DNA提取液配方及步骤

裂解液配方：100mmol Tris-Hcl(PH8.0);25mmol EDTA(PH 8.0);500mmol NaCl;1%SDS母液配制：1.500mmol Tris-Hcl（PH8.0）称取15.1425g Tris，加入150ml 蒸馏水，加入Hcl调PH至8.0，定容至250ml。

2.100mmol EDTA或EDTA-Na2称取7.3062g EDTA或8.455g EDTA-Na2，加入200ml 蒸馏水，调PH至8.0，定容至250ml。

3.5mol NaCl称取29.22g NaCl，加入90ml 蒸馏水，定容至100ml。

4.10% SDS称取10gSDS,加入100ml蒸馏水。

蛋白酶K配置：10mg/ml蛋白酶K溶液。

称取10mg蛋白酶K粉末，加入1ml蒸馏水溶解。

-20度保存。

配制1000ml裂解液：加入溶液1体积为200ml，加入溶液2体积为250ml，加入溶液3体积为100ml，加入溶液4为100ml。

配制500ml裂解液则相应减半。

步骤：1.在1.5ml离心管中加入0.2ml（200ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，加入2ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴2-4h。

2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml，水浴30min。

3.加入0.7ml苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻微颠倒混匀，14000rpm离心5min。

4.中号枪头切去头部，抽取上清，重复抽提一次。

5.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），14000rpm离心5min。

6.取上清，加入2-2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，材料用量较多的昆虫可看到DNA沉淀，材料用量较少或酒精长时间浸泡着的标本可在-70度放置30min，14000rpm离心5min。

7.75%乙醇漂洗沉淀两次，无水乙醇漂洗，室温干燥。

8.根据沉淀量，加入30-50ulddH2O。

方法二：1.在1.5ml离心管中加入0.1ml（100ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，用400ul裂解液冲洗研磨棒，加入5ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴1-2h。

提取DNA：CTAB法
预先准备：黄枪头、蓝枪头（最好剪去头部），小研钵，2ml离心管，液氮
药品：CTAB、β-巯基乙醇、RNA消化酶、冰冻酒精、NaAc
1 取叶片于研磨中，在磨好的样品中加入1-2ml CTAB，20-40ul的
β-巯基乙醇,等溶化成稀糊状态时倒入2ml离心管。

2 加入1-2ul RNA 消化酶-----可不加
3 放入65℃水浴锅加热30min,每隔五分钟上下颠倒几次
4 离心15min 12000r 温度无要求；
5 取上清夜800-1000ul；加入等体积 24：1的三氯甲烷：异戊醇和
苯酚(未加) 上下颠倒3-5min；离心10min 12000r
6 取上清液800-1000ul；再加入等体积24：1的三氯甲烷溶液，上
下颠倒3-5min；离心10min 12000r
7 取上清液600-800ul；加入1/10上清液体积的 3M NaAc之后上下
颠倒3-5min 一般加入70ul左右的3M NaAc
8 先静置3-5min，后加冰冻酒精，加满为止，摇晃3-5min
9 放在-20℃冰箱过夜（静置12小时）
10弃掉上层液体，加入1ml 的70%酒精，摇晃3-5min，
11离心5min 12000r,去掉上清液，再加1ml的70%酒精，摇晃3-5min，12离心5min 12000r去掉上清液，尽量把离心管内的残留液吸干
13放入超净工作台风干；加入70-100ul的灭菌水。

(1)将小麦叶片（约0.1g）放入研钵中，加入液氮冷冻，快速研成粉末后倒入1.5mL离心管中；(2)每管加入600μL SDS DNA提取液（含2%的巯基乙醇），于65℃水浴30min，其间温和混匀几次；(3)取出离心管，加入60μL 5mol/L KAc，立即上下颠倒温柔混匀（5~6次），冰上放置20min；(4)于12,000 rpm离心10min；(5)将上清液（约600μL）转移至新的离心管中，加入4μL RNase，室温放置5min；(6)加入600μL酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）；(7)于12,000 rpm离心15min；(8)将上清液转移至新的离心管中，记下体积，加入0.6~0.7倍体积的异丙醇，于-20℃下沉淀10~30min；(9)于10,000 rpm离心5min，弃上清，将沉淀用75%乙醇洗2~3次；(10)挥发干净乙醇，加入50μL ddH2O，-20℃保存;(11)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。

