微生物实习--_肠杆菌科_1_

一、实验目的1. 了解大肠杆菌的生物学特性。

2. 掌握大肠杆菌的分离、纯化和鉴定方法。

3. 掌握大肠杆菌的培养和计数方法。

二、实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是肠杆菌科的一种细菌，广泛存在于人体肠道中。

本实验通过分离、纯化和鉴定大肠杆菌，了解其生物学特性，并掌握其培养和计数方法。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜粪便、营养琼脂平板、营养肉汤、无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、无菌培养皿、无菌移液器、酒精灯、显微镜等。

2. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、无菌操作台等。

四、实验方法1. 大肠杆菌的分离（1）取新鲜粪便样品，用无菌生理盐水进行稀释。

（2）取适量稀释液，用无菌棉签涂布于营养琼脂平板上。

（3）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

2. 大肠杆菌的纯化（1）观察平板上的菌落，挑选单菌落，用无菌移液器移至新的营养琼脂平板上。

（2）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

3. 大肠杆菌的鉴定（1）观察纯化后的菌落，记录菌落特征，如大小、形状、颜色等。

（2）将纯化后的菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。

（3）取培养液，用显微镜观察细菌形态，并进行革兰氏染色。

（4）对培养液进行生化试验，如乳糖发酵试验、吲哚试验等。

4. 大肠杆菌的培养与计数（1）将纯化后的菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。

（2）用无菌移液器取适量培养液，进行系列稀释。

（3）取稀释液，涂布于营养琼脂平板上。

（4）将平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。

（5）观察平板上的菌落，记录菌落数，并计算大肠杆菌的浓度。

五、实验结果与分析1. 大肠杆菌的分离：在平板上观察到圆形、光滑、白色、半透明的菌落，说明已分离出大肠杆菌。

2. 大肠杆菌的纯化：经过纯化后，菌落特征与分离菌落相同，证明已得到纯化的大肠杆菌。

3. 大肠杆菌的鉴定：通过显微镜观察，发现细菌为革兰氏阴性短杆菌，生化试验结果显示该菌株能发酵乳糖，产生吲哚，表明已鉴定为大肠杆菌。

一、实验目的1. 掌握肠道杆菌的生理生化特性。

2. 熟悉并掌握肠杆菌科细菌的鉴定方法，如IMViC试验等。

3. 通过实验，提高对微生物学实验技能的运用和操作能力。

二、实验原理肠杆菌科细菌是一类革兰氏阴性、无芽孢、无荚膜的杆菌，广泛分布于自然界、人和动物的肠道中。

本实验通过对肠杆菌进行一系列生理生化试验，包括吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、V.P试验（V）、柠檬酸盐利用试验（C）等，以鉴定和区分不同肠杆菌科细菌。

三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌等。

2. 培养基：蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、柠檬酸盐培养基、双糖铁培养基等。

3. 试剂：吲哚试剂、甲基红试剂、V.P试剂、40%KOH、-茶酚、溴麝香草酚蓝、苯酚红等。

4. 仪器：酒精灯、试管、试管架、烧杯、量筒、接种环、接种针、无菌玻片、显微镜等。

四、实验方法1. 吲哚试验（I）（1）将试验菌接种于蛋白胨水培养基，37℃培养24小时。

（2）取1 mL培养液，加入1 mL乙醚，充分振荡，使乙醚层浮于培养液表面。

（3）沿管壁加入吲哚试剂10滴，静置片刻。

（4）观察培养液颜色变化，呈玫瑰红色为阳性，不变色为阴性。

2. 甲基红试验（M）（1）将试验菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基，37℃培养24小时。

（2）沿管壁加入甲基红试剂3-4滴。

（3）观察培养液颜色变化，呈红色为阳性，黄色为阴性。

3. V.P试验（V）（1）将试验菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基，37℃培养24小时。

（2）加入40%KOH 10-20滴，再加入等量-茶酚，用力振荡。

（3）37℃培养4小时后观察，仍无色产生为阴性。

4. 柠檬酸盐利用试验（C）（1）将试验菌接种于柠檬酸盐培养基斜面上，37℃培养24-28小时。

（2）观察培养基颜色变化，若含有溴麝香草酚蓝的斜面呈现蓝色为阳性，呈绿色为阴性；含苯酚红的斜面呈现红色为阳性，呈黄色为阴性。

五、实验结果1. 吲哚试验：大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

实验三：肠杆菌科的检验一、接种细菌：MAC培养基接种大肠埃希菌和变形杆菌，SS培养基接种福氏志贺菌和乙型副伤寒沙门菌，采用分区划线法，放在35℃温箱中培养18—24h。

