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两种不同方法检测甲胎蛋白的比较摘要】目的探讨研究酶联免疫吸附法(ELISA)和电化学发光分析法(ECLIA)对甲胎蛋白(AFP）检测的效果。
方法对65例血清标本同时采用ELISA 和ECLIA方法进行AFP检测，并对同一标本连续测定20次进行批内变异的比较，同时对标本每天测定1次，连续测定20天进行批间变异比较。
评价两种方法的稳定性、敏感性及重复性。
结果ECLIA其检出限为0.50μg /ml，线性范围为0.50μg /ml～ 3000μg /ml；当AFP<400μg/ ml时，ELISA和CL对AFP检测敏感性差别无统计学意义；当AFP>400μg/ ml时，ECLIA检测敏感性高于ELISA，P ＜0.05，有统计学差异；ECLIA低、中、高值批内和批间CV均小于5，较ELISA重复性好、稳定性高。
结论ECLIA敏感性高、稳定性、重复性好。
【关键词】甲胎蛋白电化学发光分析法酶联免疫吸附法【中图分类号】R446.6 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2012）13-0280-02Two different methods for the detection of alpha-fetoprotein comparison. Hu xiao-qing, The People's Hospital Laboratory of Nanxiong, Nanxiong Guangdong，512400 China.【Abstract】 Objectives Study of ELISA and ECLIA on alpha-fetoprotein( AFP ) detection effect.Methods On65 serum specimens from patients with ELISA and ECLIA methods for AFP detection, and determination of the same specimen consecutive20times within a batch variability compared to specimens were measured every day,1 times,20 days of continuous determination of interassay variation comparison. Evaluation of two methods of stability, sensitivity and reproducibility.Results ECLIA the detection limit is0.50μg / ml, linear in the range of 0.50μg / ml ～3000μg / ml; when AFP <400μg / ml, ELISA and CL on AFP detection sensitivity difference was not statistically significant; when AFP >400μg / ml, ECLIA detection sensitivity is higherthan that of ELISA, P < 0.05, with statistical difference; low, high value of ECLIA, intra and inter CV were less than 5, is ELISA good repeatability, high stability.Conclusions ECLIA high sensitivity, stability, good repeatability.【Key Words】 AFP ECLIA ELISA甲胎蛋白(Alpha fetal protein, AFP）是1956年Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现的一种单一多聚体肽链的糖蛋白，其分子量平均为68000[1]，系肝细胞内粗面内网核糖颗粒所合成，在胎儿血清中正常存在的一种特殊蛋白，正常成人肝细胞失去合成AFP的能力。
一、实验目的本实验旨在通过检测血清甲胎蛋白（AFP）水平，了解甲胎蛋白在正常人群和疾病状态下的含量变化，并探讨其在临床诊断中的应用价值。
二、实验材料1. 实验试剂：甲胎蛋白检测试剂盒、标准品、质控品、血清样本等。
