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酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
国标—蛋白酶活力测定法
中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法 SB/T 10317-1999Measurement of proteinase activity━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。
1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。
1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
酶活力测定方法
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。返回练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。
其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。
以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取 100 μg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。
其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。
以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考GB/T 23527-2009 附录B中福林酚法进行，即1个酶活力单位（U/mL）定义为1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5条件下反应1 min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表2-6配制。
表2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取100 μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各1.00 mL，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL，福林试剂使用液1.00 mL，置于40 ℃± 0.2 ℃水浴锅中显色20 min，用分光光度计于波长680 nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线。
图2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K 值。
其K值应在95-100范围内。
酶活力的测定
酶活力的测定实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）[目的与原理]掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。
血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT 的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。
[试剂与器材] 试剂：1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。
2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。
3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。
器材：721分光光度计 , 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。
[实验步骤]1、样品测定：基质液置于37℃水浴 5 min，然后按下列步骤操作试剂基质液钼酸铵缓冲液血清对照管 1.0ml 1.0ml ― 0.2ml标准管 1.0ml 1.0ml 0.2ml ―测定管 1.0ml ― ― 0.2ml37℃水浴准确温育60s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。
记录各管吸光度值（A）2、计算：过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对－A测)/ A标] ×（65×1×1000/0.2 ×1000）= [(A对－A测)/ A标]×325(式中65为标准管H2O2浓度，1为1.0ml H2O2体积，1000换算成1L血清，0.2为血清用量， 1000为μmol 换算成 mmol) [方法评估]本实验采用分光光度法测定底物（H2O2）的减少量来评价过氧化氢酶活力。
酶活力测定
1、酶活力测定：样品待测液用0.5MpH6.5磷酸盐缓冲液适当稀释（稀释倍数因酶含量不同而异，可参考下表）。
测定时，取样品稀释液0.5毫升，37℃预热2分钟，加入37℃预热的底物0.5毫升，精确反应15分钟后加入乳化剂2毫升，停止反应。
反应液3000转/分离心10分钟，上清液在721型分光光度计上于540毫微米波长处比色，空白管以缓冲液代替酶，其它操作同上。
附：艳红K-2BP标记溶性微球菌
M.lysodeikticus的制备
