人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的分离 以及生物学性质研究
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3 讨论 脑肿瘤干细胞的研究始于 Ignatova［3］，他利用培
养神经干细胞的无血清悬浮培养法， 从原发脑肿瘤 中分离出具有自我更新和分化能力的细胞，当时称 为神经干细胞样细胞（neural stem－like cells）。 接着 有多位学者通过不同的鉴定和分离方法获得了脑 肿 瘤 干 细 胞 ，而 其 中 对 胶 质 瘤 的 研 究 是 最 多 的 ［4］。
作 者 单 位 ：315000 宁 波 ， 浙 江 省 宁 波 市 医 疗 中 心 李 惠 利 医 院 （沈罡）；浙江大学医学院附属第二医院（刘伟国）
消化后在显微镜下计数。 将消化后的原代胶质瘤细 胞以 1×106 ／ ml 的密度接种到无血清培养基和含胎 牛血清的 DMEM 高糖培养基中进行培养。 取部分原 代肿瘤细胞经消化后，以每孔 250μl 无血清培养基 中含 1～5 个细胞的浓度接种于 96 孔板，1 月后计算 具有单细胞克隆形成能力的肿瘤干细胞的百分率。 1．2．2 单细胞悬液的制备和单细胞克隆分析：胶质 瘤细胞以 1000～2000 个 细 胞 ／ cm2 的 克 隆 密 度 接 种 于 5ml 含生长因子的 DMEM ／ F12 培养基中，1～2 周 后收集克隆球细胞消化后将细胞梯度稀释到 1000 个细胞 ／ ml 的浓度，在每个 96 孔板孔中加入 1～2μl 的细胞悬液，记录含有单个肿瘤细胞的孔。 观察细 胞分裂情况。 1．2．3 克隆球细胞的分化检测：收集克隆密度下无 血清培养基中的单细胞来源克隆球，接种到 6 孔板 中，分别检测 CD133，GFAP 以及 NSE 的表达。 并在 含 血 清 培 养 基 培 养 1 周 后 行 分 别 检 测 CD133， GFAP，NSE 的表达。 1．2．4 裸鼠致瘤实验：分别收集无血清培养基中的 克隆球和贴壁生长细胞以及子代单细胞来源的克
图 1：人胶质瘤细胞在含血清培养基中呈贴壁生长（A）；细 胞 间 核 异 性 明 显 （B）；3 天 后 血 清 培 养 基 中 可 见 球 样 隆 起 （C）；在 无 血 清 培养基中可形成悬浮克隆球（D）。 A/C/D:100×，B:400×
2．2 原代肿瘤单细胞克隆形成率： 将 12 例胶质细 胞瘤细胞消化后以 1～5 个细胞 ／ 孔的密度接种到含 无血清培养基的 96 孔板中，24 小时可观察到部分 细胞出现分裂，细胞增殖缓慢，2 周后可见数十个细 胞小的克隆球。 1 月后计算克隆球形成率发现 12 例 原 代 胶 质 细 胞 瘤 中 的 比 例 在 1．2％～13．9％之 间 。 其余细胞呈贴壁生长， 或始终呈圆形单细胞状态， 部分细胞在无血清培养基中消亡。 且高级别胶质瘤 中克隆球形成细胞的比例要明显高于低级别胶质 瘤细胞的比例。 2．3 原代肿瘤细胞的特异性标志物检测：免疫荧光 显示在含血清培养基中 12 例原代胶质细胞瘤可同
时发现神经干细胞标志物 CD133（图 2，A）、胶质细 胞 标 志 物 GFAP （图 2，B）、 神 经 元 细 胞 的 标 志 物 NSE （图 2，C） 的表达。 在悬浮克隆球中笔者发现 CD133 为高表达（图 2，D）。 将克隆球置于血清培养 基 1 周后 GFAP 与 NSE 的表达均升高，同时笔者发 现有少数细胞表现为 CD133 与 GFAP 或 CD133 与 NSE 的共表达显现（图 2，E）。 2 例肿瘤细胞经流式 细胞仪检测后发现，CD133 阳性细胞分别占原代胶 质 细 胞 瘤 所 有 细 胞 的 3．6％ （WHO Ⅱ ） 和 11．6％ （WHO IV）（图 2，F）。
【Key words】 human glioblastoma; cancer stem cells; CD133
肿瘤干细胞假说［1］认为，在肿瘤细胞中仅有一小 部分（1％）的细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化 潜能的干细胞样特性，它们是肿瘤发生、转移和复发 的根源，同时是今后肿瘤治疗的主要靶向目标［2］。 笔者 从单细胞克隆形成实验出发， 系统分析了 12 例原 代胶质母细胞瘤细胞中肿瘤干细胞的构成、自我更 新能力、 多向分化能力以及致瘤能力等生物学特 征，发现在人胶质母细胞瘤中确实存在一定比例的 （1．2％～13．9％）细胞具有悬浮克隆球形成能力。
