【免费下载】酶活力的测定 国标

木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。

2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。

吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。

3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。

待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。

4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。

0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。

5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。

冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。

此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。

使用前重新确认并调整pH至规定值。

二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。

L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。

表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。

以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。

利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。

其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。

2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。

然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。

测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。

中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法 SB/T 10317-1999Measurement of proteinase activity━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。

取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。

若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。

冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。

此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。

即成已稀释的福林试剂。

1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。

1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。

1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。

取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。

1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。

其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。

以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。

2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。

表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取 100 μg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。

图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。

其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。

以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考GB/T 23527-2009 附录B中福林酚法进行，即1个酶活力单位（U/mL）定义为1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5条件下反应1 min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。

2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表2-6配制。

表2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取100 μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各1.00 mL，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL，福林试剂使用液1.00 mL，置于40 ℃± 0.2 ℃水浴锅中显色20 min，用分光光度计于波长680 nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线。

图2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K 值。

其K值应在95-100范围内。

酶活力的测定实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）[目的与原理]掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。

血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT 的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。

[试剂与器材] 试剂：1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。

2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。

3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。

器材：721分光光度计 , 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。

[实验步骤]1、样品测定：基质液置于37℃水浴 5 min，然后按下列步骤操作试剂基质液钼酸铵缓冲液血清对照管 1.0ml 1.0ml ― 0.2ml标准管 1.0ml 1.0ml 0.2ml ―测定管 1.0ml ― ― 0.2ml37℃水浴准确温育60s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。

记录各管吸光度值（A）2、计算：过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对－A测)/ A标] ×（65×1×1000/0.2 ×1000）= [(A对－A测)/ A标]×325(式中65为标准管H2O2浓度，1为1.0ml H2O2体积，1000换算成1L血清，0.2为血清用量， 1000为μmol 换算成 mmol) [方法评估]本实验采用分光光度法测定底物（H2O2）的减少量来评价过氧化氢酶活力。

1、酶活力测定：样品待测液用0.5MpH6.5磷酸盐缓冲液适当稀释（稀释倍数因酶含量不同而异，可参考下表）。

测定时，取样品稀释液0.5毫升，37℃预热2分钟，加入37℃预热的底物0.5毫升，精确反应15分钟后加入乳化剂2毫升，停止反应。

反应液3000转/分离心10分钟，上清液在721型分光光度计上于540毫微米波长处比色，空白管以缓冲液代替酶，其它操作同上。

附：艳红K-2BP标记溶性微球菌
M.lysodeikticus的制备
1、菌体的培养与收集：取菌种Micrococcus lysodeikticus 634，接种于肉汤培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、琼脂：2.5%、pH7.5压力为1 03.4Kpa，灭菌15分钟）。

37℃培养48~72小时后收集菌体，先用蒸馏水后用丙酮反复洗涤，最后用乙醚处理，可得到干燥菌体。

2、艳红K-2BP标记溶性微球菌M.lysodeikticus：取干燥菌体5g，加入50毫升1.25mol/LNaOH，再加2.5克活性染料艳红K-2BP（上海染化入厂生产）搅拌均匀，于25℃水浴放置24小时进行染色后，3000r/min离心10分钟收集红色菌体。

染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心，以尽量除去末参加反应的游离染料，必要时再用强碱性711树脂在搅拌下进行处理（树脂处理成Cl—型，pH7，树脂的湿重量约为染色菌体的50倍），除去未能洗尽的游离染料，反复处理直到上清液无色。

由此得到净化的染色菌体，直接悬于0.5mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%底物溶液。

或者将
染色菌体冻干或制成丙酮粉，使用时再磷酸盐缓冲液配制。

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。

其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。

以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考GB/T 23527-2009 附录B中福林酚法进行，即1个酶活力单位（U/mL）定义为1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5条件下反应1 min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。

2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表2-6配制。

表2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取100 μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各1.00 mL，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL，福林试剂使用液1.00 mL，置于40 ℃± 0.2 ℃水浴锅中显色20 min，用分光光度计于波长680 nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线。

