2009-2010 学年生命科学学院《基因工程》期末试卷（B）答案要点一、名词解释题（每题3分，共30分）1、多克隆位点：一段短的 DNA 序列，含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点，是外源基因插入的位点。
2、穿梭载体：能够在两种以上的受体细胞中繁殖和扩增的载体。
3. DNA连接酶： DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH 与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。
4. 核酸分子杂交：主要是根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行的。
在一定条件下，单链DNA 或RNA 能与另一条单链DNA 上互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交形成双链DNA 分子。
通常利用已标记的某一DNA 或RNA 片段或合成一段寡核苷酸作为探针，探测重组DNA分子中是否有DNA片段与探针发生同源性杂交，然后利用放射自显影方法进行检测。
5. 融合蛋白：融合表达一般是将克隆化的基因引入某表达载体编码的高表达蛋白一起融合表达。
6. 基因敲除：利用同源重组的原理，通过载体将外源的失活的基因替换掉内源的正常的基因，从而使基因沉默而不表现突变性状的方法。
7. 反义核酸技术：利用反义DNA或反义RNA能够与内源mRNA互补杂交，从而抑制内源基因表达的技术。
8. 荧光定量PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。
9. 基因治疗就是指向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
10. 显微注射技术将在体外构建的外源目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA 的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。
二、单选题（每题2分，共20分）。
1. ①2. ②3. ③4. ③5. ②6. ①7. ④8. ④9. ② 10. ④三、填空题（每空1 分，共10分） 1. 外源基因/载体，载体/外源基因 2. 近, 远 3. 目的基因，表达 4. 质粒/噬菌体，噬菌体/质粒 5. 10kb，20kb四、简答题（每题6分,共24分）1. 构建cDNA文库时需要用到哪些工具酶？逆转录酶，DNA 聚合酶I 或Klenow 片断，单链核酸酶S1，末端转移酶，限制性核酸内切酶，DNA连接酶2. 简述进行菌落原位杂交的基本过程。
噬菌斑杂交法的基本步骤是将重组噬菌体感染的宿主菌倒在平皿上，待生成噬菌斑后，将与培养皿一样大小的硝酸纤维素薄膜盖在上面，每个噬菌斑中约105个噬菌体就影印转移到膜上。
膜揭下后，用碱处理除去蛋白质外壳，使噬菌体DNA变性并同膜共价结合，然后用同位素标记的探针与之杂交，放射自显影检测。
按照膜与培养基上预先做好的方法标记，将阳性噬菌斑挑出来扩增。
3. 基因芯片的主要应用是什么？ 1 寻找正常样本与异常样本之间在mRNA表达水平差异的基因(定量和定性); 2 寻找和研究参与某一特定功能的基因或基因群; 3 确定目的基因表达的时空性; 4 测序与点突变的确定。
4. 酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优缺点？优点：克服大肠杆菌表达系统的不足，能繁殖快，高密度发酵，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。
缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等。
例如甲醇酵母系统利用甲醇作为唯一碳源。
乙醇氧化酶将甲醇氧化为甲醛，乙醇氧化酶的启动子是强启动子，编码乙醇氧化酶的基因是AOX1合AOX2.AOX1基因的表达受甲醇严格调控，诱导表达水平可达30％以上。
五、问答题（每题8分，共16分）。
1. 肿瘤的产生可能是抑癌基因突变或表达失误造成，也可能是原癌基因突变或表达失误造成。
对肿瘤患者进行基因治疗时，应该采取哪些策略？ 1）增强机体对肿瘤细胞的免疫能力 2）植入敏感或自杀基因到肿瘤细胞。
所谓自杀基因治疗，就是将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有毒性的产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的。
3）阻断癌基因的表达，主要用反义RNA法，RNA干涉技术，核酶技术等，如Myc 基因的反义RNA片段。
4）应用肿瘤抑制基因如p53。
人类恶性肿瘤中p53基因突变率较高，用野生型的p53基因治疗肿瘤在模型动物上取得了显著的成功。
5）诱导正常组织产生抗肿瘤物质 6）保护正常组织免受化疗的影响――耐药基因治疗。
多药耐受MDR是指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物产生耐药的同时，也对其他结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。
耐药基因治疗是指将一些耐药基因转移至造血干细胞，以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可以用高剂量的药物杀死肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。
7）抑制肿瘤血管生成。
肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它所提供的氧气和营养物质，没有血管的生成，肿瘤最大也只能长至1－2mm3。
通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长，防止肿瘤的转移。