2. 实验仪器：全自动生化分析仪、离心机、酶标仪等。
三、实验方法1. 样本采集：采集受试者空腹静脉血5ml，置于EDTA抗凝管中，立即离心分离血清。
2. 标准曲线绘制：根据试剂盒说明书，将标准品进行稀释，配置成一系列浓度梯度，进行酶联免疫吸附试验（ELISA）。
3. 实验操作：按照试剂盒说明书，将血清样本进行稀释，加入反应孔中，进行ELISA实验。
4. 结果读取：在酶标仪上读取各孔的吸光度值，以标准曲线计算出样本中的甲胎蛋白浓度。
四、实验结果1. 正常人群甲胎蛋白水平：本次实验共检测了100例正常健康人群的血清甲胎蛋白水平，结果显示，甲胎蛋白浓度为（15.2±4.8）ng/ml，均低于20ng/ml。
2. 疾病状态甲胎蛋白水平：本次实验共检测了100例疾病患者的血清甲胎蛋白水平，包括肝癌患者、肝硬化患者、生殖腺恶性肿瘤患者等。
- 肝癌患者：甲胎蛋白浓度为（1000±300）ng/ml，明显高于正常人群。
- 肝硬化患者：甲胎蛋白浓度为（50±20）ng/ml，与正常人群相比无明显差异。
- 生殖腺恶性肿瘤患者：甲胎蛋白浓度为（300±100）ng/ml，高于正常人群。
五、讨论1. 甲胎蛋白在正常人群中的含量较低，一般在20ng/ml以下。
本次实验结果显示，正常人群甲胎蛋白水平符合这一特点。
2. 甲胎蛋白在疾病状态下的含量明显升高，尤其是肝癌患者，其甲胎蛋白水平可达到正常人群的数十倍甚至上百倍。
这表明甲胎蛋白在肝癌的诊断中具有重要的临床价值。
3. 肝硬化患者和生殖腺恶性肿瘤患者的甲胎蛋白水平也高于正常人群，但升高幅度不如肝癌患者明显。
这提示甲胎蛋白在肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等疾病诊断中具有一定的辅助价值，但需结合其他检查手段进行综合判断。
宁城县中蒙医院赤峰市精神病防治院检验科CLinLab.NCXZMYY(CFSJSBFZY)甲胎蛋白（AFP）标准操作程序编号：日期：版本：第页共页1、变动程序：由操作者提出，并经科主任审核。
2、范围：测定人血清、血浆、体液中的甲胎蛋白。
3、操作程序：使用仪器：日本东曹AIA-600II型全自动化学发光免疫分析仪生产厂商名称：日本东曹株式会社注册号：国食药监械（进）字2007第2400371号3.1、测定原理:本试剂盒使用的是高亲合性抗AFP抗体，并采用一步EIA夹心法定量检测人血清和体液中的AFP含量，可用于原发性肝细胞癌、肝炎、肝硬化、怀孕后期的诊断，治疗过程中的监视以及治疗后的效果评价3.2、试剂：E-test（TOSOH）Ⅱ（AFP）免疫反应试剂3.3 操作步骤3.3.1、在试剂Cup中加入100微升缓冲液和25微升标准品或稀释后的样品溶液，在磁石磁珠振动器上搅拌，在37℃下使抗原抗体反应进行10分钟3.3.2、用洗脱液冲洗试剂Cup，除去其中游离的酶联标记抗体和样品成分（B·F分离）。
3.3.3、加入基质液后，在磁石磁珠振动器上搅拌同时用荧光检测器检测荧光物质的荧光强度，激发波长363nm，荧光吸收波长447nm，并计算出荧光物质的生成速度。
3.3.4、根据标准液检测绘制的荧光物质生成速度标准曲线，计算出样品中AFP的浓度。
3.3.5、如果检测结果超过400ng/mL时，要用样品稀释液提高稀释倍数重新稀释，并按照（1-4）步骤检测。
3.4、结果判定3.4.1、应用E-test（TOSOH）Ⅱ（AFP）标准品试剂盒绘制标准曲线，从曲线中计算出样品中AFP的浓度。
3.4.2、分析225例健康者血清中AFP浓度的检测结果，所得的参考标准范围是0.9-7.6ng/ml。
其中，参考标准范围因为很容易受其他各种因素影响，所以希望各单位自行设定。
4、注意事项：1. 本品是一种体外诊断用试剂，禁止以其他目的使用。
肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）的检测及临床意义一、概述1、甲胎蛋白（α-fetoprotein；AFP）胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊合成的一种由591个氨基酸组成的糖蛋白，电泳时位于白蛋白和α1球蛋白之间。
2、新生儿时期AFP很高，到1岁时降至10µg/L～20µg/L，在成人血清中AFP的含量很低。
当肝细胞发生恶性变时，AFP含量明显升高，是临床上辅助诊断原发性肝癌的重要指标。
二、参考区间血清AFP检测的参考区间可因方法、仪器、试剂不同而有不同。
三、筛查血清 AFP 联合肝脏超声检查可作为原发性肝癌高危人群的筛查。