二、观察肠道杆菌在MAC和SS平板上的菌落形态。

1、SS平板：1）福氏志贺菌形成无色、半透明、光滑、湿润、突起、直径为1—2mm大小的菌落；2）乙型副伤寒沙门菌为中心带黑褐色，其余部分为半透明、光滑、湿润、突起的小菌落2、MAC平板：1）大肠埃希菌形成红色、圆形、凸起、边缘整齐、多数为光滑型的菌落。

中等大小。

2）变形杆菌为圆形、扁平、无色、半透明的菌落。

三、涂片、革兰染色将玻片分为四个区域，并分别标记，将四种肠道杆菌分别在四个区域内的生理盐水中研磨，待其自然干燥后固定，采用“改良快速法”进行染色，结果如图所示：福氏志贺菌乙型副伤寒沙门菌变形杆菌大肠埃希菌G-杆菌G-直杆菌，较细长G- 杆菌G-直短杆状显微镜检查特征为革兰阴性杆菌，肠杆菌科多数细菌的形态及染色性相似，根据形态及染色性难以相互鉴别。

四、生化试验：1、氧化酶试验（纸片法）：在滤纸条上滴一滴氧化酶试剂，用无菌接种环挑取待测菌落在滤纸条上滴了试剂的部位研磨，；滤纸变为红色则为阳性，不变色为阴性，结果表明，以上四种肠道杆菌的氧化酶试验均为阴性。

2、接种KIA、MIU上。

五、2、微量生化：六、沙门菌、志贺菌的血清学鉴定：1、在洁净载玻片上两端分别滴加一滴志贺菌四种多价血清和福氏四价血清，各取一环志贺菌在两种血清上研磨10S，观察两组结果均出现肉眼可见的凝集物，提示该菌为福氏志贺菌。

2、采用同上方法，在洁净玻片上分别在其两端滴加一滴沙门菌多价O（A—F）和Hd血清，各取一环待测菌与之混合，研磨10S，几分钟后观察两组结果，出现肉眼可见的颗粒状凝聚物表示该菌为乙型副伤寒沙门菌。

七、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。

微生物检验-肠杆菌科笔记一、共性(一)【形态染色】●G –中等大小杆菌或球杆菌●多数有鞭毛，有动力，除“三个半”：克雷伯菌、志贺菌、鼠疫、小肠耶氏菌●小肠耶尔森菌25℃阳性, 35℃阴性●少数有荚膜，无芽胞●动力：志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌阴性（无鞭毛）(二)【培养】●兼性厌氧●营养要求不高，普通培养基或麦康凯均能生长●常用选择培养基或鉴别培养基双糖铁琼脂（红－黄－黑）（乳糖、葡萄糖）上层红色原因：发酵糖类和分解蛋白胨产生的胺中和了。

●麦康凯（红－无色））（乳糖）红色表示发酵乳糖产酸 S●S琼脂（红－无色－黑）（乳糖）柠檬酸铁产黑(三)生化反应※●1.发酵葡萄糖●2.氧化酶－（邻单胞菌除外）●3.触酶＋●4.硝酸盐还原试验＋●吲哚阳性：大肠、爱德华菌属、摩根菌属、邻单胞菌属、普通变形杆菌、普罗威登斯菌属大爱魔林普阳气呼呼（产气，弧菌+）●H2S阳性：沙门菌属、变形杆菌属、弗劳地枸橼酸杆菌、爱德华菌属老刘爱杀蝙蝠●VP阳性（葡萄糖酸盐）：克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、肠杆菌属、沙雷菌属让VIP客人赴长沙●尿酶阳性：摩根菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属（摸个遍）●甲基红阴性：肠杆菌属、克雷伯菌属（抢客人）(四)致病●侵袭力：K（Vi）抗原：保护菌毛：粘附、侵袭肠粘膜●内毒素：毒性部位在类脂A，所有革兰阴性杆菌产生的内毒素一样，引起如发热、休克、DIC等。

●肠毒素（外毒素）：大肠、志贺、鼠疫耶尔森二、埃希菌属(一)【概述】正常菌群，可以合成人类不能合成的微生物，例如B1、B2(二)【形态特征】革兰阴性短杆菌，不规则排列，有鞭毛、菌毛、有些有荚膜(三)【培养特性】兼性厌氧●在普通营养琼脂上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落，有特殊气味。

●麦康凯和SS琼脂平板发酵乳糖形成红色菌落(四)【生化反应】●发酵多种糖产酸产气●在克氏铁琼脂（KIA）上斜面和底层均产酸、产气，●H2S阴性（AA+-）●吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐（IMVC）等4个试验的结果为++--●在动力、吲哚、脲酶（MIU）结果为++-(五)【ESBL超广谱β内酰胺酶（耐药）】三、沙门菌属(一)【概述】人类食物中毒的主要病原之一。

