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第二章紫外可见分光光度法

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第二章 紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and Visible ....

第二章 紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and Visible ....

无机物分子能级跃迁
一些无机物也产生紫外 - 可见吸收光谱，其跃迁类型包 括 p-d 跃迁或称电荷转移跃迁以及 d-d, f-f 跃迁或称配场跃
迁。
1. 电荷转移跃迁 (Charge transfer transition) 一些同时具有电子予体(配位体)和受体(金属离子)的无机 分子，在吸收外来辐射时，电子从予体跃迁至受体所产生的 光谱。
1）共轭体系的存在----红移
如 CH2=CH2 的 -* 跃迁， max=165~200nm ；而 1,3- 丁二烯，
max=217nm
2）异构现象：使异构物光谱出现差异。
如 CH3CHO 含水化合物有两种可能的结构： CH3CHO-H2O 及
CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前 者；而在水溶液中，此峰消失，结构为后者。
-胡罗卜素
咖啡因
几种有机化合物的 分子吸收光谱图。
阿斯匹林
丙酮
二、分子吸收光谱跃迁类型
有机分子能级跃迁
1. 可能的跃迁类型 有机分子包括:
成键轨道 、 ；
反键轨道 *、* 非键轨道 n
例如 H2O分子的轨道：
oo C O o o
= = o=n
各轨道能级高低顺序： n**（分子轨道理论计算结果）； 可能的跃迁类型：-*；-*；-*；n-*；-*；n-*
苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm两个吸
收带；而在碱性溶液中，则分别红移到235nm和 287nm（p-
共轭）.
6）溶剂效应：红移或蓝移 由n-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，形成 H 键
的能力增加，发生蓝移；由-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂

2.紫外可见分光光度法

2.紫外可见分光光度法

一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光
度与溶液浓度和厚度的乘积成正比。
21
（2）表达形式 （Ⅰ）
A = lg
I0 I
= abc
式中， A： 吸光度 , 反映了溶液对光的吸收程度，为
无因次量 ；
b：液层厚度(吸收光程长度)，单位为 cm ；
c：溶液的浓度，单位 g · L-１ ；
a：吸光系数，单位
答对了！
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43
课堂练习

7.常用作光度计中获得单色光的组件是 （ ）
A.光栅(或棱镜)+反射镜 C.光栅(或棱镜)+稳压器 B.光栅(或棱镜)+狭缝
D.光栅(或棱镜)+准直镜
很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
答对了！
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44
课堂练习

8. 某药物的摩尔吸光系数（）很大，则表 明（ ）
答对了！
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39
课堂练习

3.常见紫外-可见发光光度计的波长范围为 （ ）
B. 400～760 nm
A. 200～400 nm C. 200～760 nm 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
D. 400～1000 nm
答对了！
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40
课堂练习

4. 在分光光度法中，运用朗伯－比尔定 律进行定量分析采用的入射光为（ ）
A.白光 C.可见光 B.单色光
D.紫外光
很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了 很遗憾，您答错了
答对了！
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41
课堂练习

5. 符合朗伯-比尔定律的有色溶液稀释 时，其最大吸收峰的波长位置 （ ）

紫外-可见分光光度法-N讲解

紫外-可见分光光度法-N讲解
2.红移与蓝(紫)移 化合物结构及溶剂改变等，使吸收峰向长波长方向移动的现象 化合物结构及溶剂改变等，使吸收峰向短波长方向移动的现象
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 甲苯E h
二、紫外-可见吸收光谱的产生 吸收紫外-可见光产生分子能级跃迁
1. 有机化合物中的电子轨道及其跃迁 s键： s、s*轨道 p键： p、p*轨道
孤对电子：n轨道
σ~σ*跃迁 > n~σ*跃迁 >
σ*
π~π*跃迁 > n~π*物
En
含p键的有机物 共轭体系
π
含非键电子的不饱和有机物 杂原子 σ
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法 E h
波长/nm 分区名称 波长/mm 分区名称
<0.005 g射线 0.8~2.5 近红外光
l=650nm =4.62×1014Hz E=3.06×10-19j=1.91eV
0.005~10 X射线 2.5~50
中红外光
10~200 真空紫外 50~1000 远红外光
200~400 近紫外光 1~300mm
微波
400~800 可见光 >300mm 无线电波
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱法
二、紫外-可见吸收光谱的产生 实现能量交换
1. 电磁波与电磁波的能量 c / l E h
2. 分子的能量
量子化
E 连续能 Ev Er Ee
E
n1
V3
V2
V1
n0
JJ12
第一节 基本原理
l、I0
l、I T I / I0 透光率
A lg T 吸光度