图 3：有 20%~34.5%的子代单细胞可以形成亚克隆球(A),同时高表达 CD133(B)。 在含血清培养基中单细胞克隆可表达 GFAP(C)以及 NSE (D)。 单细胞来源的克隆球细胞具有致瘤性（E），种植瘤呈典型胶母表 现（F）。 切片免疫组织化学显示种 植 瘤 和 患 者 病 理 切 片 中 可 同 时 表 达 CD133(G)、GFAP(H)以及 NSE(I)（图 A/F:100X，细 胞 以 及 切 片 免 疫 组织化学图片均为 400 倍放大。
13．9％的细胞具有单细胞增殖形成克隆球的能力。 结论 人脑胶质瘤组织中确实存在少数 的 脑 肿 瘤 干 细 胞 ，有 自 我 更 新 、多 项 分 化 以 及 致
瘤能力。 【关键词】 人脑胶质瘤；肿瘤干细胞；CD133 【中图分类号】 R65l 【文献标识码】 A
Isolation and identification of cancer stem cells in brain gliomas and analyses of biological characteristics SHENG Gang, LIU Weiguo. Ningbo Lihuili Hospital, Zhejiang 315000, China
图 2：免疫荧光显示含血清培养贴壁细胞中，有 CD133 表达(A)，两 例 流式结果分别为 3.6%、11.6%（F）,同时贴壁细胞中有 GFAP(B)和 NSE （C）的表达。 克隆球中 CD133 高表达（D）。 同时笔者发现 CD133 与 GFAP 在含血清培养基中有少量共表达（E）。 （免疫荧光 图 片 除 图 D 为 200 倍，其余均为 400 倍放大。
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浙江创伤外科 2011 年 4 月第 16 卷第 2 期 ZH J J Traumatic，April 2011，Vol.16，No.2
验：收集单细胞来源的克隆球，消化后制备成单细 胞悬液，以 1×104 的密度接种裸鼠背部。 2 周后，笔 者发现 12 例克隆球来源细胞均可以形成肿瘤 （图 3，E）。 组织切片 HE 显示种植瘤与原代胶质瘤一样 均有典型表现（图 3，F）。 免疫组织化学也显示在患 者病理切片均发现有 CD133（图 3，G）、GFAP（图 3， H）、NSE（图 3，I）的表达。 而非克隆球来源的肿瘤细 胞以 1×106 甚至更高密度接种裸鼠，均无法成瘤。
1 材料与方法 1．1 实验材料：BALB ／ C 裸鼠购自中科院上海实验 动物中心；12 例胶质瘤细胞新鲜标本来自于浙江大 学医学院附属第二医院神经外科； 病理根据 WHO （2000）神经上皮组织肿瘤标准分类。 1．2 实验方法 1．2．1 肿瘤细胞的获取以及原代培养：取瘤体深部 无囊性变、无坏死的肿瘤组织，迅速剪碎并用胰酶
脑肿瘤干细胞学说认为，在脑肿瘤实体中存在 一部分具有旺盛的自我更新能力、 多向分化潜能、 独立致瘤能力特性的细胞。 一旦将这些具有肿瘤干 细胞特性的细胞抽离后，其余的细胞就失去了致瘤 能力。 因此分离和鉴定这些细胞，并对这些细胞的 特性进行深入研究有助于阐明脑肿瘤发生、发展的 机制，进而寻找到一条靶向杀灭这些细胞的途径以 达到最终治愈肿瘤的目的。
2 结果 2．1 原代胶质母细胞瘤悬浮克隆球的形成：胶质细 胞瘤细胞接种到含血清培养基 1 天后，细胞均呈贴 壁生长状态，形态多样，细胞突起明显（图 1，A），核 异型明显（图 1，B），局部在 3～5 天后可看到球样隆 起（图 1，C）。 而在无血清培养基中，12 例标本均可 在 24～48 小 时 后 发 现 有 单 个 或 多 个 成 簇 悬 浮 细 胞 的形成，7 天后细胞球明显增多，形状多规则，晃动 培养瓶时可见细胞球滚动（图 1，D）。 大部分细胞在 无血清培养基中仍呈贴壁生长，随培养时间的延长 贴壁细胞数有所减少。
浙江创伤外科 2011 年 4 月第 16 卷第 2 期 ZH J J Traumatic，April 2011，Vol.16，No.2
