血小板膜糖蛋白及凋亡相关联的研究

论文题目：血小板膜糖蛋白与凋亡相关联的研究The research of Platelet MembraneGlycoprotein Associated withApoptosis研究生姓名: 马娜指导教师: 张凤学科专业: 内科研究方向: 血栓与止血论文工作时间: 2013年 12月至2014年3月学位论文原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行实验研究工作所取得的成果，本论文中不包含其他人已经发表或已经获取得的研究成果。

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学位论文作者签名：日期：年月日关于学位论文著作权的共享声明根据《中华人民共和国著作权法》和《高等院校知识产权管理条例》，本学位论文，题目：血小板膜糖蛋白与凋亡相关联的研究，是研究生在导师指导下完成的职务作品，得到蚌埠医学院相关部门科室的物质技术和经费支持，因此，本学位论文的著作权由研究生，导师和蚌埠医学院三方共同享有，均享有署名权和使用权等权益；本学位论文成果归属蚌埠医学院。

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研究生签名：导师签名：日期：年月日目录一、中文摘要 (1)二、英文摘要 (2)三、论文正文1 引言 (3)2 材料与方法 (9)3 结果 (12)4 讨论 (15)5 结论 (20)6 参考文献 (21)四、致谢 (25)五、附录附录A 常用试剂配制 (26)附录B 个人简历 (27)附录C 综述 (28)血小板膜糖蛋白与凋亡相关联的研究中文摘要血小板凋亡是近年来人们研究的热点，凋亡是体内血小板维持自身平衡的一种途径。

研究发现许多物理和化学因素都会引起血小板的凋亡，表现为：线粒体跨膜电位（ΔΨm）的去极化、磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）家族蛋白的表达、半胱氨酸天冬氨酸酶（caspase）家族的表达、血小板形态变化与微颗粒（MP）的释放、细胞骨架蛋白的裂解等。

关于引起血小板凋亡的因素与指标人们了解颇多，但对于血小板膜糖蛋白是否参与血小板凋亡并如何介导该过程的研究则相知较少，血小板膜表面有丰富的膜糖蛋白或受体，如GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物、GPⅡb/Ⅲa、PAR1受体、ADP受体、P-选择素等，并非所有蛋白或受体都参与血小板凋亡过程。

本实验研究发现抗血小板膜表面GPIbα单克隆抗体，SZ-2、AN51抗体能够作为一种微弱的刺激，通过结合血小板膜GPIbα，时间依赖性的诱导ΔΨm去极化、bak和bad表达量增加、bcl-xl、bcl-2和caspase32kd 表达量减少最终导致血小板凋亡，为在研究血小板减少症的机制及治疗方面提供一定理论依据。

关键词：血小板，凋亡，膜糖蛋白，受体、抗血小板抗体The Research Progress of Platelet Membrane Glycoprotein Associatedwith ApoptosisAbstractPlatelet apoptosis is the focus of study in recent years, which can be induced by multiple physical and chemical stimuli with m arkers of apoptosis, that include depolarization of mitochondrial inner membrane, exposure of phosphatidylserine, expression of pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins of Bcl-2 family, activation of apoptosis executioner caspase-3, platelet shrinkage, fragmentation to microparticles. While there’s relatively fewer studies in the relationship between platelet membrane glycoprotein and platelet apoptosis. Platelets are full of abundant membrane glycoprotein or receptors , such as GPIb-IX-V complex、GPIIb/IIIa、PAR1 receptor、ADP/ATP receptor、P- selectin etc, and not all of the proteins or receptors are involved in the platelet apoptosis. In this experiment, a new kind of murine anti-glyprotein (GPIb) monoclonal antibodies, SZ-2 、AN51 time-dependent in duce ΔΨm depolarization, and increase the expression of bak and bad, decrease the expression of bcl-xl and bcl-2, which provide a theoretical basis for studying the mechanism and treatment of thrombocytopenia.Key words：platelet，apoptosis，platelet membrane glycoprotein，receptors, anti-platelet antibodies引言细胞凋亡，又称为“程序性的细胞死亡（programmed cell death，PCD）”，是机体为维持内环境的稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，通过凋亡方式清除破坏的或“不想要”的细胞。