仪器分析2(紫外可见光分光光度)

仪器分析2(紫外可见光分光光度)

白光除了可由所有波长的可见光复 合得到外，还可由适当的两种颜色的 光按一定比例复合得到。能复合成白 光的两种颜色的光叫互补色光。
/nm 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
颜色 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
改变溶剂的极性，会引起吸收带形状
的变化。改变溶剂的极性，还会使吸收带
的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂
对一种丙酮紫外吸收光谱的影响。
正己烷 CHCl3 CH3OH H2O
* 230
238
237 243
n * 329
315
309 305
由于溶剂对电子光谱图影响很大， 因此，在吸收光谱图上或数据表中必 须注明所用的溶剂。与已知化合物紫 外光谱作对照时也应注明所用的溶剂 是否相同。在进行紫外光谱法分析时， 必须正确选择溶剂。
电子的跃迁吸收光的波长主要在
真空紫外到可见光区，对应形成的光 谱，称为电子光谱或紫外-可见吸收光 谱。
三．有机化合物的紫外—可见吸收 光谱
（一）、跃迁类型 主要有σ→σ*、n→σ*、n→π* 、 π→π*
n
E*
* n*
* n *
a.σ→σ* 跃迁主要发生在真空紫外区。 b. π→π* 跃迁吸收的波长较长，孤立
ε（480nm）=A/ cb
= -lg0.398/0.150×10-3 ×2.00 =1.33 ×103 ( L ·mol-1 ·cm-1)
由ε=aM , 得: a= ε/M
= ε /251=5.30(L ·g-1 ·cm-1)
三．实际溶液对吸收定律的偏离及原因： （一）偏离：被测物质浓度与吸光