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隆球， 将不同来源肿瘤细胞悬液接种到 4 周大的 BALB ／ C 裸鼠的背部皮下，观察肿瘤的生长情况。 1．2．5 流式细胞仪检测原代细胞中 CD133 的表达： 分别收集血清和无血清培养基中原代胶质瘤细胞， 细胞分别与羊抗－CD133 多克隆抗体（1：200， Santa Cruz， 美国） 以及驴抗羊 Alexa 488 绿 色 荧 光 二 抗 （Molecular Protect， 美国）混合后用美国 BD 公司的 流式细胞仪进行分析检测。
【Abstract】 Objective To identify the cancer stem cells (CSCs) from primary human gliomas and explore their biological characteristics. Methods Serum-free medium was used to culture the 12 human primary gliomas, Single-cell clonal culture was used to determine the percentage of cells with self-renewal capacity. Immunohistochemistry staining was used to analyze the multi-linkage differentiation capacity and the CD133 ex pression of the human glioblastoma cells. Results About 1.2%~13.9% human primary glioblastoma cells were capable of forming tumor spheres. There were much higher CD133 positive rate in WHOⅢ-Ⅳ primary glioma cells than that in WHO Ⅱ cells. Conclusion There are a little cancer stem-like cells in primary human glioma cells with capcity of self-renewal, differentiation and in vivo tumorigenecity.
养神经干细胞的无血清悬浮培养法， 从原发脑肿瘤 中分离出具有自我更新和分化能力的细胞，当时称 为神经干细胞样细胞（neural stem－like cells）。 接着 有多位学者通过不同的鉴定和分离方法获得了脑 肿 瘤 干 细 胞 ，而 其 中 对 胶 质 瘤 的 研 究 是 最 多 的 ［4］。
作 者 单 位 ：315000 宁 波 ， 浙 江 省 宁 波 市 医 疗 中 心 李 惠 利 医 院 （沈罡）；浙江大学医学院附属第二医院（刘伟国）
消化后在显微镜下计数。 将消化后的原代胶质瘤细 胞以 1×106 ／ ml 的密度接种到无血清培养基和含胎 牛血清的 DMEM 高糖培养基中进行培养。 取部分原 代肿瘤细胞经消化后，以每孔 250μl 无血清培养基 中含 1～5 个细胞的浓度接种于 96 孔板，1 月后计算 具有单细胞克隆形成能力的肿瘤干细胞的百分率。 1．2．2 单细胞悬液的制备和单细胞克隆分析：胶质 瘤细胞以 1000～2000 个 细 胞 ／ cm2 的 克 隆 密 度 接 种 于 5ml 含生长因子的 DMEM ／ F12 培养基中，1～2 周 后收集克隆球细胞消化后将细胞梯度稀释到 1000 个细胞 ／ ml 的浓度，在每个 96 孔板孔中加入 1～2μl 的细胞悬液，记录含有单个肿瘤细胞的孔。 观察细 胞分裂情况。 1．2．3 克隆球细胞的分化检测：收集克隆密度下无 血清培养基中的单细胞来源克隆球，接种到 6 孔板 中，分别检测 CD133，GFAP 以及 NSE 的表达。 并在 含 血 清 培 养 基 培 养 1 周 后 行 分 别 检 测 CD133， GFAP，NSE 的表达。 1．2．4 裸鼠致瘤实验：分别收集无血清培养基中的 克隆球和贴壁生长细胞以及子代单细胞来源的克
图 1：人胶质瘤细胞在含血清培养基中呈贴壁生长（A）；细 胞 间 核 异 性 明 显 （B）；3 天 后 血 清 培 养 基 中 可 见 球 样 隆 起 （C）；在 无 血 清 培养基中可形成悬浮克隆球（D）。 A/C/D:100×，B:400×