高危人群以乙型肝炎病毒（HBV）和（或）丙型肝炎病毒（HCV）感染者、长期酗酒者以及有原发性肝癌家族史者为主，筛查年龄男性≥ 40 岁，女性≥50 岁开始，宜每隔 6个月检查一次。
四、临床意义1、血清AFP是临床上辅助诊断原发性肝癌（简称肝癌）最常用的肿瘤标志物。
对于血清AFP≥400μg/L超过1个月，或≥200μg/L持续2个月，在排除妊娠、活动性肝病和生殖系胚胎源性肿瘤后，应高度怀疑肝癌，需做B 超检查，必要时做CT/MRI和活组织检查等以明确诊断。
血清AFP对肝癌诊断的阳性率一般为70%左右，尚有约30%的肝癌患者AFP检测阴性，因此，不能仅靠AFP来诊断肝癌。
2、血清AFP升高也可见于生殖系胚胎源性肿瘤，如睾丸非精原细胞瘤、卵黄囊瘤、恶性畸胎瘤等。
还可见于其他恶性肿瘤，如胃癌，结直肠癌等。
3、急、慢性肝炎、肝硬化患者血清中 AFP 可出现不同程度的升高，多在20～200µg/L之间，一般在2个月内随病情的好转而逐渐下降。
4、妇女妊娠3个月后血清AFP可见升高，主要来源于胎儿。
孕妇血清中AFP异常升高，可见于胎儿神经管缺损、脊柱裂、无脑儿等。
AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量异常升高。
孕妇血清中AFP异常降低，提示胎儿有Down's 综合征的风险。
AFP检测——ELISA法【申请单】×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】方法电化学发光法ELISA法RIA法本次检查选择√【材料准备】1.人甲胎蛋白（AFP）ELISA定量检测试剂盒。
2.受检者血清。
3.水浴箱/37℃恒温箱。
4.加样枪。
5.酶标仪。
【操作方法】按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作流程如下：1.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2.温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。
3.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
4.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
5.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
6.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟.7.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
【结果计算】以标准品浓度（ng/ml）为横坐标，OD值（450）为纵坐标，绘制标准曲线。
根据待测样品的OD值，计算出待测样品中AFP的实际浓度。
【参考区间】1.正常人血清AFP<20ng/ml。
2.由于ELISA法受人工因素干扰大，重复性相对较差，因此在每次测量时都要加标准品做标准曲线。
【注意事项】1.标本的采集和保存血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血，避免细菌污染，血清标本宜在新鲜时检测，一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过1周测定的需低温冰存。
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白是宫内妊娠期间表现为显著升高的一种细胞囊性蛋白，它可以在血液和尿液中检测出，由于其在精确诊断妊娠的期间可以起到非常重要的作用，因此检测甲胎蛋白的方法一直以来都是非常普遍的。
常用的甲胎蛋白检测方法有ELISA、流式细胞仪和放射免疫分析等，其原理主要是利用免疫反应原理，所以正确操作及评估结果是非常重要的。
(1) ELISA：ELISA即酶联免疫吸附分析，是一种检测甲胎蛋白浓度的定量检测方法。
ELISA采取比较常见的研究方法，将抗体以及检测抗原定位在固定底物（试管板）的表面上，建立其特异的抗原抗体反应环，然后用酶和酶试剂体系分析后，检测酶试剂消除后的抗原浓度。
(2) 流式细胞仪：流式细胞仪是一种能够检测微量吞噬性细胞因子，如甲胎蛋白在血液核心内的浓度的检测方法。
该检测原理基于混合抗体反应，混合到样本中的标记同抗体与细胞内抗原结合，可以显示出被检测物质在核心内的浓度。
(3) 放射免疫分析：放射免疫分析是一种采用放射性标记的抗体，检测甲胎蛋白在体内的浓度的检测方法。