第二章 紫外-可见分光光度法-答案

第二章 紫外-可见分光光度法-答案

第二章 紫外－可见分光光度法一、选择题1 物质的紫外 – 可见吸收光谱的产生是由于 ( B )A. 原子核内层电子的跃迁B. 原子核外层电子的跃迁C. 分子的振动D. 分子的转动2 紫外–可见吸收光谱主要决定于 ( C )A. 原子核外层电子能级间的跃迁B. 分子的振动、转动能级的跃迁C. 分子的电子结构D. 原子的电子结构3 分子运动包括有电子相对原子核的运动（E 电子）、核间相对位移的振动（E 振动）和转动（E 转动）这三种运动的能量大小顺序为 （ A ）A. E 电子>E 振动>E 转动B. E 电子>E 转动>E 振动C. E 转动>E 电子>E 振动D. E 振动>E 转动>E 电子4 符合朗伯-比尔定律的一有色溶液，当有色物质的浓度增加时，最大吸收波长和吸光度分别是 ( C )A. 增加、不变B. 减少、不变C. 不变、增加D. 不变、减少5 吸光度与透射比的关系是 ( B ) A. T A 1= B. TA 1lg = C. A = lg T D. A T 1lg = 6 一有色溶液符合比尔定律，当浓度为c 时，透射比为T 0，若浓度增大一倍时，透光率的对数为 ( D )A. 2T OB. 021TC.0lg 21T D. 2lg T 0 7 相同质量的Fe 3+和Cd 2+ 各用一种显色剂在相同体积溶液中显色，用分光光度法测定，前者用2cm 比色皿，后者用1cm 比色皿，测得的吸光度值相同，则两者配合物的摩尔吸光系数为 ( C )已知：A r(Fe) = ，A r(Cd) =A. Cd Fe 2εε≈B. e d F C 2εε≈C. e d F C 4εε≈D. Cd Fe 4εε≈8 用实验方法测定某金属配合物的摩尔吸收系数ε，测定值的大小决定于 ( C )A. 入射光强度B. 比色皿厚度C. 配合物的稳定性D. 配合物的浓度9 以下说法正确的是 ( A )A. 吸光度A 随浓度增大而增大B. 摩尔吸光系数ε随浓度增大而增大C. 透光率T 随浓度增大而增大D. 透光率T 随比色皿加厚而增大10 下列表述中的错误是 ( A )A. 比色法又称分光光度法B. 透射光与吸收光互为补色光，黄色和蓝色互为补色光C. 公式bc II A ε==0lg 中，ε称为摩尔吸光系数，其数值愈大，反应愈灵敏 D. 吸收峰随浓度增加而增大，但最大吸收波长不变11 吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是 ( C )A. 0.1～B. ～1.2C. ～D. ～12 若显色剂无色，而被测溶液中存在其它有色离子干扰，在分光光度法分析中，应采用的参比溶液是 ( D )A. 蒸馏水B. 显色剂C. 试剂空白溶液D. 不加显色剂的被测溶液13 采用差示吸光光度法测定高含量组分时，选用的参比溶液的浓度c s 与待测溶液浓度c x 的关系是 ( D )A. c s =0B. c s = c xC. c s > c xD. c s 稍低于c x14 桑德尔灵敏度S 与摩尔吸光系数ε的关系是 ( A ) A. εMS = B. 610⨯=εM S C. ε610⨯=M S D. M S ε=15下列因素对朗伯-比尔定律不产生偏差的是 ( A )A. 改变吸收光程长度B. 溶质的离解作用C. 溶液的折射指数增加D. 杂散光进入检测器二、填空题1吸光光度法进行定量分析的依据是__朗伯-比耳定律，用公式表示为___A= εbc，式中各项符号各表示：A为吸光度，b为吸收介质厚度，ε为摩尔吸光系数，c为吸光物质的浓度。

紫外可见分光光度法UltravioletVisible

紫外可见分光光度法UltravioletVisible
A1 = 1bc1 A2 = 2bc2 A = 1bc1+ 2bc2
当物质中只有一种吸光组分，则上式简化 为：

A=bc
（3）定义2：若将I/I0称为透光度（亦称：透 射率），用T表示， T=I/I0 则 A= lgI0/I= - lgT= bc
2. 朗伯-比尔定律成立的条件及其偏离该定律 的因素 （1）成立的条件 (a) 适用于极稀的溶液(一般c<0.01molL-1)。 (b) 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的 相互作用机制只是光被该成分吸收。 (c) 采用“单色光”。 (d) 吸收成分（分子或离子）的行为相互无 关，且不论其数量和种类如何。
iii) 分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混 合，就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶， 它的吸收峰在可见光区。
特点：电荷转移吸收光谱的最大特点 是：吸收强度大，摩尔吸收系数一般超过 104L/ (mol cm)。
（3）两种吸收谱带的区别 这类光谱一般位于可见光区。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度 大，最大波长处的摩尔吸收系数max可大于 104 L cm-1mol-1。 与电荷迁移跃迁比较，配位场跃迁吸收 谱带的摩尔吸收系数小，一般max< 102L cm-1mol-1。
吸收峰红移，n→*跃迁所产生的吸收峰蓝移。
（3）除上述六种跃迁可产生紫外-可见吸收 谱带外，还有两种跃迁也可产生紫外-可见吸 收谱带，即电荷转移跃迁和配位场跃迁。
综上所述：发生在电磁光谱的紫外和可 见光区内的，由于电子的跃迁或转移而引起 的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型。
3. 在有机物的紫外-可见谱解析中吸收带的分类 在有机物的紫外-可见谱解析中，通常将吸 收带分为以下四种类型。
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能