肠杆菌科及检验● 考点概述概念；命名与分类原则；共同特点；自然与人体内的分布；微生物学检查方法；临床意义。

埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属及其他肠杆菌科细菌。

生物学性状；微生物学检验；临床意义。

【内容讲解】一、概述（共性）肠杆菌科是由多个菌属组成，G-杆菌，生物学性状相似。

大多数肠道杆菌属于正常菌群。

当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。

部分为致病性细菌。

（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。

主要根据细菌的形态、生化反应、抗原性质以及核酸相关性进行分类。

根据《伯杰系统细菌学手册》（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属等。

（二）生物学特性1.形态与染色G-，杆菌，大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。

多数有周鞭毛（除志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC），无芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。

2.培养需氧或兼性厌氧；营养要求不高；普皿和麦康凯培养基：中等大小、表面光滑的菌落；液体培养基：混浊生长。

3.生化反应发酵葡萄糖产酸、或产酸产气；乳糖发酵试验：非致病菌 +，致病菌 -（除外变形杆菌）。

触酶阳性；氧化酶阴性；硝酸盐还原为亚硝酸盐。

4.抗原构造表面抗原（如Vi抗原、K抗原）：包绕在O抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断O抗原与相应抗体之间的反应，加热处理能破坏其阻断作用。

5.变异菌落S～R变异鞭毛H～O变异耐药性变异生化反应性质的改变6.抵抗力不强。

加热60℃，30分钟即被杀死。

不耐干燥，对一般化学消毒剂敏感。

对低温有耐受力，能耐胆盐。

7.肠杆菌科的初步分类（三）致病性1.致病性肠道杆菌：以肠内感染为主，腹泻为共显症状，引起急慢性肠道感染、食物中毒、旅游者腹泻及肠热症等。

2.条件致病菌：为医院感染主要病原菌，出现移位感染。

[医学微生物学]肠杆菌科概述肠杆菌科（Enterobacteriaceae）是杆状革兰氏阴性菌的一种。

这一科菌是许多病原菌的重要成员，包括沙门氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和致病性鲍曼不动杆菌等。

肠杆菌科菌还可以在医院感染中发挥重要作用。

从肠杆菌科中分离出的细菌通常具有类似的表型和基因组学，其中包括特殊的粘附因子和毒素。

肠杆菌科菌是通常生活在动物和人体内肠道内的一类细菌。

一个人的肠内生态系统通常由自身宿主免疫系统和居住在肠道内的微生物组成。

肠内微生物群落（肠道菌群）是肠道内大约400种细菌群落的总称。

大肠杆菌和其他肠道菌株是正常肠道菌群的重要成分，它们可以分解食物并生成维生素和其他重要物质，同时还可以抑制潜在的病原体。

分类肠杆菌科菌包括24个属和近200种细菌，其中大多数为人和动物病原体。

这些属包括：Escherichia、Salmonella、Klebsiella、Citrobacter、Erwinia、Enterobacter、Hafnia、Morganella、Proteus、Providencia、Serratia、Shigella、Yersinia等。

这些菌株的生态系统是复杂的，各种菌株之间存在交互作用。

许多肠杆菌属菌株都是优良的益生菌，可以帮助人体对抗潜在的病原菌，从而保持身体健康。

另一方面，有些菌株也可能是病原体，可以引起感染和疾病。

特征肠杆菌科菌通常是革兰氏阴性的、非芽孢形成的杆状菌，一般具有以下特征：•具有胞内和胞外的纤毛；•有专门的表面粘附结构，如菌毛和赖氨酸胶囊；•具有多种代谢途径和酶的活性，包括糖、酒精、氨基酸、脂肪酸等代谢途径；•能够在不同的环境中生长，包括温度、pH值、氧气含量等不同的生理条件；•可以产生多种毒素和酶，包括肠毒素、细胞外蛋白酶和溶血素等。