学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

CTAB法DNA提取液
2%CTAB 2000ml配方
CTAB 40g
Nacl 163.64g
1M/L Tris-Hcl 200ml
0.5M/L EDTA 80ml
----------------- 定容至2000ml
1M/L Tris-Hcl 500ml配方
Tris 60.6g
加400ml水搅拌溶解
冷却后加浓盐酸调PH至8.0
定容至500ml
0.5M/L EDTA 500ml配方
EDTA 93.06g
加NAOH调PH至8.0
定容至500ml
注：1M/L Tris-Hcl和0.5M/L EDTA配方跟你配TPS一样。

2%CTAB配方可以到Takara或者其他生物公司目录上查询。

提取步骤
该法提取叶片DNA和TPS法稍有不同，简略如下：
1.提取液加800ul，当然也可以修改；
2.水浴温度改为650C，30min；
3.加500ml氯仿，上下震荡几下即可。

不过你的材料可能要死命震荡几分钟看看咋样，最好再重新用氯仿抽提一遍;
4.12000r/min离心10min,吸取上清液(比如200ml);
5.加2.5倍体积的无水酒精（比如500ml）；
6.其他步骤就一样啦。

7.如果你想提取更高质量的DNA，可以在倒掉酒精之后，用75%酒精把DNA 再洗几遍。

8.如果以上步骤还不行，那就baidu或者小木虫吧。

酚氯仿法提取DN蛀要步骤和原理酚氯仿法提取DNA 主要步骤：1.将动物组织放在1.5ml 的离心管中，分别用75% 、50% 酒精和纯水梯度脱酒精。

每个梯度脱水时间为5-10min2.将组织放入研钵中，加入适量DNA 裂解液（300a）,研磨后再加入300a IDNA裂解液冲洗研磨棒。

3.将研磨好的组织液用移液枪加到 1.5ml 离心管，在管中加10al蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56C,5h）。

4.加入等体积的Tris饱和酚（500 a）,摇匀（10min）。

5.离心：12000R, 7min, 4C。

离心后分成上中下三层，上层为DNA ，中层为蛋白质，下层为有机质。

6.吸取上层液体加入新的离心管。

7.配制Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1 。

8.在含有上清液的离心管中加入Tris 饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450 a,摇匀10min。

9.离心：12000R, 7min, 4C。

10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400a 1（氯仿：异戊醇=24:1）。

11.离心：12000R, 7min, 4C。

12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5 倍经过-20 C冷冻的100%的酒精。

-20 C过夜。

13.将样品取出，12000R, 7min, 4C离心。

14.弃上清，留白色沉淀（DNA ），加400卩的75% 的经过-20C冷冻的酒精，反复吹打溶解。

15.重复第14 步骤2 次（用75%酒精洗三次）。

16.提取DNA 完成。

溴氯仿法提取DNA 的原理：用酚抽提细胞DNA 时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。

缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。

一、试剂盒打开后需要准备的工作1、ProteinaseK（蛋白酶K）的溶解①取4.5ml双蒸水加入蛋白酶K粉中使其充分溶解②将溶解好的蛋白酶K溶液分装进小离心管，每管100u l〜200ul③将分装好的ProteinaseK放入-20°C冰箱中保存，使用期限为12个月2、组织抑制剂（InhibitorRemovalbfer）的调配加入20ml无水乙醇（absoluteethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩3、洗液（washbuffer）的调配加入80ml无水乙醇（absoluteethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩二、组织DNA提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将采集来的样品剪碎（WO.lcm）洗净保存液。

②加入组织破解液Tissue-lysis200ul蛋白酶K40ul然后放入55C水浴锅内3个小时使其充分消化。

2、DNA提取①在消化好的组织样品中加入结合液bindingbuffer200ul然后放入70°水浴锅中10分钟。

②再加异丙醇lOOul混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g—分钟。

③倒掉底液，加500ul组织抑制剂InhibitorRemoval然后离心倒掉底液④加洗液washingbuffer500ul离心（洗液加两次）⑤在70C预热ElutionBuffer，然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加入ElutionBuffer200ul溶解10分钟离心保留底液放-20C保存。