紫外可见分光光度法2

紫外可见分光光度法2
度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。
光栅可根据光的衍射和干涉原理将复合光 色散为不同波长的单色光，然后再让所需 波长的光通过狭缝照射到吸收池上。其分 辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。
3．吸收池
吸收池也称比色皿，用于盛放参比溶液或待测溶 液。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度 相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5 cm，1 cm，2 cm，3 cm和5 cm。在可见光区测量吸光度时使用玻璃 吸收池，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应 注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。经常使用的 吸收池应于清洗后浸泡在蒸馏水中保存。
E分子 = E电子 + E振动 + E转动
振动能级
当一束光照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、
原子或离子等粒子与吸光子作用，光子的能量发生转移，
使原子核外层电子由低能量轨道跃迁到高能量轨道，即由 基态转变为激发态。
M(基态) + h
M*(激发态)
这个过程即是物质对光的吸收。当用频率为的电磁波
溶液的颜色 ⑴溶液为什么会有颜色？
由于溶液中的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。
⑵ 吸收光与溶液颜色的关系：
当白光通过某一均匀溶液时： ①如溶液对其全不吸收，光全透过，溶液为无色；
②如溶液对其全部吸收，无光透过，溶液呈黑色； ③如溶液对其部分吸收，其余光透过，溶液呈透过光的颜色。
CuSO4溶液：之所以呈蓝色，是因为吸收了白光中的黄光，透过 其黄光的互补光蓝光。
（4） 210-250 nm有强吸收峰，表明可能含有2个共轭双键 ；在260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，说明是3个或3个以 上双键的共轭体系。
（5)若吸收峰延伸至可见光区，则可能是长链共轭或稠环 化合物

仪器分析-紫外可见光光谱分析

仪器分析-紫外可见光光谱分析
1,3,5-己三烯
正己烷
258
n=4
1,3,5,7-辛四烯
环己烷
304
不共轭双键不发生红移。
C=O双键同C=C双键的共轭作用使n→*和→*跃迁的吸收峰都发生红移。
3）溶剂效应
01
02
03
04
05
极性溶剂使π-π*跃迁发生红移。
pH值
Note: 测UV-Vis应注明溶剂
pH增大，苯酚π-π*吸收带发生红移。
1
2
特点：灵敏度高，实际工作中常用。
1
常将M与某L（显色剂）生成具有电荷迁移的配合物，然后进行含量测定。
2
－* 跃迁 配体具有双键的金属络合物
3
2.3光的吸收定律
郎伯-比尔（Lambert-Beer ）定律 入射光强度 吸光强度 反光强度 透光强度 ＋ IS 散射光强度 均匀溶液，散射光小，可忽略
由于n—π共轭参与，使分子整体共轭效应增强。
取代基 苯环或烯烃（吸电子基）上的H被各种取代基取代，多发生红移。 空间异构
蓝移（紫移）：使化合物的吸收波长向短波方向移动效应。 影响蓝移因素： 1）溶剂效应 极性溶剂使n-π*跃迁发生蓝移 2）pH值 pH值减小，苯胺的π-π*吸收带蓝移n—π共轭参与少，使分子整体π共轭效应减少。
分子转动－转动能级(rotation)
分子整体能级 E=Ee+Ev+Er
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分子从基态能级跃迁到激发态能级
当有一频率v , 如果辐射能量hv恰好等于该分子较高能级与较低能级的能量差时，即有：
激发态
基态
ΔE电=1-20eV ΔE振=0.05-1eV ΔE转 在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要在区紫外—可见区。