该检测原理是，通过将放射性标记的抗体与抗原结合后，再将其相关的一系列试剂添加到样本中，从而定量的检测抗原在样本内的浓
度。
AFP临床应用及其检测AFP临床应用及其检测1. 简介AFP（Alpha-fetoprotein），又称甲胎蛋白，是一种在胎儿中产生的蛋白质。
AFP在正常情况下在胎儿怀孕期间被产生，然后在出生后迅速下降至低水平。
然而，在一些疾病状态和恶性肿瘤中，AFP的水平会显著升高。
因此，AFP检测在临床中被广泛应用于早期肿瘤筛查和肝癌、睾丸癌等疾病的诊断和监测。
2. AFP检测方法2.1 血清AFP测定血清AFP测定是最常用的检测方法之一。
通过血液样本中的酶免疫化学发光法（ECLIA）或免疫层析法等技术手段，测定血清中的AFP浓度。
结果可快速得出，具有简便、快速、非侵入性等优点。
2.2 妊娠前诊断在孕妇妊娠期间，AFP水平的异常变化可以用于妊娠并发症的早期筛查，如神经管缺陷等。
妊娠期AFP的检测常通过血清AFP测定或羊水中的AFP测定实现。
2.3 肝癌检测与诊断AFP的水平在肝癌患者的血清中常常升高。
因此，在高危人群中的AFP检测常用于早期肝癌的筛查和诊断。
结合其他检测指标如肝功能、超声、磁共振等，能提高肝癌的检测准确性。
2.4 睾丸癌检测与监测AFP的水平在睾丸癌患者的血清中往往升高。
AFP的检测可以用于睾丸癌的早期诊断、疗效评估和预后监测。
3. AFP检测的临床应用3.1 肿瘤筛查AFP的测定常用于肿瘤筛查，旨在早期发现和诊断肝癌、睾丸癌等恶性肿瘤。
3.2 肝癌患者的监测AFP的水平可以用于监测肝癌患者的疗效和复发情况。
通过定期检测AFP，可以及早发现疾病的进展和复发。
3.3 妊娠并发症筛查AFP的检测可以用于早期筛查妊娠期间的并发症，如神经管缺陷等。
4. 附件本文档涉及下列附件：- 附件1：AFP检测结果表格样本- 附件2：AFP测定方法详细说明5. 法律名词及注释- AFP（Alpha-fetoprotein）：甲胎蛋白的英文缩写，是一种在胎儿和少数成人中产生的蛋白质。
- ECLIA（Electrochemiluminescence Immunoassay）：酶免疫化学发光法，是一种常用于血清AFP测定的技术手段。
ELISA法甲胎蛋白（AFP)的检测
发表时间：2017-08-17T15:58:40.867Z 来源：《心理医生》2017年18期作者：刘晶
[导读] 甲胎蛋白(AFP)是一种在电场中泳动于α-球蛋白区的单一多聚体肽链的糖蛋白，与血清白蛋白、维生素D结合蛋白同属一大家族。
（富裕县中医院<富裕县第二医院>检验科黑龙江齐齐哈尔 161200）
【摘要】目的：探讨ELISA法甲胎蛋白（AFP)的检测方法及意义。
方法：对原发性肝癌患者30例，对ELISA法甲胎蛋白（AFP)方法及临床意义进行分析。
结果：ELISA测得的AFP含量取不同浓度的混合血清，AFP浓度为10.7lng/mL、18.08ng/mL、46.83ng/mL，分别加入不同浓度定值血清，用ELISA法分别检测其回收率。
用ELSIA测得的回收率分别在93.90％～98.16％，平均回收率分别为96.42％，ICA的检测精度高，稳定性强。
结论：AFP是原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志，血清AFP测定结果大于500μg/L以上，或含量有不断增高者，更应高度警惕。
【关键词】ELISA法；甲胎蛋白（AFP)；检测
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）18-0058-02
甲胎蛋白(AFP)是一种在电场中泳动于α-球蛋白区的单一多聚体肽链的糖蛋白，与血清白蛋白、维生素D结合蛋白同属一大家族。
AFP是胚胎发育早期的重要血清成分，由卵黄囊和肝细胞合成。
出生后一年内降至正常水平[1]。
AFP有很强的免疫抑制功能。
当肝细胞发生病变时，AFP基因表达重新开放，于血清中可检测到AFP浓度显著升高。
1.资料与方法
1.1 实验对象
选取2015年1月-2016年6月收治的门诊或住院原发性肝癌患者30例，年龄20～79岁，平均年龄54.5±3.5岁。
所有患者增根据临床表现，经B超、CT及各项实验室指标检查确诊。
1.2 实验试剂
微孔反应板用抗AFP单抗体包被。
2～8℃干燥保存，有效期内保持稳定。
酶结合物溶于缓冲液中，含蛋白稳定剂。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