图2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K 值。

其K值应在95-100范围内。

酶活力的测定方法
酶活力咋测？嘿，有办法。

先准备好材料，就像要去打仗得有武器。

然后按照步骤来，可不能瞎搞。

注意啥呢？温度得控制好呀，不然酶活性乱了套，那可完蛋啦。

还有时间也得把握准，就像做饭不能糊了锅。

安全不？只要你操作规范，没啥问题。

就像走路走得稳就不会摔跟头。

稳定性嘛，只要条件控制好，结果就比较靠谱。

就像盖房子基础打好就不会歪。

啥时候用这方法？做实验、研究的时候呗。

优势可不少呢，能知道酶有多厉害，就像给酶做个体检。

我见过人家测酶活力，那数据准得很。

就像神枪手打靶，百发百中。

测酶活力有门道，弄好了超棒。

你还等啥呢？赶紧试试吧！。

酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的特性和作用机制，掌握测定酶活力的基本方法和原理，并通过实验数据的分析和处理，计算出酶的活力值，为进一步研究酶的性质和应用提供基础数据。

二、实验原理酶是一种具有生物催化活性的蛋白质或核酸分子，能够加速化学反应的进行。

酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。

本次实验采用的是分光光度法测定酶活力。

以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。

在一定条件下，加入适量的过氧化氢溶液，然后通过测定反应体系中剩余过氧化氢的量，间接计算出过氧化氢酶的活力。

三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝组织过氧化氢溶液（3%）磷酸缓冲液（pH 70）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器试管、量筒、烧杯等玻璃仪器四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜猪肝组织_____g，剪碎后放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。

将匀浆转移至离心管中，在 4℃下以_____rpm 离心_____min，取上清液即为酶液。

2、绘制标准曲线取 6 支干净的试管，分别加入 0、01、02、03、04、05 mL 的过氧化氢标准溶液（10 mmol/L），然后用磷酸缓冲液（pH 70）补足至 1 mL。

向各试管中加入 2 mL 显色剂（4-氨基安替比林与酚的混合液），摇匀后在 37℃水浴中保温 15 min。

以第一支试管为空白对照，在分光光度计上于 510 nm 波长处测定各管的吸光度值。

以过氧化氢的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3、酶活力的测定取 2 支干净的试管，分别标记为测定管和对照管。

向测定管中加入 1 mL 酶液和 1 mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，在 37℃水浴中反应 5 min。

向对照管中加入 1 mL 磷酸缓冲液（pH 70）和 1 mL 过氧化氢溶液（3%），在 37℃水浴中保温 5 min。

华南农业大学综合实验报告实验项目名称：食品发酵工业中常用系列酶活力测定实验项目性质：综合性实验计划学时：6所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：09生物工程2班******学号：************实验课指导老师：沈玉栋摘要测定食品发酵工业中常用酶活力，对于选择酶种类，工艺条件的制定等有重要意义。

本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶，淀粉酶，蛋白酶进行了酶活力测定。

其中，测定糖化酶采用直接滴定法，测定淀粉酶采用目测比色法，测定蛋白酶采用福林酚法。

关键词：酶活力糖化酶淀粉酶蛋白酶直接滴定法目测比色法福林酚法1 前言酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。

随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。

目前已有几十种酶成功地用于食品工业。

例如，葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。

应用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。

酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质，生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。

作为生物体内的催化剂，催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。

酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。

测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。

酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。

在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。

因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。

它能把淀粉从非还原性未端水介a-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。

SB/ T10317-1999 蛋白酶活力测定方法蛋白酶活力测定：参照中华人民共和国专业标准(Asha 等,2007)。

纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS,活力,纤维素酶,测定1 定义"|0 '. y6 t9 b" A2 x1g固体酶粉在40 C和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。

2原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将 3 , 5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。

！ Y" m& p' q; I& K B& e$ T( B4 }3.试剂和溶液3.1 1 %葡萄糖标准溶液(同葡聚糖酶酶活测定)3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠(粘度300〜600厘泊)，加入pH4.2的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀，水浴加热至溶，冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在 4 C冰箱贮存，有效期3天。

取滤液100ml , 20ml，蒸馏水40ml ,混匀，贮冰箱备用。

4 C) c+ }( 12 R( M( p!L3.3 DNS 试剂(同B—葡聚糖酶酶活测定) ；h1 a. 13 Z3 k6 t2 |4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40 °C±).2 C)4.2分光光度计含10mm 比色皿，可在550nm 处测量吸光度。

$ ]1 h& A) p) K5测定步骤5.1 标准曲线绘制.[* |! P6 u* G& u2人6 J4 Q分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg 的稀标准液。