三、细胞DNA的提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将带有培养基的样品用PBS清洗干净8000rpm/1min离心，倒掉上清②加PBS200ul振荡摇匀使之样品成为单个细胞的悬浊液③加200ulBindingBuffer，40ul蛋白酶K混合均匀放入70C水浴锅内消化10分钟。

2、DNA提取①加异丙醇lOOul混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g—分钟。

酚氯仿法提‎取DNA主‎要步骤：1.将动物组织‎放在1.5ml的离‎心管中，分别用75‎%、50%酒精和纯水‎梯度脱酒精‎。

每个梯度脱‎水时间为5‎-10min‎2.将组织放入‎研钵中，加入适量D‎N A裂解液‎（300μl‎），研磨后再加‎入300μ‎l DNA裂‎解液冲洗研‎磨棒。

3.将研磨好的‎组织液用移‎液枪加到1‎.5ml离心‎管，在管中加1‎0μl蛋白‎酶K，用封口带将‎离心管封口‎，放入摇床（56℃,5h）。

4.加入等体积‎的Tris‎饱和酚（500μl‎），摇匀（10min‎）。

5.离心：12000‎R，7min，4℃。

离心后分成‎上中下三层‎，上层为DN‎A，中层为蛋白‎质，下层为有机‎质。

6.吸取上层液‎体加入新的‎离心管。

7.配制Tri‎s饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。

8.在含有上清‎液的离心管‎中加入Tr‎i s饱和酚‎、氯仿和异戊‎醇混合液4‎50μl，摇匀10m‎i n。

9.离心：12000‎R，7min，4℃。

10.吸取上清液‎加到新的离‎心管，加入等体积‎的氯仿和异‎戊醇混合液‎400μl‎（氯仿：异戊醇=24:1）。

11.离心：12000‎R，7min，4℃。

12.吸取上清液‎加入新的离‎心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的10‎0%的酒精。

-20℃过夜。

13.将样品取出‎，12000‎R，7min，4℃离心。

14.弃上清，留白色沉淀‎（DNA），加400μ‎l的75%的经过-20℃冷冻的酒精‎，反复吹打溶‎解。

15.重复第14‎步骤2次（用75%酒精洗三次‎）。

16.提取DNA‎完成。

溴氯仿法提‎取DNA的‎原理：用酚抽提细‎胞DNA时‎，有什么作用‎？使蛋白质变‎性，同时抑制了‎D Nase‎的降解作用‎。

用苯酚处理‎匀浆液时，由于蛋白与‎D NA联结键已断‎，蛋白分子表‎面又含有很‎多极性基团‎与苯酚相似‎相溶。

蛋白分子溶‎于酚相，而DNA 溶‎于水相。

(1)将小麦叶片（约0.1g）放入研钵中，加入液氮冷冻，快速研成粉末后倒入 1.5mL 离心管中；(2)每管加入 600μL SDS DNA 提取液（含 2%的巯基乙醇），于 65℃水浴 30min，此间平和混匀几次；(3)拿出离心管，加入 60μL 5mol/L KAc ，立刻上下颠倒温柔混匀（5~6 次），冰上搁置20min；(4)于 12,000 rpm 离心 10min；(5)将上清液（约 600μL ）转移至新的离心管中，加入4μL RNase，室温搁置 5min；(6)加入 600μL 酚：氯仿：异戊醇（ 25:24:1）；(7)于 12,000 rpm 离心 15min；(8)将上清液转移至新的离心管中，记下体积，加入0.6~0.7 倍体积的异丙醇，于 -20℃下积淀 10~30min；(9)于 10,000 rpm 离心 5min，弃上清，将积淀用75%乙醇洗 2~3 次；(10)挥发洁净乙醇，加入50μL ddH2O，-20℃保存 ;(11)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

一、实验目的掌握植物总 DNA 的抽提方法和基根源理。

学习依据不一样的植物和实验要求设计和改进植物总 DNA 抽提方法。

二、实验原理往常采纳机械研磨的方法破裂植物的组织和细胞，因为植物细胞匀浆含有多种酶类(特别是氧化酶类)对DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强复原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，资料易于破裂，并减少研磨过程中各样酶类的作用。