第二章 紫外-可见分光光度法

第二章 紫外-可见分光光度法

分子吸收电磁辐射而发生电子能级间的跃 迁和振动能级间的跃迁时，总伴有转动能 级间的跃迁。由于转动能级间隔太小，一 般光谱仪的分辨能力不足以把这些谱线分 开，诸谱线便连成一片，表现为带状。所 以，分子吸收光谱时一种带状光谱。
Instrumental Analysis
16
Huaihua University Chemistry and chemical egineering Department
在分子中，除了原子的核能En，质心在空 间的平动能Et外，还有电子运动能Ee，原子 之间的相对振动能Ev以及分子转动能Er等。 分子的总能量可写为： E=En + Ee+ Ev+ Er+ Et 由于En在一般化学实验条件下不发生变化， 分子的平动能Et又比较小，因此当分子能 级发生跃迁时，能量的改变为： DE=DEe + DEr +DEv
紫外-可见分光光度法优点： 较高的灵敏度； 较好的准确度； 选择性好； 操作简便、快速； 仪器设备简单、价格低廉。
Instrumental Analysis
3
Huaihua University Chemistry and chemical egineering Department

10-2 nm 10 nm
1.远紫外（真空紫外）吸收带
烷烃化合物的吸收带，如C-C、C-H基团中，为s→s*跃迁，λmax < 170nm，范围在10-
200nm。
2.末端吸收带
饱和卤代烃、胺或杂原子的单键化合物的吸收带，为n→s*跃迁，其范围从远紫外区末端
到近紫外区，在200nm附近。
3.R带
共轭分子的含杂原子基团的吸收带，如C=O，N=O，NO2，N=N等。为n→p*跃迁，弱吸 收带， emax<100 ，随溶剂极性增加，R带会发生蓝移，附近如有强吸收带，R带有时会红 移。

紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法

机理：在这一吸收过程中，实际上是发生 了一种电子从体系旳一部分（称为：电子予 以体）转移到体系旳另一部分（称为：电子 接受体）旳过程，因而这么取得旳吸收光谱 称为电荷转移吸收光谱。
类型：
i) 配位体金属旳电荷转移
例：[Fe(SCN)6]3-呈深红色，在490 nm 附近有强吸收，这就是因为该络合物吸收 了某波长旳光，使一种电子从SCN-旳某一 轨道跃迁到Fe3+旳某一轨道上。
2.3 分光光度法旳对比度 1. 对比度旳概念
在光度法中，对比度是指显色剂与金属 离子所形成络合物（MeR）旳最大吸收峰波 长(MeRmax)与显色剂本身(HnR)最大吸收峰波 长(HnRmax)之间旳差值。
对比度以来表达： =MeRmax- HnRmax
一般以为： 40 nm时，显色反应对比度较小；
第二章 紫外-可见分光光度法 (Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)
又称: 紫外-可见分子吸收光谱法 （Ultraviolet-Visible Molecular Absorption
Spectrometry）
2.1 紫外－可见分光光度法发展简史 1729年，Bouguer首先发觉溶液对光旳
ii) 金属配位体旳电荷转移 产生这种电荷转移旳必要条件是：
金属离子轻易被氧化（处于低氧化态）； 而配位体轻易被还原，配位体具有空旳反 键轨道，可接受从金属离子转移出来旳电 子。
iii)分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混
合，就能够得到漂亮旳醌氢醌暗绿色结晶， 它旳吸收峰在可见光区。
❖ 概念：配位体场吸收谱带指旳是过渡金属 水合离子或过渡金属离子与显色剂（一般是 有机化合物）所形成旳络合物在外来辐射作 用下，因为吸收了合适波长旳可见光（有时 是紫外光），从而取得旳相应吸收光谱。

