细胞色素氧化酶染色液(DAB法)使用说明书

制备细胞爬片1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。

再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。

将培养皿（6孔细胞培养板）置于 37℃，含 5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。

2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。

3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。

4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。

5、加 10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定 10～15min。

6、吸除固定液，加 PBS 再洗涤细胞爬片 3 次，每次 5 min。

7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。

8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。

将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。

免疫荧光双染用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案1)冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定 10～15min。

（细胞爬片固定后，以下步骤一样）2)漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。

PBS液是用来漂洗和稀释的。

其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。

3)在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。

（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟4)阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。

（37℃）（一抗前不洗，只甩干）5)原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。

dab显色原理
Dab显色原理是一种常用于生物医学研究中的显色技术。

它可以将目标分子在组织切片或细胞中的位置和数量可视化。

在Dab显色过程中，主要涉及到三种重要的化学试剂：过氧化氢（H2O2）、二乙基氨基乙醇（DEA）、3,3'-二氨基苯基-4,4'-二噻唑啉（DAB）。

其中，过氧化氢作为催化剂，能够加速Dab显色反应的进行。

Dab显色的基本步骤如下：首先，将含有待检测分子的组织切片或细胞涂片进行固定和脱脂处理，以保持其形态结构的完整性。

然后，在脱脂的组织切片或细胞上加入过氧化氢溶液，用于去除可能存在的内源性过氧化物酶活性，以减少非特异性的背景染色。

接下来，加入含有DAB的缓冲液，该缓冲液中还包含DEA作为显色前体。

在有氧的环境下，过氧化氢将DEA氧化成亲电性很强的丙烯酮（acenaphthenequinone），丙烯酮能与DAB发生环加成反应。

在这个反应中，丙烯酮的C-C双键打开，形成与DAB结合的加成产物，这个产物在酸性条件下会发生进一步的氧化反应，生成深棕色的染色产物。

这种染色产物可以在光学显微镜下可见，从而实现对目标分子的定位和定量分析。

总之，Dab显色原理通过利用过氧化氢作为催化剂，使得DEA与DAB发生环加成反应，生成深棕色的染色产物，从而实现对待检测分子的可视化分析。

免疫组织化学技术一，流程图：二，详细操作：（一）制作石蜡切片（详见后面的材料）（二）脱蜡，透明，水化1）脱蜡前先60度烘片30-40min;2）二甲苯脱蜡透明：将切片置于二甲苯中（3缸），各15min。

注意：若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色，说明脱水没有脱干净，可重新放置二甲苯中；液体一定要没过标本3）梯度乙醇入水：将切片依次置入100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇中，纯水（自己接），各5min;（三）抗原修复操作：1）6min45s烧开修复液(柠檬酸0.2g+柠檬酸三钠 1.5g蒸馏水稀释至500mL,PH为6.0)2）将组织放入修复液置于微波炉中焖5分钟3）将修复液1min20s再烧开4）组织再焖5分钟5）取出烧杯，使液体和组织自然冷却6）PBS冲洗3分钟1次,0.1%triton 10min(破坏细胞膜)，PBS 冲洗3分钟1次（四）孵育操作：1）阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢10min，PBS冲洗3分钟x3次；2）封闭（非特异性染色阻断剂）：每个脑片35ul山羊血清，室温下孵育30分钟（注意：此步操作后不用PBS冲洗）；3）加一抗(PCNA兔抗大鼠)：滴加适当比例稀释的一抗工作液（1:200比较好）2h，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；加完一抗后，最好4度冰箱过夜，注意标本要保持湿度，可放在湿盒，第二天在37度或者室温复温30—40min，复温也要放在湿盒内4）加二抗（生物素标记的羊抗兔IgG复合物）：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；5）加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；（五）显色1）DAB染色：每个脑片35ul新鲜配制的DAB显色液，室温孵育10-20s（颜色有变就好，条件要自己摸）→大量自来水冲洗。

2）苏木素复染：苏木素染色30s（可以用塑料架子浸泡或者枪头滴）→自来水冲洗→PBS溶液返蓝10-20min（还可以浸泡10min的纯水）3）脱水，透明，封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明2-3分钟→中性树胶封片（现用电吹风吹干片，直接用中性树脂封片，晾干，观察片有脏时，可以用二甲苯擦洗背面）备注：1、PBS配制：团队常用一包PBS粉末，配制2000ml纯水，加6ml 的NAOH，PH在7.2-7.4，（不同的粉末，配制不一样，加入的NAOH 或者酸量不同，但是PH一般是一样的）2、一抗工作液，一般配制成5ml，0.3%的牛血清（0.15g），5%的羊血清（250ul），余加纯水3、一抗的浓度，不同的实验，浓度，物质都是不一样的4、DAB：缓冲液：底物：色源=20:1:1，每次配制都要有预留的部分，防止误差5、用枪：不要触及液体的地步，一档吸二档打完。

dab染色方法流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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1. 切片脱蜡和水化。