十二烷基肌酸钠 (sarkosyl) 、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为 CTAB) 、十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate ，简称 SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，进而使 DNA 得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸 (DNA 、 RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除掉细胞碎片和大多半蛋白质。

试剂配方1. 0.5M EDTA(pH8.0)溶液:80ml dd H2O中加入18.61g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0后用dd H2O定容至100ml，121℃高压灭菌20min 备用。

2. 10%SDS溶液：在100ml dd H2O中溶解10g电泳级SDS，加热至68℃助溶,备用（无须灭菌）。

3. 1M Tris溶液在80ml dd H2O中溶解12.191g Tris碱，加入浓HCl调pH值至8.0，加dd H2O定容至100ml，121℃高压灭菌20min（溶液冷至室温后最后再调定一次pH值）。

4. 细胞裂解液组成：1M Tris-Cl（pH=8） 2.5ml0.5M EDTA（pH=8） 50ml dd H2O定容到250ml10％SDS 12.5ml5.TE溶液1M Tris-Cl（pH=8） 1ml0.5M EDTA（pH=8） 0.2ml dd H2O定容至100ml6.70%乙醇66.315ml 95%乙醇，加dd H2O定容至90ml，-20℃保存备用。

7.75%乙醇78.947ml 95%乙醇，加dd H2O定容至100ml，-20℃保存备用。

8.蛋白酶K（20mg/ml）100mg蛋白酶K加5ml 灭菌dd H2O，混匀后，在冰上静止3min左右，分装到灭菌后的EP 管中，每管200 ul到500 ul为宜，存于-20℃保存备用。

9.50×TAE（电泳缓冲储备液）（pH=8.5）在400ml dd H2O中加入121g tris 和18.6g Na2·EDTA·2H2O，充分搅拌混匀，再加入28.55ml 醋酸，充分搅拌，待无沉淀后dd H2O定容至500ml，常温保存备用。

10.1×TAE（电泳缓冲工作液）用量筒量取100ml 50×TAE储备液，倒入5L塑料桶中，加dd H2O至5L刻度线即可。

主要成分是：NaCl，Tris-HCl（PH=7.4），EDTA（PH=8），SDS。

NaCl，Tris-HCl主要是调节溶液的PH，维持一定的离子浓度,提供一个缓冲液的环境，防止核酸被破坏；EDTA主要是二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子，锰离子，镁离子等和EDTA结合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA；SDS主要是和蛋白质结合，使其变形沉淀，从而利于DNA的提取，减少和清除带白质杂质；裂解细胞！配方：每升中加入EDTA 9.3g， SDS 5g， NaCl 14.6g， Tris 24.2g 相当于Tris 200mM PH=7.4 EDTA 25mM PH=8注意：Tris与EDTA 应当分别配好调PH值器材：灭菌的研磨棒，离心管，配好的DNA提取液，1000ul的移液枪，预冷的异丙醇，离心机，７５％的乙醇，灭超水拟南芥ＤＮＡ粗提步骤；１．选取两片适当大小的叶片放入１．５ｍｌ离心管（已标记）中，用液氮浸没１—２ｓ，取出立刻磨碎至粉末状。

或不用液氮，研磨至匀浆状；２．加入ＤＮＡ提取液８００ｕｌ溶解，同时再次磨样，使之彻底为匀浆，摇匀；３．在１２０００ｒｐｍ条件下，离心１０ｍｉｎ，取上清至另一新离心管（同标记）中，弃去沉淀，（切记：宁少勿沉淀）；４．加入７００ｕｌ异丙醇（－２０℃预冷）至管中，摇晃混匀，然后放置－２０℃下１－２ｈ，或者４℃下过夜，析出ＤＮＡ；５．在１２０００ｒｐｍ下，离心１０ｍｉｎ，弃上清，留沉淀；６．向沉淀中加入７００ｕｌ、７５％的乙醇，进行洗涤，然后在１２０００ｒｐｍ下，离心４ｍｉｎ，重复三次；７．倒出乙醇，在超净工作台上吹干，加入５０ｕｌ灭超水溶解，１２０００ｒｐｍ下，离心４ｍｉｎ，吸取上清液，转至另一新管中备用。