第二章 紫外-可见分光光度法-2

第二章 紫外-可见分光光度法-2

（3）温度的影响 在分光光度法测定中，通常都选用室温 显色反应。当温度对显色反应速度可能有较 大的影响时，需要考虑温度的影响。 合适的温度可用单因素实验来确定。
（4）显色时间 这里包括两种时间：一种是由于显色反 应速度不同，达到反应完全所需的时间；另 一种是有色化合物维持稳定的时间。 这两种时间均可用单因素实验来考察。
c. 快速扫描分光光度计陆续问世 利用光分析可以跟踪化学反应历程，一 般分光光度计只适于历程为20~30 min以上的 反应，要研究速度较快的反应，就需要设计 出快速扫描分光光度计，如：多道分光光度 计（采用：多道光子检测器，整个光谱扫描 时间不到1 s）。
4. 仪器的最新进展 (1) 仪器的自动化程度大大提高；
精确求取摩尔吸收系数的方法是：在 不同带通宽度时测定表观摩尔吸收系数， 绘制表观摩尔吸收系数对带通宽度的曲线 关系图，将曲线外推到带通宽度为零处， 这时相应的摩尔吸收系构造、类型及 发展趋势 1. 构造 通常由以下5个部分组成— （1） 一个或多个辐射源； （2）波长选择器； （3）试样容器 (吸收池) ； （4）辐射换能器； （5）信号处理器和读出装置。
对吸收池的要求：主要是能透过所研究的 光谱区辐射线。

吸收池的两个光学面必须平整光洁，使用 时不能用手触摸。

按材料可分为：玻璃吸收池和石英吸收池 两种。

吸收池有多种尺寸和不同结构，吸收池 的光径可在0.1 cm~10 cm之间变化，其中以 1 cm光径吸收池最为常用，根据使用要求 选用。 在用于高浓度或低浓度测定时，可相 应地采用光径较小或较大的吸收池。
(3) 蓝移 由于取代基或溶剂极性的影响，使吸收 谱带的最大吸收波长向短波方向移动的现象 称为短移、紫移或蓝移。

紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法

波长和颜色的关系
λ（nm） 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
互补光 黄绿 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
二、物质对光的选择性吸收
1、物质对光的吸收的本质
定性分析： 1、与标准品或标准图谱对比，鉴定未知物； 2、鉴别异构体 如：顺反异构、互变异构（如酮-烯醇式） 3、纯度检查
定量分析： 1、单一组分测定 2、多组分同时测定
第二节 紫外可见分光光度计
一、紫外可见分光光度计的构造
光源
单色器 吸收池
检测 系统
信号显 示系统
（一）光源
1、作用：提供符合要求的入射光。
3、分类： （1）可见光光源：
①钨丝灯：是最常见的可见光光源，它可发射波长 为325-2500nm范围的连续光谱，其中最适宜的使 用范围是320-1000nm，除用作可见光源外，还可 用作近红外光源。
②卤钨灯
在钨丝中加入适量的卤化物或卤素，灯泡用石 英制成，具有较长的寿命和高的发光效率。
（2） 紫外光光源： 多为气体放电光源，其中应用最多的是氢灯和
➢ 以光的衍射现象和干涉现象为基础（平面反射光栅和平面 凹面光栅）Βιβλιοθήκη （三）吸收池（又称比色皿）
1、作用：盛装被测溶液和参比溶液。 2、分类： （1）玻璃比色皿：适用于可见光区。（能否用于紫 外光区？） （2）石英比色皿：适用于紫外及可见光区。
3、主要规格： 0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm等。
紫外可见分光光度计基本组成
钨灯卤素 灯或氘灯
棱镜或光 栅，玻璃 或石英

第二章 紫外-可见分光光度法在食品检测中的应用

第二章 紫外-可见分光光度法在食品检测中的应用
减少误差； 可进行波长扫描，绘制 吸收曲线。
a）接通电源、打开开关，打开 样品室，预热10min b）打开软件
c）选择测试模式，设置波长
d）空白液调零
TU-1901紫外可见分光光度计
e）测试样品
3). 双波长分光光度计： 通过切光器使两束不同波长的光交替通过 吸收池，测得吸光度差ΔA。
a）可测多组份试样、混浊试样； b）不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空 白溶液等产生的误差)； c）通过波长的选择方便地校正背景吸收，消除吸 收光谱重叠的干扰； d）克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。
例
1.00×10-3mol· L-1 的K2Cr2O7 溶液及 1.00×10-4 mol· L-1 的KMnO4 溶液在 450nm 波长处的吸光度分别为0.200 及0， 而在530nm 波长处的吸光度分别为0.050 及0.420。今测得两者混合溶液在450nm 和530nm 波长处的吸光度为0.380 和0.710。 试计算该混合溶液中K2Cr2O7和KMnO4 浓 度。（吸收池厚度为10.0mm)。
试剂和溶液
乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 0.4mol/L碳酸钠溶液 0.4mol/L的三氯醋酸液 10.00mg/ml酪素溶液 100μ g/ml酪氨酸标准溶液 福林-酚试剂
摩尔吸收系数ε ： 1mol/L浓度的溶液，液层厚度为1cm时的吸 收度。 强吸收：ε ＞104； 中等强度吸收：102 ＜ ε ＜ 104； 弱吸收： ε ＜102； 摩尔吸收系数不能直接测得？
(8)吸光度加和性：
在多组分共存的溶液体系中，体系的总吸 收度等于各组分吸收度之和，在任意波长 下，共存的多组分中各组分遵守朗伯-比尔 定律。这是多组分定量的基础。 A总=A1+A2+……+Ai