1、菌体的培养与收集：取菌种Micrococcus lysodeikticus 634，接种于肉汤培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、琼脂：2.5%、pH7.5压力为1 03.4Kpa，灭菌15分钟）。
37℃培养48~72小时后收集菌体，先用蒸馏水后用丙酮反复洗涤，最后用乙醚处理，可得到干燥菌体。
2、艳红K-2BP标记溶性微球菌M.lysodeikticus：取干燥菌体5g，加入50毫升1.25mol/LNaOH，再加2.5克活性染料艳红K-2BP（上海染化入厂生产）搅拌均匀，于25℃水浴放置24小时进行染色后，3000r/min离心10分钟收集红色菌体。
染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心，以尽量除去末参加反应的游离染料，必要时再用强碱性711树脂在搅拌下进行处理（树脂处理成Cl—型，pH7，树脂的湿重量约为染色菌体的50倍），除去未能洗尽的游离染料，反复处理直到上清液无色。
由此得到净化的染色菌体，直接悬于0.5mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%底物溶液。
或者将
染色菌体冻干或制成丙酮粉，使用时再磷酸盐缓冲液配制。
食品营养与检测《酶的活力测定》
〔2〕确定酶促反响的温度，pH等条件，温度可选在室温25℃，酶反响最适温度，最适ph值，反 响条件一经确定，在反响过程中尽量保持恒定不变。
〔3〕在一定条件下，将一定量的酶液与底物混合溶液混，混合均匀，适时记下反响开始的时间。 〔4〕反响到达一定时间，取出适量反响液，运用各种生化检测技术，测定产物的生产量或底物的减少 量，为了准确的反响酶促反响的结果，应尽量采用快速，简便的方法，立即测出结果，假设不能立即测 出结果的，要及时终止反响，然后再测定。
酶制剂
主要内容： 酶的活力测定。
第一页，共七页。
一、酶的活力测定
在酶的生产及应用过程中，经常要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少及变化情 况，酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反响速度，反响速度越大，说明酶活力 越高。
第二页，共七页。
国际生化联合会规定，在特定条件下〔25℃，或其他选用的温度，ol底物转化 为产物的酶量，定义为1个活力单位，这个单位称为酶的国际单位〔IU〕。如糖 化酶活力测定时，在ol葡萄糖的酶量，定义为一个活力单位。
第五页，共七页。
第六页，共七页。
内容总结
酶制剂。在酶的生产及应用过程中，经常要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少及变化情况 ，酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反响速度，反响速度越大，说明酶活力越高。如糖化酶活 力测定时，在ol葡萄糖的酶量，定义为一个活力单位。酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速简 便，准确。〔2〕确定酶促反响的温度，pH等条件，温度可选在室温25℃，酶反响最适温度，最适ph 值，反响条件一经确定，在反响过程中尽量保持恒定不变
第七页，共七页。
第三页活力的上下，常常采用比活力这 一概念，酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶蛋白所具 有的酶活力。
〔3〕在一定条件下，将一定量的酶液与底物混合溶液混，混合均匀，适时记下反响开始的时间。 〔4〕反响到达一定时间，取出适量反响液，运用各种生化检测技术，测定产物的生产量或底物的减少 量，为了准确的反响酶促反响的结果，应尽量采用快速，简便的方法，立即测出结果，假设不能立即测 出结果的，要及时终止反响，然后再测定。
酶制剂
主要内容： 酶的活力测定。
第一页，共七页。
一、酶的活力测定
在酶的生产及应用过程中，经常要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少及变化情 况，酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反响速度，反响速度越大，说明酶活力 越高。
第二页，共七页。
国际生化联合会规定，在特定条件下〔25℃，或其他选用的温度，ol底物转化 为产物的酶量，定义为1个活力单位，这个单位称为酶的国际单位〔IU〕。如糖 化酶活力测定时，在ol葡萄糖的酶量，定义为一个活力单位。
第五页，共七页。
第六页，共七页。
内容总结
酶制剂。在酶的生产及应用过程中，经常要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少及变化情况 ，酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反响速度，反响速度越大，说明酶活力越高。如糖化酶活 力测定时，在ol葡萄糖的酶量，定义为一个活力单位。酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速简 便，准确。〔2〕确定酶促反响的温度，pH等条件，温度可选在室温25℃，酶反响最适温度，最适ph 值，反响条件一经确定，在反响过程中尽量保持恒定不变
第七页，共七页。
第三页活力的上下，常常采用比活力这 一概念，酶的比活力指在特定条件下，每1mg酶蛋白所具 有的酶活力。
《酶活力的测定》课件
数据记录与整理
实验数据记录
在实验过程中，应准确、及时地记录实验数据，包括实验条件、实验步骤、实 验结果等。