基因组DNA的提取一、从哺乳动物组织提取基因组DNA实验材料：液氮、消化缓冲液、PBS（冰冷）、25:24:1酚/氯仿/异戊醇、7.5M乙酸铵、无水乙醇及70%乙醇、0.1%SDS、RNA酶、TE缓冲液（pH8.0）、离心管、研钵、冷冻离心机。

实验步骤：1.取新鲜或冰冻动物组织块，剪成小块。

置于液氮中冻结。

2.将500mg的组织用预冷的研钵和研杵研碎，或用小锤子将其捣为细粉末，每100mg组织用1.2 mL消化缓冲液悬浮。

3.将6ml样品在盖紧的离心管中于50℃摇荡下温育12～18 h。

4.用6ml酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700g离心10 min。

如果样品溶解得不好，再加6ml不含蛋白酶K的消化缓冲液，并重复离心。

如果在界面上有一层厚的白色物质，重复有机抽提，将上层(水溶液)转移至一个新管中。

5.加入6ml 7.5M乙酸铵和24ml 100%乙醇，1700g离心2 min。

6.用70%乙醇洗涤，晾干，沉淀用TE缓冲液重新溶解，使终浓度在约1mg/mL左右。

7.加入0.1%的SDS和1pg/mL无DNA酶的RNA酶，37℃温育1h,以除去残留的RNA.重复步骤 4～5。

二、从植物组织提取基因组DNA实验材料：液氮/干冰、2-巯基乙醇(2-ME)、 CTAB抽提液、CTAB/NaCl溶液、24:1(v/v)氯仿/异戊醇、CTAB沉淀液、高盐TE缓冲液、80%乙醇、TE缓冲液、抗有机溶剂的试管和烧杯、研钵和研杵、粉碎器/匀浆器、捣碎机、恒温金属浴、冷冻离心机。

实验步骤：1.取1g的鲜叶组织，在3.2ml CTAB抽提液中加入0.8ml 2-巯基乙醇，使终浓度达2%(v/v)。

将此溶液及1ml CTAB/NaCl溶液加热至65℃。

2.用液氮(-196℃)或干冰(一78℃)冷却粉碎器/匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。

3.往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润，65℃温育10～60min,不时混匀：4.用4ml的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃, 7500g离心5 min(对于小样品，在离心机上以10000 r/min离心),回收上(水)相。

CTAB配方及植物DNA提取方法主要试剂的配制参考（美）萨姆布鲁克（sambrook，j.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：（1）0.5mo1/ledta(ph8.0)：称取edta-na218.61g，提80ml双蒸水，磁力搅拌器上频繁烘烤。

重新加入7ml10mo1/lnaoh调到ph8.0再用双蒸水定容至100ml，在1.03×105pa之下高压杀菌20min。

（2）5mol/lnacl溶液：称取nacl29.22g，溶解于90ml的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100ml，在高压灭菌20min。

（3）10mol/lnaoh溶液：称取40.00gnaoh溶80ml的双蒸水，烘烤，定容至100ml。

（4）1mol/ltris-hc1溶液(ph8.0)：称取12.114gtris碱，溶80ml的双蒸水，重新加入浓hc14.2ml，调整phsuperficial8.0，搅拌定容至100ml，高压杀菌20min。

（5）10%ctab（m/v）：称取ctab10.00g，熔化于80ml的双蒸水，冷却推动熔化，提双蒸水定容至100ml，室温留存。

（6）5mo1/lkac溶液(ph4.8和6.5)：分别称取kac晶体49.07g，溶于80ml的双蒸水，再用冰乙酸调至ph4.8和6.5，加双蒸水定容到100ml，在1.03×105pa之下杀菌20min。

4℃留存。

（7）3mo1/lnaac3h2o溶液(ph5.2)：称取naac晶体20.412g熔化于约30ml的双蒸水，用冰乙酸调到ph5.2，提双蒸水定容至50ml，高压杀菌20min。

4℃留存。

（8）提取缓冲液（0.4mol/l葡萄糖，3%pvp，2％β-巯基乙醇）250ml：称取葡萄糖19.817g、pvp7.50g，加水溶解并定容到250ml，在1.03×105pa下灭菌20min，β-巯基乙醇现用现加。