2．2 原代肿瘤单细胞克隆形成率： 将 12 例胶质细 胞瘤细胞消化后以 1～5 个细胞 ／ 孔的密度接种到含 无血清培养基的 96 孔板中，24 小时可观察到部分 细胞出现分裂，细胞增殖缓慢，2 周后可见数十个细 胞小的克隆球。 1 月后计算克隆球形成率发现 12 例 原 代 胶 质 细 胞 瘤 中 的 比 例 在 1．2％～13．9％之 间 。 其余细胞呈贴壁生长， 或始终呈圆形单细胞状态， 部分细胞在无血清培养基中消亡。 且高级别胶质瘤 中克隆球形成细胞的比例要明显高于低级别胶质 瘤细胞的比例。 2．3 原代肿瘤细胞的特异性标志物检测：免疫荧光 显示在含血清培养基中 12 例原代胶质细胞瘤可同
时发现神经干细胞标志物 CD133（图 2，A）、胶质细 胞 标 志 物 GFAP （图 2，B）、 神 经 元 细 胞 的 标 志 物 NSE （图 2，C） 的表达。 在悬浮克隆球中笔者发现 CD133 为高表达（图 2，D）。 将克隆球置于血清培养 基 1 周后 GFAP 与 NSE 的表达均升高，同时笔者发 现有少数细胞表现为 CD133 与 GFAP 或 CD133 与 NSE 的共表达显现（图 2，E）。 2 例肿瘤细胞经流式 细胞仪检测后发现，CD133 阳性细胞分别占原代胶 质 细 胞 瘤 所 有 细 胞 的 3．6％ （WHO Ⅱ ） 和 11．6％ （WHO IV）（图 2，F）。
【Key words】 human glioblastoma; cancer stem cells; CD133
肿瘤干细胞假说［1］认为，在肿瘤细胞中仅有一小 部分（1％）的细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化 潜能的干细胞样特性，它们是肿瘤发生、转移和复发 的根源，同时是今后肿瘤治疗的主要靶向目标［2］。 笔者 从单细胞克隆形成实验出发， 系统分析了 12 例原 代胶质母细胞瘤细胞中肿瘤干细胞的构成、自我更 新能力、 多向分化能力以及致瘤能力等生物学特 征，发现在人胶质母细胞瘤中确实存在一定比例的 （1．2％～13．9％）细胞具有悬浮克隆球形成能力。
图 3：有 20%~34.5%的子代单细胞可以形成亚克隆球(A),同时高表达 CD133(B)。 在含血清培养基中单细胞克隆可表达 GFAP(C)以及 NSE (D)。 单细胞来源的克隆球细胞具有致瘤性（E），种植瘤呈典型胶母表 现（F）。 切片免疫组织化学显示种 植 瘤 和 患 者 病 理 切 片 中 可 同 时 表 达 CD133(G)、GFAP(H)以及 NSE(I)（图 A/F:100X，细 胞 以 及 切 片 免 疫 组织化学图片均为 400 倍放大。
13．9％的细胞具有单细胞增殖形成克隆球的能力。 结论 人脑胶质瘤组织中确实存在少数 的 脑 肿 瘤 干 细 胞 ，有 自 我 更 新 、多 项 分 化 以 及 致
瘤能力。 【关键词】 人脑胶质瘤；肿瘤干细胞；CD133 【中图分类号】 R65l 【文献标识码】 A
Isolation and identification of cancer stem cells in brain gliomas and analyses of biological characteristics SHENG Gang, LIU Weiguo. Ningbo Lihuili Hospital, Zhejiang 315000, China
图 2：免疫荧光显示含血清培养贴壁细胞中，有 CD133 表达(A)，两 例 流式结果分别为 3.6%、11.6%（F）,同时贴壁细胞中有 GFAP(B)和 NSE （C）的表达。 克隆球中 CD133 高表达（D）。 同时笔者发现 CD133 与 GFAP 在含血清培养基中有少量共表达（E）。 （免疫荧光 图 片 除 图 D 为 200 倍，其余均为 400 倍放大。
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浙江创伤外科 2011 年 4 月第 16 卷第 2 期 ZH J J Traumatic，April 2011，Vol.16，No.2