VEGF是肿瘤诱导血管生成过程中的一个重要的调节因子，它可选择性刺激内皮细胞分裂，并能增加微血管的通透性。
通过阻断VEGF的翻译和转录过程可使它的产生受到抑制。
如引入反义VEGF的cDNA基因，通过与VEGF 的mRNA 结合，来抑制VEGF蛋白的翻译。
2. 有哪些方法可以将外源目的基因转移到植物体内？你认为转基因农作物的潜在的安全隐患主要表现在哪些方面? 外源基因转移到植物系统的方法： 1）化学刺激法 PEG、PNA、磷酸钙、氯化钙等化学试剂等处理原生外源DNA。
2）电击法在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，使得外源DNA 容易进入细胞内。
原生质体不受伤害，而且膜孔可恢复。
3）显微注射法借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接注射到受体细胞。
4）基因抢法基因枪法，也称微粒轰击法，是将DNA 包被到金粒或钨粒中，然后把这些粒子加速推进靶细胞。
5）脂质体介导法质体，可使其捕获是将DNA 或RNA 包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。
转化效率较高，简单易操作，重复性好。
6）微激光束法利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。
7）花粉通道法将外源DNA 片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA 沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。
8）农杆菌介导法通过Ti质粒将外源基因导入植物体内的方法。
潜在的安全隐患：① 增加杀虫剂的使用。
由于转基因生物可能造成的影响是抗药基因的特性选择和转移或漂流到可相容的其他植物中，形成抗性杂草或超级杂草，具有很强的抗药性。
② 产生新的农田杂草。
其原因是由于基因漂流或基因逃逸，如通过昆虫传播花粉引起杂交或基因污染，使近缘种变成新杂草或超级杂草。
转基因植物自身变为杂草。
由于插入性状的竞争而演变退化为杂草。
③ 产生新的病毒。
由于不同病毒基因组和转基因作物的病毒外壳蛋白重组而出现新型病毒。
④ 产生新的作物害虫。
由于病原体与转基因植物相互作用或是草食动物与转基因植物相互作用而出现的新型转基因害虫。
比如常见害虫产生抗性，并进化增强。
⑤ 对非目标生物的伤害。
⑥ 侵入到新的栖息地。
通过昆虫、鸟类、风力等媒介使转基因花粉四处扩散，造成基因污染，威胁生物多样性安全。
⑦ 丧失生物多样性。
转基因生物通过生存竞争、环境胁迫或其他不确定性因素增加的影响（基因、种群或物种），使生物多样性受损害或者丧失。
⑧ 增大土壤流失。
《基因工程》考试大纲基因工程》课程编号：15010094 总学时数：51学时理论＋34学时实验学分：3 学分（理论）＋2学分（实验）一、考试要求理论课考试要求掌握基因工程相关的基本概念，基因工程操作的基本流程，常规基因工程技术的基本原理、基本流程与主要应用，基因表达系统的原理，转基因植物与转基因动物的基本制作方法，基因治疗与蛋白质工程的基本原理等。
实验课考核结合平时实验进行。
二、理论课考试内容第一章基因工程概述基因工程的基本概念，基因工程的基本流程，基因工程诞生的条件与标志，基因工程的发展简史以及基因工程有哪些主要应用。
第二章基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足的基本条件，质粒载体的主要特征和主要类型，噬菌体载体的类型和特点，不同载体的携带能力，人工微小染色体的概念，类型和获得途径。
穿梭载体的概念，表达载体的概念等等。
以及限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项，DNA 聚合酶和 Klenow 大片段的作用，DNA 连接酶的作用及连接过程，碱性磷酸酶的作用及用途，末端脱氧核苷酸转移酶的用途和作用等。
第三章基因工程的常规技术琼脂糖凝胶电泳的原理和影响因素；核酸分子杂交的概念，探针的类型，探针标记方法；比较探针的间接标记与直接标记的优点；掌握Southern 杂交、Northern 杂、Western 杂交及菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程与主要目的；PCR 技术的基本原理；PCR 反应体系的主要成分与主要程序；提高PCR 反应特异性的因素和措施；逆转录PCR、巢式ＰＣＲ、反向PCR、多重PCR 及荧光定量PCR 的概念和应用；基因芯片技术的概念、原理和主要的应用；蛋白质芯片的概念和应用；基因组文库的概念和构建方法， cDNA 文库的概念和构建流程，构建cDNA 文库需要用到哪些工具酶，合成 cDNA 第二条链有哪些方法等等；酵母双杂交系统的基本原理和应用；Sanger 双脱氧链终止法DNA 测序和Maxam-Gilbert 化学修饰法测序的基本原理，DNA 自动测序的基本原理等等。
第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达基因的表达系统的组成；基于T7 噬菌体RNA 聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统的主要优点；蛋白质的融合表达的原理、蛋白质融合表达的优缺点；蛋白质的分泌型表达的原理和优缺点；蛋白质的包含体形式表达的概念和优缺点。
蛋白质包含体复性的方法有哪些？利用大肠杆菌表达系统如何表达人胰岛素？酵母表达系统有哪些优缺点？甲醇酵母表达系统的主要特点。
组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达过程等。
第五章转基因植物植物细胞培养技术有哪些，植物转基因技术的基本路线；植物转基因的受体系统的类型；外源基因导入植物的方法； Ti 质粒的结构特点、Ti 质粒介导植物基因转移的过程。
植物转基因载体的报告基因，提高外源基因在植物体内表达水平的策略。
抗虫转基因植物的概念，抗病毒转基因作物，抗细菌和真菌的转基因作物、抗除草剂转基因作物、抗非生物胁迫的转基因作物的概念等。
植物生物反应器的概念。