附录1：实验程序及所用溶液配方实验程序1：DNA小量提取法（SDS小量提取法）1. 取每个水稻样本新鲜叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮磨碎。

2. 加入700ul已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴30min。

3. 加入200ul 5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，40C 8000转离心5min，将上层液倒入另一新的1.5ml eppondorf管中。

4. 加入等体积的异丙醇，置于-200C 30min，40C 10000转离心4min。

5. 弃上清，加入70% 乙醇清洗，晾干。

6. 将风干的DNA溶于100ul TE溶液中，存于40C备用。

实验程序2：DNA大量提取法（SDS大量提取法）1.准备工作：将DNA提取液放于650C的水浴锅中预热，将异丙醇放于-200C冰箱中预冷，选好50 ml的离心管灭菌。

2.每个水稻样本新鲜叶片取1-3g，剪碎，放入研钵，加入液氮磨碎。

3.将研磨好的叶片转于50ml的离心管中，加入20ml已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水中，温浴20min，以使反应充分完全。

4.取出离心管，加入5 ml 5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴20min，冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。

5.加入15ml氯仿，嫩叶片会起泡沫，老叶片则变成墨绿或变黑。

室温下以3000（10000 rmp的速度离心 3min），将上层液倒入另一新的50 ml离心管中。

6.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀。

7.待DNA结块，用玻棒挑出DNA，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。

8. 将风干的DNA溶于500ul TE溶液中，存于40C备用。

SDS抽提液1M Tris-Hcl 100ml Ph 8.00.5MEDTA 100ml pH 8.05MNaCl 100ml10%SDS （十二烷基硫酸钠）） 125ml加蒸馏水定容至1000ml。

DNA提取实验方案
材料与试剂：
1.细胞样本（如血液、组织等）
2.细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶K）
3.蛋白酶K
4.乙醇
5.蛋白质沉淀液
6.正丁醇
7.氯仿
8.等离子水
9.TE缓冲液
10.离心管
11.磁珠
12.磁珠悬浊液
13.热拌器
14.离心机
实验步骤：
1.细胞破裂：将细胞样本加入细胞裂解缓冲液中，加入适量蛋白酶K，放入热拌器中破裂细胞，使DNA溶解在缓冲液中。

2.蛋白质沉淀：加入等体积的蛋白质沉淀液，轻轻混匀，离心使蛋白
质沉淀。

3.DNA沉淀：将上清液转移至新的离心管中，加入适量的乙醇，轻轻
混匀，使DNA沉淀。

4.DNA纯化：将DNA沉淀用等离子水悬浊，加入等体积的正丁醇和氯仿，混匀后离心，取上清液，加入等量的等离子水和TE缓冲液。

5.纯化DNA：将上清液转移至带有磁珠的离心管中，加入磁珠悬浊液，混匀后在离心机中进行离心，使DNA和磁珠结合。

6.洗涤DNA：将离心管中的上清液丢弃，加入70%乙醇洗涤DNA，多
次洗涤后去除乙醇，干燥磁珠。

7.溶解DNA：最后用等离子水或TE缓冲液溶解DNA，即可用于后续的
实验。

通过上述步骤，可以从细胞样本中提取出纯净的DNA，用于后续的分
子生物学实验。

DNA提取是一项基础而重要的技术，在分子生物学和遗传
学研究中具有广泛的应用价值。

希望以上方案可以帮助您顺利进行DNA提
取实验。

主要成分是：NaCl，Tris-HCl（PH=7.4），EDTA（PH=8），SDS。

NaCl，Tris-HCl主要是调节溶液的PH，维持一定的离子浓度,提供一个缓冲液的环境，防止核酸被破坏；EDTA主要是二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子，锰离子，镁离子等和EDTA结合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA；SDS主要是和蛋白质结合，使其变形沉淀，从而利于DNA的提取，减少和清除带白质杂质；裂解细胞！配方：每升中加入EDTA 9.3g， SDS 5g， NaCl 14.6g， Tris 24.2g 相当于Tris 200mM PH=7.4 EDTA 25mM PH=8注意：Tris与EDTA 应当分别配好调PH值器材：灭菌的研磨棒，离心管，配好的DNA提取液，1000ul的移液枪，预冷的异丙醇，离心机，７５％的乙醇，灭超水拟南芥ＤＮＡ粗提步骤；１．选取两片适当大小的叶片放入１．５ｍｌ离心管（已标记）中，用液氮浸没１—２ｓ，取出立刻磨碎至粉末状。