自1972年Kerr[1]等三位科学家首次发现凋亡现象以来，凋亡一直是人们研究的热点，但研究方向主要集中在有核细胞，随后经过20多年的研究，才逐步涉及无核细胞，乃至无核的血小板（1997年）[2]。

血小板的生理功能主要是止血与形成血栓，修补破损的血管,一旦血小板数量或功能发生异常，将导致一系列血小板相关的疾病。

血小板的寿命平均为7～14天，体外保存平均为3-5天，血小板凋亡的研究，不仅打破了传统意义上细胞核在控制细胞生命周期中的主导作用，也为如何延长血小板体外储存时间与生理功能方面的研究掀开崭新的一页。

血小板尽管没有细胞核及核DNA，但含有丰富的线粒体及线粒体mRNA，能够进行蛋白合成和能量代谢，表现出类似凋亡的形态学改变，线粒体在血小板凋亡过程中起着举足轻重的作用。

血小板凋亡的形态学上的改变与有核细胞凋亡保持一致，包括：细胞皱缩、胞膜起泡、伪足生成、凋亡小体脱落和PS外翻。

最初认为这些改变是血小板活化引起的，直到1997年[2]以后才研究发现这些形态学改变是由凋亡引起。

除形态学改变外，血小板凋亡指标还包括：线粒体跨膜电位（ΔΨm）的去极化、磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）家族蛋白的表达、半胱氨酸天冬氨酸酶（caspase）家族的表达、微颗粒（MP）与细胞色素C的释放、细胞骨架蛋白的裂解等。

研究发现，许多物理和化学因素都会导致血小板的凋亡，这些因素主要包括：抗血小板抗体[3]、血小板膜糖蛋白GPI bα受体与血管性血友病因子（VWF）的结合[4]、凝血酶[5]、胶原、二磷酸腺苷、钙离子载体A23187[6]、血小板储存条件[7]、温度变化(低温或高热)[8,9]、病理性的剪切力[10]等。

同时，也多篇文献报导，血小板凋亡事件参与了机体疾病的病理生理过程，如：免疫性血小板减少征（ITP）[11，12]、巨大血小板综合征（BSS）[13]、尿毒症及血液透析[14]、疟原虫及幽门螺杆菌（HP）感染[15,16]等。

上述刺激主要通过内源性或外源性途径开启并完成了了血小板凋亡之路。

关于引起血小板凋亡的因素与凋亡指标，人们了解颇多，但对于血小板表面膜糖蛋白与血小板凋亡之间联系的认知相对较少，血小板膜表面含有丰富的膜糖蛋白，但哪些蛋白参与血小板的凋亡并通过怎样的信号通路激活血小板最终诱导血小板凋亡则需要更多的研究。

血小板膜糖蛋白（Platelet Membrane Glycoprotein），即血小板膜表面蛋白质通过连接大量碳水化合物支链而形成糖蛋白，这些糖蛋白不仅在维持血小板的形态及完整性中至关重要，同时也构成了血小板的各种受体，使之在血小板的粘附、聚集、止血和血栓形成中发挥重要作用。

血小板膜糖蛋白是血小板膜内、膜表面及血浆中特定的血小板糖蛋白（Glycoprotein，GP）成分，可分为质膜糖蛋白和颗粒膜糖蛋白，前者主要包括GPIb-IX-V、GPIIb/IIIa、GPIa/IIa 等，后者包括CD62P和CD63。

其中与血小板凋亡事件密切相关的膜糖蛋白有G PIbα、GPIIb/IIIa、PAR1受体、ADP受体、胶原受体等（如图1），总结以往血小板膜糖蛋白与血小板凋亡之间关联的实验研究如下：一、GPIbαGPIbα、GPIbβ、GPIX和GPV4种不同的亚基以2:2:2:1的比例组成GPIb-IX-V复合物，复合物中的这四种蛋白属于富含亮氨酸基序的家族。

每个血小板上约25000个GPIb-IX-V复合物，主要分布于血小板的表面，极少数位于开放管道系统（OCS）。

GPI bα（CD42b，分子质量140ku，位于17 号染色体上）与GPIbβ（CD42c，分子质量42ku，位于22 号染色体）以二硫键相连构成了GPIb，GPIb又与GPIX（位于第3 号染色体上）以1:1的比例组成复合物，GPV（位于第 3 号染色体上）以1:2的比例参与复合物的形成。