5'
C
G
G
C
5'
T4-DNA ligase
80℃烘干固定影印薄膜 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：