数据整理
将实验数据整理成表格或图表，便于分析和比较。数据整理时应确保数据的准 确性和完整性。
数据分析与处理
数据分析
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、误差等指 标的计算。
数据处理
对异常值或离群数据进行处理，如剔除、替换或修正，以确 保数据分析的准确性。
未来，酶活力测定技术的发展将更加注重高灵 敏度、高特异性和自动化方向，为生物工程领 域的研究提供更加精准和高效的工具。
感谢您的观看
THANKS
问题
实验操作复杂，耗时较长。
改进建议
优化实验流程，简化操作步骤，提高实验 效率。
酶活力测定在生物工程领域的应用前景
酶活力测定是生物工程领域中重要的研究手段 ，可用于研究酶促反应动力学、酶的抑制剂和 激活剂等方面的研究。
随着生物工程技术的不断发展，酶活力测定的 应用范围将不断扩大，如应用于生物制药、生 物能源和生物环保等领域。
通过实验，我们掌握了酶活力测定的基本原理和方法，学会了如何设置实验条件和 操作实验。
实验过程中，我们观察到了酶促反应的动力学特征，如米氏方程的适用性和酶促反 应的速率常数。
实验中存在的问题与改进建议
问题
改进建议
实验过程中存在误差，如温度控制不精确 、底物浓度不均匀等。
采用更精确的仪器和设备，如恒温控制器 和磁力搅拌器，以提高实验的准确性和可 重复性。
米氏方程是描述酶促反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为V=Vmax[S]/（Km+[S]），其中V代表反应速率，Vmax代表 最大反应速率，[S]代表底物浓度，Km代表米氏常数。
酶活力及其测定(精)
15分钟
酶活力的测定
引导学生学习酶活力的各种测定方法
演示、启发、归纳、
多媒体教学、讨论
学会酶活力测定的一般性步骤
15分钟
酶活力测定示例
引导学生理解淀粉酶活力测定的基本原理
引导学生学习淀粉酶测定的各种方法
启发、归纳
多媒体教学
案例演示Байду номын сангаас
了解淀粉-比色法、生糖法、色原底物分解法、酶偶联法
20分钟
《化学物料识用与分析》课程单元教学设计
情境七蛋白质和酶
任务八酶活力及其测定
教学目标设计
序号
46
上课地点
教室
授课形式
多媒体教学
教学目标
能力（技能目标）
知识目标
1.酶活力的计算
1.了解酶活力的概念及表示方法
2．掌握酶活力的测定原理和测定方法
教学重点
酶活力的测定原理和测定方法
教学难点
酶活力的测定原理和测定方法
能力训练任务及案例
酶活力的计算
教学进程设计（下面各格均可合并）
步骤
教学内容
教学方法
教学手段
学生活动
时间分配
酶活力的概念
引导学生理解酶活力的基本概念
启发、归纳、概括
多媒体教学
理解测定酶活力的意义
5分钟
酶活力的表示方法
引导学生掌握酶活力的表示方法
引导学生理解酶比活力
阅读、启发、归纳、演示
多媒体教学
讨论
学会用酶活力、酶比活力表示酶的活性
酶活力的测定
引导学生学习酶活力的各种测定方法
演示、启发、归纳、
多媒体教学、讨论
学会酶活力测定的一般性步骤
15分钟
酶活力测定示例
引导学生理解淀粉酶活力测定的基本原理
引导学生学习淀粉酶测定的各种方法
启发、归纳
多媒体教学
案例演示Байду номын сангаас
了解淀粉-比色法、生糖法、色原底物分解法、酶偶联法
20分钟
《化学物料识用与分析》课程单元教学设计
情境七蛋白质和酶
任务八酶活力及其测定
教学目标设计
序号
46
上课地点
教室
授课形式
多媒体教学
教学目标
能力（技能目标）
知识目标
1.酶活力的计算
1.了解酶活力的概念及表示方法
2．掌握酶活力的测定原理和测定方法
教学重点
酶活力的测定原理和测定方法
教学难点
酶活力的测定原理和测定方法
能力训练任务及案例
酶活力的计算
教学进程设计（下面各格均可合并）
步骤
教学内容
教学方法
教学手段
学生活动
时间分配
酶活力的概念
引导学生理解酶活力的基本概念
启发、归纳、概括
多媒体教学
理解测定酶活力的意义
5分钟
酶活力的表示方法
引导学生掌握酶活力的表示方法
引导学生理解酶比活力
阅读、启发、归纳、演示
多媒体教学
讨论
学会用酶活力、酶比活力表示酶的活性
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（mL）
0
1
2
3
4
5
（mL）
10
9
8
7
6
5
然后按以下流程操作：
试管A（空白）
↓ 加酶液2.00mL
↓（40±0.2）℃，2min 加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
↓（40±0.2）℃，10min
加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀） 加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
↓ 取出静止10min，过滤
（慢速定性滤纸）
100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。 3. 氢氧化钠溶液（20g/L）
称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。待溶液到室温后 ，以水定容 至100mL，搅拌均匀。 4. 盐酸溶液