用二甲苯脱蜡三次，每次 5 分钟。

DAB染色及观察
染色液配方为：1 mg/ml的二氨基联苯胺（diaminobenzine, DAB, Sigma），pH调节至3.8。

具体染色步骤为：将样品轻轻加入染色液中，25 ℃光照下染色8 h；除去染色液，加入95％的乙醇，脱色12 h-24 h；水悬浮，镜检，拍照。

Micro-HR测定
染色液配方：10 ml 85%乳酸，10 ml水饱和酚，10 ml甘油，10 ml纯水，15 mg trypan blue染料。

取1 cm × 1 cm大小的烟草切片或拟南芥整张叶片放入24孔组培板中；加入trypan blue染液，真空抽滤使染液进入细胞间隙；沸水煮沸5-8 min；室温下静置染色6-8 h；用2.5 g/ml的水合氯醛溶液脱色，直到组织完全透明为止；脱色好的叶片在Olympus显微镜下观察，拍照，并统计死细胞数目。

DAB显色试剂盒（20×）说明书货号：DA1010规格：DA1010-3DA1010-10溶液A3ml10ml溶液B3ml10ml保存：-20℃避光密闭保存，一年有效，避免反复冻融；短期可2-8℃保存。

产品简介：DAB是过氧化物酶（POD）的显色底物，DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法，适用于辣根过氧化物酶HRP标记的免疫印记或免疫组化反应。

过氧化物酶催化底物发生反应，于反应部位产生棕色沉淀物，免疫印记可直接在膜上显示条带；免疫组化标本显色时间一般为室温5-20分钟，随后在显微镜下观察显色情况，显色充分后应将标本及时脱水封固，其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。