紫外—可见分光光度法

紫外—可见分光光度法
10
（三）溶剂对吸收光谱的影响
1.对最大吸收波长的影响 溶剂极性增大， *红移， n*蓝移。
产生*跃迁的基团， 激发态的极性比基态强， 溶剂化作用使激发态能 量降低，吸收峰红移。
产生n*跃迁的基团， 基态时n电子会与极性 溶剂形成氢键，n轨道 能量降低，吸收峰蓝移。
11
溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。
3、*跃迁 吸收峰一般接近或大于200 nm，其特征是摩尔吸光 系数大，一般max104，为强吸收带。如乙烯（蒸气） 的最大吸收波长max为162 nm(孤立）。丁二烯为 217nm（离域）。
5
4、n*跃迁 虽然所需跃迁能量最小，但n轨道和*
轨道重叠少，跃迁机率很小。其特点是谱带强度弱， 摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁。
共轭体系 最大吸收波长红移，但摩尔吸收系数
显著变化。 1,3-丁二烯 217nm, 20 900 Lmol-1cm-1
*
碳氧双键与烯键
220nm, 15 000 Lmol-1cm-1
的共轭
CH3CH=HCHO 322nm, 28 Lmol-1cm-1
170nm
280nm
n*
8
助色团是指带有非键电子对的基团，如184OnHm、 5-O0R0、00 -LNmHRo、l-1-cSmH-、1 -Cl、 -Br、-I等，它们本身不能吸收大 204于nm200n7m40的0光L，m但ol-是1c当m它-1 们与生 色团相连时，会使生色团的吸收 254峰nm向长2波00方L向m移ol动-1，cm并-1且增加其 吸收强度。
1
2
§2 紫外—可见吸收光谱
一、有机化合的紫外-可见吸收光谱 （一）电子跃迁类型
3
4

第二章_紫外-可见分光光度法(2)教材

第二章_紫外-可见分光光度法(2)教材

5.光导纤维探头式分光光度计
镀铝反射镜
§4. 分析条件的选择
一、仪器测量条件的选择
1. 的选择
A
选择原则：最大吸收原则
A
A'
A' A
max
选max

2.狭缝的选择
狭缝↑→光单色性↓→灵敏度↓
原则：以减小狭缝宽度时，试样的吸光度不再增加为准
狭缝宽度 1 半峰宽 10
A：0.15~1.00 T: 10%~70%
调节l
改变c
二、反应条件的选择
〈一〉显色反应
1.定义
使待测物ε增大的反应（包括络合反应和氧化还原反应等等）
M + nR
MRn
显色剂
P34 （表3.3）
2.对显色反应的要求
（1）生成物的要大 （2）R的选择性要好 （3）生成物组成恒定 （4）生成物稳定性好 （5）显色条件易于控制

k
2
(
A
A 2

A
B 2
)