1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。 0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。 5. 酪蛋白溶液（10.0g/L） 称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲 溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入 100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内 贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。
式（1）中：
X1—由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力，u/mL；
X2—样品的酶活力，u/g；
V—溶解样品所使用量瓶的体积，mL；
n—稀释倍数；
8—反应试剂的总体积，mL；
2—吸取酶液的体积，mL；
m—样品的质量，g；
1/10—反应时间 10min，以 1min 计。
1、标线的绘制
管号 酪氨酸的浓度
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根通保据过护生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资，配料不置试仅技卷可术要以是求解指，决机对吊组电顶在气层进设配行备置继进不电行规保空范护载高与中带资负料荷试下卷高问总中题体资，配料而置试且时卷可，调保需控障要试各在验类最；管大对路限设习度备题内进到来行位确调。保整在机使管组其路高在敷中正设资常过料工程试况中卷下，安与要全过加，度强并工看且作护尽下关可都于能可管地以路缩正高小常中故工资障作料高；试中对卷资于连料继接试电管卷保口破护处坏进理范行高围整中，核资或对料者定试对值卷某，弯些审扁异核度常与固高校定中对盒资图位料纸置试，.卷保编工护写况层复进防杂行腐设自跨备动接与处地装理线置，弯高尤曲中其半资要径料避标试免高卷错等调误，试高要方中求案资技，料术编试交写5、卷底重电保。要气护管设设装线备备置敷4高、调动设中电试作技资气高，术料课中并3中试、件资且包卷管中料拒含试路调试绝线验敷试卷动槽方设技作、案技术，管以术来架及避等系免多统不项启必方动要式方高，案中为；资解对料决整试高套卷中启突语动然文过停电程机气中。课高因件中此中资，管料电壁试力薄卷高、电中接气资口设料不备试严进卷等行保问调护题试装，工置合作调理并试利且技用进术管行，线过要敷关求设运电技行力术高保。中护线资装缆料置敷试做设卷到原技准则术确：指灵在导活分。。线对对盒于于处调差，试动当过保不程护同中装电高置压中高回资中路料资交试料叉卷试时技卷，术调应问试采题技用，术金作是属为指隔调发板试电进人机行员一隔，变开需压处要器理在组；事在同前发一掌生线握内槽图部内 纸故，资障强料时电、，回设需路备要须制进同造行时厂外切家部断出电习具源题高高电中中源资资，料料线试试缆卷卷敷试切设验除完报从毕告而，与采要相用进关高行技中检术资查资料和料试检，卷测并主处且要理了保。解护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
坐标，绘制标准曲线。利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸 的量（μg），即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围内，如不
符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定
待测酶液的制备：称取酶样品1g。然后用磷酸缓冲溶液充分溶
解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，
二、 分析步骤
1. 标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立
即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液
管号 酪氨酸标准溶液 酪氨酸标准储备液体积 加水体积0123 Nhomakorabea4
5
（μg/mL）
0
10
20
30
40
50
分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于
波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横
1
2
3
4
5
（μg/mL）
10
20
30
40
50
式（1）
吸光度A 峰所在的波长
0.0850
0.1504
0.2329
0.3011
0.3785
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根通保据过护生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资，配料不置试仅技卷可术要以是求解指，决机对吊组电顶在气层进设配行备置继进不电行规保空范护载高与中带资负料荷试下卷高问总中题体资，配料而置试且时卷可，调保需控障要试各在验类最；管大对路限设习度备题内进到来行位确调。保整在机使管组其路高在敷中正设资常过料工程试况中卷下，安与要全过加，度强并工看且作护尽下关可都于能可管地以路缩正高小常中故工资障作料高；试中对卷资于连料继接试电管卷保口破护处坏进理范行高围整中，核资或对料者定试对值卷某，弯些审扁异核度常与固高校定中对盒资图位料纸置试，.卷保编工护写况层复进防杂行腐设自跨备动接与处地装理线置，弯高尤曲中其半资要径料避标试免高卷错等调误，试高要方中求案资技，料术编试交写5、卷底重电保。