验：收集单细胞来源的克隆球，消化后制备成单细 胞悬液，以 1×104 的密度接种裸鼠背部。 2 周后，笔 者发现 12 例克隆球来源细胞均可以形成肿瘤 （图 3，E）。 组织切片 HE 显示种植瘤与原代胶质瘤一样 均有典型表现（图 3，F）。 免疫组织化学也显示在患 者病理切片均发现有 CD133（图 3，G）、GFAP（图 3， H）、NSE（图 3，I）的表达。 而非克隆球来源的肿瘤细 胞以 1×106 甚至更高密度接种裸鼠，均无法成瘤。
1 材料与方法 1．1 实验材料：BALB ／ C 裸鼠购自中科院上海实验 动物中心；12 例胶质瘤细胞新鲜标本来自于浙江大 学医学院附属第二医院神经外科； 病理根据 WHO （2000）神经上皮组织肿瘤标准分类。 1．2 实验方法 1．2．1 肿瘤细胞的获取以及原代培养：取瘤体深部 无囊性变、无坏死的肿瘤组织，迅速剪碎并用胰酶
脑肿瘤干细胞学说认为，在脑肿瘤实体中存在 一部分具有旺盛的自我更新能力、 多向分化潜能、 独立致瘤能力特性的细胞。 一旦将这些具有肿瘤干 细胞特性的细胞抽离后，其余的细胞就失去了致瘤 能力。 因此分离和鉴定这些细胞，并对这些细胞的 特性进行深入研究有助于阐明脑肿瘤发生、发展的 机制，进而寻找到一条靶向杀灭这些细胞的途径以 达到最终治愈肿瘤的目的。
2 结果 2．1 原代胶质母细胞瘤悬浮克隆球的形成：胶质细 胞瘤细胞接种到含血清培养基 1 天后，细胞均呈贴 壁生长状态，形态多样，细胞突起明显（图 1，A），核 异型明显（图 1，B），局部在 3～5 天后可看到球样隆 起（图 1，C）。 而在无血清培养基中，12 例标本均可 在 24～48 小 时 后 发 现 有 单 个 或 多 个 成 簇 悬 浮 细 胞 的形成，7 天后细胞球明显增多，形状多规则，晃动 培养瓶时可见细胞球滚动（图 1，D）。 大部分细胞在 无血清培养基中仍呈贴壁生长，随培养时间的延长 贴壁细胞数有所减少。
浙江创伤外科 2011 年 4 月第 16 卷第 2 期 ZH J J Traumatic，April 2011，Vol.16，No.2
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隆球， 将不同来源肿瘤细胞悬液接种到 4 周大的 BALB ／ C 裸鼠的背部皮下，观察肿瘤的生长情况。 1．2．5 流式细胞仪检测原代细胞中 CD133 的表达： 分别收集血清和无血清培养基中原代胶质瘤细胞， 细胞分别与羊抗－CD133 多克隆抗体（1：200， Santa Cruz， 美国） 以及驴抗羊 Alexa 488 绿 色 荧 光 二 抗 （Molecular Protect， 美国）混合后用美国 BD 公司的 流式细胞仪进行分析检测。
【Abstract】 Objective To identify the cancer stem cells (CSCs) from primary human gliomas and explore their biological characteristics. Methods Serum-free medium was used to culture the 12 human primary gliomas, Single-cell clonal culture was used to determine the percentage of cells with self-renewal capacity. Immunohistochemistry staining was used to analyze the multi-linkage differentiation capacity and the CD133 ex pression of the human glioblastoma cells. Results About 1.2%~13.9% human primary glioblastoma cells were capable of forming tumor spheres. There were much higher CD133 positive rate in WHOⅢ-Ⅳ primary glioma cells than that in WHO Ⅱ cells. Conclusion There are a little cancer stem-like cells in primary human glioma cells with capcity of self-renewal, differentiation and in vivo tumorigenecity.
