荧光显微镜操作说明书

实验二 荧光显微镜的基本使用方法

荧光显微术是在细胞或组织水平上对生物大分子进行定位和动态观察的最常用的实验方法。它广泛地应用于核酸、蛋白质、细胞器、细胞骨架、激素、离子等多种细胞结构或物质的定位和功能分析。很多生命科学的研究工作都需要频繁地使用荧光显微镜。比如，采用荧光探针的原位分子杂交用于确定某个基因在组织中的表达或在染色体上的定位（Polak et

al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999），绿色荧光蛋白基因（gfp）用于了解某个基因产物在组织和细胞中的特异性分布（Chalfie et al. 1994; Haseloff and Amos 1995）等等。然而，在我们接触的一些低年级研究生中，一些同学并没有很好地掌握荧光显微镜的基本原理和使用方法。他们拍摄的荧光显微照片往往不能满足国际性高水平学术刊物的要求。这种状况既不利于科研效率的提高，也限制了研究成果的发表。因此，了解荧光显微术中的一些基本原理和注意事项、掌握荧光显微镜的基本使用方法是非常重要和有意义的。

本实验讲解荧光显微镜的基本结构和使用方法。要求学生通过细胞核、细胞质DNA的荧光显微显示以及转绿色荧光蛋白基因拟南芥根、茎、叶细胞的观察掌握荧光显微术的基本原理和注意事项，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

实验目的：

1. 了解荧光显微镜的基本结构；

2. 掌握荧光显微术的基本原理和注意事项；

3. 掌握核酸的荧光显示技术，直观地认识细胞质DNA的存在；

4. 了解绿色荧光蛋白（GFP）在蛋白质定位等研究中的应用，直观地认识GFP的荧光显微效果。

实验内容：

1. 荧光显微镜的基本原理和结构

荧光显微镜的放大成像原理与普通透射光显微镜完全相同。不同的是荧光显微镜需要另外的激发光光源和光路。因此，只要加上激发光光源和光路，再换上允许激发光通过的目镜（荧光显微镜的目镜在透镜玻璃的材质上与普通透射光显微镜不同），一台普通的透射光显微镜就可以被升级成一台荧光显微镜了。图2是本实验室使用的荧光显微镜的实物照片。与实验一使用的普通透射光显微镜相比，我们很容易找到荧光显微镜上多出来的部分。这些就是荧光显微镜的激发光光源和光路。

倒置荧光显微镜X71

仪器名称：奥林巴斯IX71倒置荧光显微镜型号：IX71 1、说明书（多的话单独附件）IX71 产品规格

光学系统UIS2光学系统。

观察法荧光（U激励）（B，G激发）荧光荧光（U激励）

微分⼲涉

相位差

简易偏光

明场

对⽐

照明系统透射照明100W卤素灯照明⽩光LED照明EPI照明100W汞灯75W氙⽓灯光源，光导

镜筒双⽬

宽视场22数场倾⾓30°

宽视⾓CT*1

摇摆双⽬

宽视场22数场倾⾓30°

常设

三⽬宽视场22场35?85°的倾斜⾓度

荧光光源130⽡的卤素灯光导照明100⽡汞脂蛋⽩灯外壳和变压器100⽡汞灯和变压器

75 W氙灯外壳和变压器

物镜转换器电动六孔物镜转换器（DIC滑块），防⽔结构编码六孔物镜转换器（DIC滑块），防⽔结构

荧光照明复眼透镜L形荧光照明L形的设计与可交换FS模块L形的荧光照明器L形的交换FS和AS模块设计荧光照明直板造型设计与视场光阑

研究级倒置显微镜1.1 物镜转换器：6孔式物镜转换器，带有简易防⽔装置

*1.2 聚焦机构：备有聚焦机构同轴粗、微调旋钮（最⼩微调刻度单位：1µm），⾏程9mm（向上7mm、向下2mm），粗调旋钮扭矩可调，备有上限位

装置*1.3 原象光⼝：双层光路设计，共6条射⼊/射出光路，最多可同时接4 路采集原像的图像获取系统，左侧光⼝的原像到机架的距离102mm*1.4 具有中间2级放⼤率转换器：1×/1.6×