要气护管设设装线备备置敷4高、调动设中电试作技资气高，术料课中并3中试、件资且包卷管中料拒含试路调试绝线验敷试卷动槽方设技作、案技术，管以术来架及避等系免多统不项启必方动要式方高，案中为；资解对料决整试高套卷中启突语动然文过停电程机气中。课高因件中此中资，管料电壁试力薄卷高、电中接气资口设料不备试严进卷等行保问调护题试装，工置合作调理并试利且技用进术管行，线过要敷关求设运电技行力术高保。中护线资装缆料置敷试做设卷到原技准则术确：指灵在导活分。。线对对盒于于处调差，试动当过保不程护同中装电高置压中高回资中路料资交试料叉卷试时技卷，术调应问试采题技用，术金作是属为指隔调发板试电进人机行员一隔，变开需压处要器理在组；事在同前发一掌生线握内槽图部内 纸故，资障强料时电、，回设需路备要须制进同造行时厂外切家部断出电习具源题高高电中中源资资，料料线试试缆卷卷敷试切设验除完报从毕告而，与采要相用进关高行技中检术资查资料和料试检，卷测并主处且要理了保。解护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根通保据过护生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资，配料不置试仅技卷可术要以是求解指，决机对吊组电顶在气层进设配行备置继进不电行规保空范护载高与中带资负料荷试下卷高问总中题体资，配料而置试且时卷可，调保需控障要试各在验类最；管大对路限设习度备题内进到来行位确调。保整在机使管组其路高在敷中正设资常过料工程试况中卷下，安与要全过加，度强并工看且作护尽下关可都于能可管地以路缩正高小常中故工资障作料高；试中对卷资于连料继接试电管卷保口破护处坏进理范行高围整中，核资或对料者定试对值卷某，弯些审扁异核度常与固高校定中对盒资图位料纸置试，.卷保编工护写况层复进防杂行腐设自跨备动接与处地装理线置，弯高尤曲中其半资要径料避标试免高卷错等调误，试高要方中求案资技，料术编试交写5、卷底重电保。要气护管设设装线备备置敷4高、调动设中电试作技资气高，术料课中并3中试、件资且包卷管中料拒含试路调试绝线验敷试卷动槽方设技作、案技术，管以术来架及避等系免多统不项启必方动要式方高，案中为；资解对料决整试高套卷中启突语动然文过停电程机气中。课高因件中此中资，管料电壁试力薄卷高、电中接气资口设料不备试严进卷等行保问调护题试装，工置合作调理并试利且技用进术管行，线过要敷关求设运电技行力术高保。中护线资装缆料置敷试做设卷到原技准则术确：指灵在导活分。。线对对盒于于处调差，试动当过保不程护同中装电高置压中高回资中路料资交试料叉卷试时技卷，术调应问试采题技用，术金作是属为指隔调发板试电进人机行员一隔，变开需压处要器理在组；事在同前发一掌生线握内槽图部内 纸故，资障强料时电、，回设需路备要须制进同造行时厂外切家部断出电习具源题高高电中中源资资，料料线试试缆卷卷敷试切设验除完报从毕告而，与采要相用进关高行技中检术资查资料和料试检，卷测并主处且要理了保。解护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
木瓜蛋白酶活力的测定
一、试剂与溶液
1. 三氯乙酸 称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL） 精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容
至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。 吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至
定容至100ml
↓ 测滤液吸光度
试管B（酶试样，需三个平行样）
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根通保据过护生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资，配料不置试仅技卷可术要以是求解指，决机对吊组电顶在气层进设配行备置继进不电行规保空范护载高与中带资负料荷试下卷高问总中题体资，配料而置试且时卷可，调保需控障要试各在验类最；管大对路限设习度备题内进到来行位确调。保整在机使管组其路高在敷中正设资常过料工程试况中卷下，安与要全过加，度强并工看且作护尽下关可都于能可管地以路缩正高小常中故工资障作料高；试中对卷资于连料继接试电管卷保口破护处坏进理范行高围整中，核资或对料者定试对值卷某，弯些审扁异核度常与固高校定中对盒资图位料纸置试，.卷保编工护写况层复进防杂行腐设自跨备动接与处地装理线置，弯高尤曲中其半资要径料避标试免高卷错等调误，试高要方中求案资技，料术编试交写5、卷底重电保。要气护管设设装线备备置敷4高、调动设中电试作技资气高，术料课中并3中试、件资且包卷管中料拒含试路调试绝线验敷试卷动槽方设技作、案技术，管以术来架及避等系免多统不项启必方动要式方高，案中为；资解对料决整试高套卷中启突语动然文过停电程机气中。课高因件中此中资，管料电壁试力薄卷高、电中接气资口设料不备试严进卷等行保问调护题试装，工置合作调理并试利且技用进术管行，线过要敷关求设运电技行力术高保。中护线资装缆料置敷试做设卷到原技准则术确：指灵在导活分。。线对对盒于于处调差，试动当过保不程护同中装电高置压中高回资中路料资交试料叉卷试时技卷，术调应问试采题技用，术金作是属为指隔调发板试电进人机行员一隔，变开需压处要器理在组；事在同前发一掌生线握内槽图部内 纸故，资障强料时电、，回设需路备要须制进同造行时厂外切家部断出电习具源题高高电中中源资资，料料线试试缆卷卷敷试切设验除完报从毕告而，与采要相用进关高行技中检术资查资料和料试检，卷测并主处且要理了保。解护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。