操作说明：1.对于组织切片或蛋白质印记膜，在与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。

2.取900μl PBS（或双蒸水），加入50μl溶液A，50μl溶液B混合均匀，即配成DAB工作液。

如需要更大体积工作液，可按比例放大。

此溶液必须现用现配，配好后避光保存，1小时内使用，过期后请将剩余的液体废弃。

3.向组织切片或印记膜上加入适量DAB工作液，确保能充分覆盖样品。

4.室温避光孵育3-10分钟或更长时间，避免光照，直至显色至预期深浅。

5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤2-3次即可终止显色反应。

6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可对其进行其他染料复染。

对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

注意事项：1.DAB溶液应低温密封保存。

如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用。

2.显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用。

3.显色时间严格控制，根据情况调整，以免显色过度。

固相膜显色数小时后即会褪色，不能永久存在。

4.DAB为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。

操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。

dab染色液配制方法一、引言Dab染色液是一种常用于生物学实验中的染色试剂，它可以用于检测细胞中的蛋白质、核酸等分子。

本文将介绍一种简单而有效的dab染色液配制方法，帮助读者更好地进行生物学实验。

二、材料准备1. DAB（3,3'-二氨基联苯）粉末：购买自生物试剂公司，质量纯度要求为分析纯或优级纯。

2. 过氧化氢（H2O2）：浓度为30%，可从化学试剂公司购买。

3. 磷酸盐缓冲液（PBS）：用于配制dab染色液的溶剂，可自行配制或购买。

三、配制步骤1. 预先准备好的磷酸盐缓冲液（PBS）加入容器中，容器的大小要根据实验需要来确定。

根据实验需求，可以配制适量的dab染色液，避免浪费。

2. 将PBS溶液加热至60℃左右，用于溶解DAB粉末。

注意，加热过程中要注意安全，避免烫伤。

3. 将需要的DAB粉末称取至容器中，按照一定的比例加入PBS溶液。

一般情况下，DAB的最终浓度为0.05%-0.1%。

4. 使用磁力搅拌器将容器中的溶液搅拌均匀，使DAB充分溶解在PBS中。

搅拌时间根据溶解效果而定，一般需要5-10分钟。

5. 将溶液过滤，以去除其中的杂质。

使用无菌滤纸或0.22μm的滤膜进行过滤，确保溶液的纯净度。

6. 将过滤后的溶液分装至小容器中，避免长时间保存。

分装后的dab染色液需要避免阳光直射，存放在阴凉干燥的地方。

7. 在使用dab染色液前，将小容器中的液体充分混合均匀，以确保染色效果的稳定性。

四、注意事项1. DAB粉末具有一定的毒性，使用过程中要注意防护措施，避免吸入或接触皮肤和眼睛。

2. 在配制dab染色液时，可以根据实验需求调整DAB的浓度，但不宜超过最大浓度。

3. 使用过程中要避免阳光直射，以免影响染色效果。

4. 分装后的dab染色液应尽快使用，避免长时间存放。

5. 使用过程中要注意实验室的卫生和安全，及时清理实验台面和废液。

五、结论本文介绍了一种简单而有效的dab染色液配制方法。

dab染色方法流程英文回答：Dab staining is a common method used in molecular biology and immunohistochemistry to detect specific molecules or proteins in tissues or cells. It involves the use of a chromogenic substrate that produces a visible color reaction when it reacts with an enzyme linked to the target molecule.The general process of dab staining can be divided into several steps:1. Sample preparation: This step involves fixing the tissue or cells onto a slide and ensuring that they are properly preserved for staining. Different fixation methods can be used depending on the nature of the sample.2. Blocking: Before applying the primary antibody, itis important to block any non-specific binding sites on thesample to reduce background staining. This is typically done by incubating the sample with a blocking agent such as bovine serum albumin (BSA) or non-fat milk.3. Primary antibody incubation: The primary antibody, which specifically recognizes the target molecule, is applied to the sample and allowed to bind to its target. The incubation time and temperature can vary depending on the specific antibody and target.4. Washing: After the primary antibody incubation, the sample is washed to remove any unbound antibody and reduce background staining. This is typically done using a buffer solution such as phosphate-buffered saline (PBS).5. Secondary antibody incubation: A secondary antibody, which is conjugated to an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), is applied to the sample. The secondary antibody recognizes and binds to the primary antibody, allowing for the amplification of the signal.6. Washing: Similar to the previous step, the sample iswashed to remove any unbound secondary antibody.7. Dab substrate application: The dab substrate, which is a chromogenic substrate, is applied to the sample. The substrate reacts with the enzyme linked to the secondary antibody, resulting in the formation of a visible color reaction.8. Stopping the reaction: The color reaction can be stopped by washing the sample with distilled water or a stop solution. This prevents overdevelopment of the color reaction.9. Mounting and observation: Finally, the stained sample is mounted with a mounting medium and observed under a microscope. The presence of the target molecule is indicated by the presence of the color reaction.中文回答：Dab染色是分子生物学和免疫组化中常用的一种方法，用于检测组织或细胞中特定分子或蛋白质。

dab染色原理引言：dab染色（Diaminobenzidine）是一种常用于免疫组化实验中的染色方法。

它可以帮助科学家观察和分析细胞或组织中的特定蛋白质、抗体等分子。

本文将详细介绍dab染色的原理及其在实验中的应用。

一、dab染色的原理dab染色的原理基于酶促反应。

在dab染色过程中，首先将样品与特定的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

然后，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗加入样品中，与抗原-抗体复合物结合。

最后，加入dab底物，HRP催化底物在存在氢氧化物离子的条件下发生氧化反应，产生可见的棕色沉淀物。

二、dab染色的步骤1. 样品制备：首先，需要对样品进行固定和包埋处理，使其保持形态和结构。

常用的固定剂有甲醛和乙酸乙酯等。

2. 抗原修复：有些抗原在固定过程中会发生变性，需要进行抗原修复，使其恢复原有的结构。

抗原修复的方法包括热处理、酶解等。

3. 阻断非特异性结合：为了降低假阳性的发生，需要使用一些非特异性蛋白质（如牛血清白蛋白）来阻断非特异性结合位点。

4. 抗体结合：将特异性的一抗加入样品中，与待检测的抗原结合。

5. 二抗结合：加入HRP标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

6. 底物反应：加入dab底物，HRP催化底物发生氧化反应，产生棕色沉淀物。

7. 染色停止：通过水洗的方式停止底物反应，避免染色过度。

8. 盖片封装：将染色后的样品放置于玻璃盖片上，加入封片剂，固定样品并保护染色结果。

三、dab染色的应用dab染色广泛应用于免疫组化实验中。

通过对组织切片或细胞进行dab染色，可以观察和分析特定蛋白质的存在和分布情况。

例如，科学家可以利用dab染色技术来研究肿瘤组织中特定肿瘤标志物的表达，从而帮助诊断和治疗癌症。

dab染色还可以用于研究神经生物学、免疫学、细胞生物学等领域。

通过对脑片、淋巴组织、细胞培养物等进行dab染色，科学家可以研究神经元的连接、免疫细胞的活性以及细胞器的定位等。

总结：dab染色原理简单、灵敏度高，因此被广泛应用于免疫组化实验中。