1.5 透射光照明装置：100W卤素灯透射光照明装置，视场可变光阑可调；外

置电源供应器1.6 观察镜筒：双⽬镜筒：瞳距可在50-76mm范围内进⾏调节，视场直径为

22

*1.7 ⾼精度载物台：⾏程为50 × 50mm；载物台插⼊圆板（外径110mm、内径25mm）

* 1.8 万能平场半复消⾊差相差物镜，视场数≥26.5

4X（N.A.0.13 W.D.17 mm）；10X（N.A.0.3 W.D.10 mm）

20X（N.A.0.45 W.D.6.6-7.8 mm）；40X（N.A.0.6 W.D.3.0-4.2 mm）

Axio Scope A1 简易操作说明

开机：显微镜主机电源——荧光发射器（超高压汞灯）——电脑电源软件

关机：电脑电源软件——荧光发射器（超高压汞灯）——显微镜主机电源

显微镜主要功能：明场、荧光

一、明场

1.找合适高度的凳子坐好，打开显微镜主电源开关；

2.检查显微镜光路，转动底座下靠后的转盘（图2 13），将光强调至偏高，转动底座下的靠前转盘（图2 17），选择1、2、3、4、5中的任意模式，将底座上的视场光阑（图2 19）顺时针转至最大，可以看到有光从底部透出来；

3.检查聚光镜（图2 18），选择聚光镜转盘“BF”模式，将聚光镜下的孔径光阑往左掰，选择低倍镜10X，将主机上部的荧光转盘转至1号位，拉出三目镜筒的拉杆，将光路切换至目镜，观察目镜有无光线透出来，若无，重复以上操作；

4.将样品放入载物台（图1 14），将样品移至中间，观察目镜，转动粗准焦螺旋（图2 12），寻找样品焦距，稍微调整细准焦螺旋（图2 11），找到清样品焦距；

5.选择需要放大的倍数的物镜（图2 21）（注：不可手扶镜头旋转）、中间变倍体观察，稍微调节细准焦螺旋，看清样品，调节聚光镜下的孔径光阑和底座下的调光转盘，选择合适的景深、对比度和分辨率观察；

6.打开软件，拍照。

二、荧光

1.重复明场1~4步骤；

2.将底座下靠前的转盘调至●模式，转动主机上部的荧光转盘，选择“2”或“3”或“4”位置的荧光模式；

3.按下主机上部左边的滚轮，可以看到有光从物镜中透出来；

4.调节荧光电源X-Cite 120Q上的滚轮，选择合适的强度的荧光；

5.转动物镜转盘，选择合适物镜观察，稍微调节细准焦螺旋，看清样品； 6.打开软件，拍照。

显微镜维护：

平时注意防尘，室内湿度不要高于70%，温度不要超过35度，清洁时用99.9%的酒精清洁。

注意事项：

（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

显微照相系统使用说明和注意事项

使用说明：

普通光源观察：

1、接通电源线，打开电源开关，调节光强。

2、将标本放在载物台标本夹内，转动粗微调调节视野内图像清晰

3、调节目镜是观察舒适。

4、根据需要，调节底座光栅和聚光器光栅及其高度，可获得最佳的图像效果。

5、如需拍照，则打开电脑，打开相应软件，拍照保存。

6、使用完毕后，关闭主开关（至O），关闭电源，把防尘罩盖上。

荧光观察：

1、 如使用荧光，要接通荧光光源的电源

2、 选择所需波段的荧光，并用荧光调节旋钮调节亮度。

3、 不观察时要及时切断荧光，避免样品荧光衰减。

4、 如需拍照，步骤同前。

显微照相系统注意事项

1、该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启相应的电源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使用。

2、不要污染物镜镜头。一旦污染，先用擦镜纸擦除一遍，再用显微镜专用擦洗液擦洗，最后用镜纸再擦一遍。用油镜镜头后，以同样方法擦洗。严禁用手指或其他物体接触镜头。

3、关闭显微镜电源前，先把光源调到最低。

4、用过荧光镜的，注意清洁载物台，防止有害有毒致癌物污染。

5、打开荧光光源后，至少15分钟后才能关闭，关闭后至少5分钟后才能开启。

6、不了解的调节装置，要阅读使用说明书，弄懂后方可使用，不要随意乱动。

7、结束工作，关闭所有电源，清洁工作台。

8、发现漏电和其他故障，及时报告陈雪梅老师，不要自行处理。

9、初次使用者事先要经过培训，擅自开机造成设备损坏的，将严肃处理。