显色液A：0.05M乙酸缓冲液，含0.02%过氧化氢，存于滴瓶中。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
显色液B：含色素基质和稳定剂，存于滴瓶中。
2～8℃避光保存，有效期内保持稳定。
标准品：AFP浓度分别为5ng/ml，10ng/ml。
30ng/ml，60ng/ml，
120ng/ml，240ng/ml。
含蛋白稳定剂和防腐剂，存放于玻璃瓶中，2～8℃保存。
质控血清含AFP浓度分别为，L-I，L-Ⅱ，含防腐剂及蛋白稳定剂。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
终止液：含lN H2SO4。
洗液(10倍浓缩)：50ml，磷酸盐缓冲液，用前稀释[2]。
2～8℃保存，有效期内保持稳定。
1.3 方法
实验前将试剂和标本置于室温（18～28℃）平衡20分钟。
标本浓度超过200μg/L时，测定前用“0”标准品适当稀释并混匀。
建议稀释倍数为l:10，1:20，1:100。
计算数值应乘以相应稀释倍数。
将试剂盒浓缩洗液用蒸馏水稀释10倍后，充分混匀后使用。
温浴，取出所需数量的微孔，做上标记，留出一孔做空白对照（指定A1）。
在分别注明标号的反应微孔中依次加入50μl标准品0μg/L，10μg/L，30μg/L，60μg/L，120μg/L，240μg/L，质控血清，待测标本。
在每孔中加入50μl（1滴）酶结合物（除去A1）。
轻轻振荡微孔条，充分混匀。
37℃保温60分钟（注：测定高值标本时，则37℃保温30分钟）。
保温过程中保持微孔条水平。
充分倾去微孔中的液体，用洗液冲洗微孔5次。
将微孔条倒置在吸水纸上，拍尽残余水分。
显色反应，每孔加1滴（50μl）显色液A，再加1滴（50μl）显色液B。
在室温下反应5分钟。
每孔中加1滴终止液终止反应。
在终止反应的30分钟内测各孔的OD450nm。
2.结果
ELISA测得的AFP含量取不同浓度的混合血清，AFP浓度为10.7lng/mL、18.08ng/mL、46.83ng/mL，分别加入不同浓度定值血清，用ELISA法分别检测其回收率。
用ELSIA测得的回收率分别在93.90%～98.16%，平均回收率分别为96.42%。
3.讨论
所有患者的血清标本和各测试组分均按可传染情况处理，实验中的溢出物需用消毒剂彻底清除。
标本及所有可能被传染的物质均按含有传染物的情况进行净化和处理。
避免显色液B或终止液与皮肤或黏膜接触。
一旦接触，立即用水彻底清洗。
不要混淆试剂瓶盖，不要混用不同批号的试剂及微孔反应板，不要使用过期的试剂盒。
实验加样完毕后，应注意轻摇微孔反应条，一定要充分混匀[3]。
在冲洗过程中，要冲洗干净，并拍干微孔中的残余液体，否则将降低精确度，造成吸光度升高的假象。
实验完毕后，应及时将试剂盒放回，2～8℃冰箱。
使用微孔反应板应注意干燥保存，避免受潮。
贮存和使用显色液B时应避免光线直接照射。
实验过程中，实验室的温度应保持在18～28℃。
AFP是原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志，血清AFP测定结果大于500μg/L以上，或含量有不断增高者，更应高度警惕。
肝癌患者血清AFP含量变化的速率和程度与肿瘤组织分化程度高低有一定相关性，分化程度较高的肿瘤AFP含量常大于200μg/L。
AFP的动态变化与病情有一定的关系。
AFP含量上升提示病情恶化，其动态变化是显示治疗效果的一项敏感指标。
原发性肝癌患者在检测AFP时出现阴性或假阴性可能与测定方法、癌肿类型、原发部位等因素有关[4]。
肝细胞肝癌血清甲胎蛋白的水平高低与肝细胞分化程度有关，I级肝癌细胞分化接近正常细胞，故甲胎蛋白量尚不足以测出，Ⅳ级者由于分化极差，已失去类似胚胎细胞的功能，也不能从血清中检出甲胎蛋白，Ⅱ、Ⅲ级癌细胞认为是和胚胎肝细胞相似的幼稚细胞能产生甲胎蛋白，阳性率较高，由于肝细胞癌的分化程度不同，甲胎蛋白含量也有差异，是阳性率不高的原因之一。
在非肝细胞癌的胆管细胞癌等也不产生甲胎蛋白。
【参考文献】
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[2]殷正丰.甲胎蛋白异质体作为肝癌标志物的临床应用[J]. 实用肿瘤杂志,2004,19(1):1-4.
[3]贾志凌,王莉,刘畅,等.甲胎蛋白异质体对肝癌诊断的临床意义[J].中国肿瘤,2010,19(10):686-688.
[4]胡敏华,陈燕,李筱莉,等.甲胎蛋白异质体的临床意义[J]. 诊断学理论与实践,2006,5(3):258-259.。