病原性与疾病许多肠杆菌科菌株都是潜在的病原体，其中一些可以引起严重的疾病。

各个菌属所引起的病症、感染路径和病原生物学特征都不一样，但都具有类似的生理和生化特征。

格兰阴性杆菌肠杆菌科：共同特点大肠埃希菌沙门菌属志贺菌属克雷伯菌属沙雷菌属变形杆菌属耶尔森菌属形态结构1）格兰阴性杆菌；2）中等大小；3）无芽孢，多数有周边毛，少数有荚膜1)格兰阴性短杆菌2)有周鞭毛、菌毛，某些菌株有微荚膜1）格兰阴性杆菌2）有菌毛，周鞭毛，无荚膜1）格兰阴性杆菌2）无鞭毛，无荚膜，多数有菌毛1）格兰阴性2）卵圆或球杆状，常成双排列3）有明显荚膜，无芽孢，无鞭毛，有菌毛1）格兰阴性小杆菌2）粘质沙雷菌是细菌中最小者，可用于检查除菌滤器的除菌效果（最大炭疽）3）周鞭毛，除臭味沙雷菌外均无荚膜，无芽孢格兰阴性杆菌，呈多形性，周鞭毛格兰阴性球杆状，偶有两级染色，无荚膜，22~25度有周边毛，35度无鞭毛（鼠疫耶尔森无鞭毛）培养特征1）需氧或兼性厌氧；2）营养要求不高；3）选择性培养基：麦康凯（Mac.C），S.S,伊红-美兰（EMB）1）兼性厌氧2）营养要求不高3）在普通琼脂和血琼脂平板生长良好，菌落呈圆形、湿润、灰白色、、、4）在肠道培养基上能发酵乳糖产酸1）兼性需氧2）营养要求不高；3）在SS、Mac等选择鉴别培养基上形成中等大小无色半透明的S型菌落1）兼性厌氧2）营养要求不高，能在普通培养基上生长，中等大小，半透明的光滑型菌落3）在肠道杆菌选择培养基上形成不分解乳糖的菌落(宋内氏菌除外，它迟缓分解乳糖）1）在血琼脂上菌落呈圆形、凸起、灰白、不溶血。

光亮的大而粘液菌落，相邻菌落易于融合，呈粘液状，用接种环可拉起长丝（拉丝实验）2）在MAC上多数形成发酵乳糖产酸的红色菌落室温下可产生脂溶性或水溶性色素，菌落呈粉红色，红色1，点种在营养/血琼脂培养基上可迅速生长弥漫成同心圆形波纹状薄膜，布满培养基表面，称迁徙生长。

可悲胆盐，式碳酸，苯酚等抑制。

2）在肠道选择鉴别培养基上形成无色透明，乳糖不发酵的菌落，产硫化氢的菌落在SS上菌落中心呈黑色1）最适温度20~28,4度能生长+2）在肠道培养基（如MAC）呈无色，半透明，较小的不发酵乳糖型菌落生化反应+ 1）活泼，能分解多种糖；葡萄糖，O/F F2）氧化酶（-）1）氧化酶阴性，硝酸盐还原阳性2)活泼，能分解多种糖产气；分1）分解葡萄糖产酸，多数产气2）不分解乳糖3）H2S(+) 赖/鸟1）分解葡萄糖，产酸不产气2）不分解乳糖，宋内氏志贺菌能1）葡萄糖酸盐阳性，本病氨酸脱羧酶阴性2）分解葡萄糖1）葡萄糖酸盐阳性，苯丙氨酸脱羧酶阴性2）分解葡萄糖1）苯丙氨酸脱羧酶阳性，葡萄糖酸盐阴性2）H2S阳，乳糖1）生化反应特征不稳定，分解葡萄糖产酸不产气触酶实验（+）3）都能够还原硝酸盐为亚硝酸盐4）致病菌多不分解乳糖，非致病菌多分解乳糖解乳糖3)H2S（-）尿素酶（-）4)IMViC:++——5)MIU：++—6)KIA：AA+—氨酸脱羧（+）4）吲哚（—）尿素酶（—）5）枸橼酸盐利用：多数（+）（伤寒阴性）IMViC:-+-+迟缓发酵乳糖3）H2S（-）吲哚（-/+）来氨酸脱羧（-）4）尿素酶（-）枸橼酸盐利用（-）5）4种志贺菌生化鉴别见下表产气，乳糖（+/-）脲酶（+）VP（+）3）吲哚（-）鸟氨酸脱羧（-）4）KIA:AA+-5）MIViC：--++产气，不分解乳糖（但因本身产色素，也成红色），DNA酶阳性（与其他菌鉴别）3）鸟氨酸与赖氨酸脱羧酶，明胶酶，酯酶阳性4）H2S阴性，MIViC：--++5）阳，能迅速分解尿素2）H2S阴，乳糖阴3）脲酶多阳性，鸟氨酸脱羧酶阳4）VP试验22~25度阳性，35~37度阴性抗原结构1）O抗原;菌体抗原2）H抗原;鞭毛抗原3）表面抗原1）O抗原：细胞壁LPS，耐热，血清学分型基础2）H抗原:不耐热蛋白抗原3）K抗原：表面抗原，不是每种菌株都有K抗原，分LAB三类，致病性大肠埃希菌的K抗原主要为B类1)O抗原:每个沙门菌的血清型含一种或多种O抗原，凡含有相同抗原组分的归位一个组。