或不用液氮，研磨至匀浆状；２．加入ＤＮＡ提取液８００ｕｌ溶解，同时再次磨样，使之彻底为匀浆，摇匀；３．在１２０００ｒｐｍ条件下，离心１０ｍｉｎ，取上清至另一新离心管（同标记）中，弃去沉淀，（切记：宁少勿沉淀）；４．加入７００ｕｌ异丙醇（－２０℃预冷）至管中，摇晃混匀，然后放置－２０℃下１－２ｈ，或者４℃下过夜，析出ＤＮＡ；５．在１２０００ｒｐｍ下，离心１０ｍｉｎ，弃上清，留沉淀；６．向沉淀中加入７００ｕｌ、７５％的乙醇，进行洗涤，然后在１２０００ｒｐｍ下，离心４ｍｉｎ，重复三次；７．倒出乙醇，在超净工作台上吹干，加入５０ｕｌ灭超水溶解，１２０００ｒｐｍ下，离心４ｍｉｎ，吸取上清液，转至另一新管中备用。

DNA提取实验步骤：（1）取1g左右幼叶，放入研磨小管然后放入钢珠，研磨前放入盛有液氮的保温桶冷冻一段时间，然后利用研磨机器研磨成粉末，-70℃冰柜保存；（2）65℃水浴锅中预热裂解缓冲液（加入Vitc和β-巯基乙醇）；（3）从-70℃冰柜拿出带有粉末的离心管，将800ul体积的裂解液（水浴锅中预热）倒入管中并摇至均匀，然后放于65℃水浴槽中水浴35min，每隔10min摇一次；（4）向管中加入800ul氯仿-异戊醇（24：1）抽提液，并摇至均匀。

放入离心机内，4℃以12000r/s离心20min；（5）吸取上清置于另一个1.5ml离心管中，重复步骤4一次（再次抽提一次）；（6）吸取上清置于新的离心管中，加入500ul的冰冻异丙醇，并缓慢摇至絮状DNA沉淀析出，于-20℃中放置15min；（7）钩出沉淀，置于1.5离心管中，用70%酒精洗至酒精无色，利用无水乙醇再次漂洗一遍，弃去无水乙醇，将装有DNA的离心管放于真空抽干机内风干45minDNA提取各溶液配方：（1）500ml 1M Tris母液（PH8.0）Tris碱60.55g 浓HCl 21ml 超纯水400ml因Tris溶液的PH值受温度影响较大，绪冷却至室温后用浓HCl调节PH至8.0，然后用超纯水定溶至500ml，灭菌后使用（2）500ml 0.5M EDTA母液（PH8.0）Na2EDTA 93.05g NaOH 10g 超纯水400ml边搅拌边加入NaOH颗粒，但PH接近8.0时，溶液由浑浊变清澈，最终调节至PH8.0，用超纯水定溶至500ml，灭菌后使用（3）500ml 1x TE (PH8.0)1M Tris-HCl 5ml 0.5M EDTA 1ml 超纯水480ml加超纯水定溶至500ml，灭菌后使用。

棉花DNA提取-裂解缓冲液配方：试剂终浓度每升用量1M Tris母液0.1M 100ml0.5M EDTA 0.025M 32mlNaCl 1.5M 87.6gCTAB 2% 20gPVP 40 2% 20gVITC（使用前加）0.3% 3gΒ-巯基乙醇（使用前加）3% 30mlPCR反应体系----10ulddH20 6.2ul Taq酶0.1ul模板DNA 1.2ul Buffer 1.0uldNTP 0.5ul 正向引物0.5ul反向引物0.5ul。

试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。

加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。

加入等体积的异丙醇。

室温10min。

2500rpm,离心10min。

弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。

-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。

弃上清。

将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80?C冻存。

试验要求：血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：试验试剂：Ligsisbuffer：133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖 5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。