k
1
(
A
A 1

A
B 1
)
由于
k
2
A
B 2

k
1A
B 1
A

k
2
A
A 2

k
1
A
A 1

k 2A2lCA
k1A1lCA

(k
2
A 2

k
1
A 1
)lCA
<四>示差分光光度法
示差分光光度法
高吸光度示差法 低吸光度示差法 （高含量组分） （低含量组分）

第二章 紫外-可见分光光度法

第二章 紫外-可见分光光度法

1、光源
作用：供给符合要求的入射光。 （1）可见光光源 常见的可见光光源有：钨丝灯和卤钨灯。 （2）紫外光光源 常见的紫外光光源有：氢灯和氘灯。 •另外，为了使光源发出的光在测量时稳定，光 源的供电一般都要用稳压电源，即加有一个稳 压器。
2、单色器
作用：把光源发出的连续光谱分解成单色光，并 能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光， 它是分光光度计的心脏部分。 组成：单色器一般由狭缝、色散元件（棱镜和光 栅）、透镜系统组成。 （1）棱镜单色器 •玻璃棱镜：可吸收紫外光，只能用于可见光区域。 •石英棱镜：用于紫外、可见和近红外三个光区域。 （2）光栅单色器 •可用于紫外、可见及红外光区域，目前生产的紫外可见分光光度计大多采用光栅作为色散元件。
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
四、分光光度计的维护 1、仪器对工作环境的要求
•稳固、温度15～28℃、干燥、无腐蚀性气体、 光线不宜过强
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
2、紫外-可见分光光度计——双光束
•/vlabcq/flash/分光光度计/分光光度 计.html
二、紫外-可见分光光度计的类型及特点 1、按使用的波长范围分
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。

第二章-紫外可见分光光度法-2

第二章-紫外可见分光光度法-2

检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理
(1) 光
源
[对光源的要求] ① 发射强度足够而且稳定 ② 具有连续光谱且发光面积小
可见光区： 钨灯或卤钨灯 紫外区: 氢灯或氘灯
波长320-3200nm 波长150-400nm
back
5、目前紫外－可见光分光光度计
• •
UV8500双光束紫外－可见光分光光度计 生产厂家：上海天美科学仪器有限公司
[影响因素] 物质的本性；单色光的波长；温度；溶剂
注：若单色光的波长、温度、溶剂一定，即不同的物质对同一 波长的单色光，可有不同的吸光系数．
[表示方式]
吸光系数的表示方式 ①摩尔吸光系数：ε或EM标记
一定波长时，溶液的浓度为1mol/l，厚度为1cm的吸光度．
②百分吸光系数或比吸光系数： E1cm1%
⑷ 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，
则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显
色剂，作为参比溶液。
3.控制适宜的吸光度（读数范围）
设ΔT =1%，则可绘出溶液浓度相
对误差Δc/c与其透光度T 的关系曲 线（如图），当ΔT =1%，T 在20% ～65%之间时，浓度相对误差较小 ，最佳读数范围。
吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=
1～2nm。
(2)单色器与色散元件
单色器是将光源发射的复合光分解成单色光并可从中 选出一任波长单色光的光学系统。
[组成]:进口狭缝 准直镜 色散元件 出口狭缝 [色散元件]：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； [准直镜]：聚光镜 [狭缝]：宽度为0～2mm,or 3mm，可调节 Back
其他光学因素： • [杂散光]从分光器得到的单色光中还有一些不在谱带范 围内与所需波长相隔较远的光称为杂散光。 • [散射光和反射光]要求真溶液，以减少散射光和反射 光。悬浊液，颗粒大的易产生散射光和反射光 • [非平行光]对于吸收池的光要求是平行光,若是非平行 光则造成较大的偏差.其原因是非平行光增大了吸收池 的厚度L. • back

紫外可见分光光度法-第2章

紫外可见分光光度法-第2章
21
基本原理：
荧光是由药物或代谢物等物质在吸收光能之后发射而出， 因此溶液的荧光强度和该溶液吸收光能的程度以及溶液中 荧光物质的荧光量子效率有关。溶液吸收光能，即被入射 光激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度。由于激 发光的一部分被溶液吸收，一部分被透过。因此，在透射 光的方向观测荧光是不适宜的，一般是在与激发光源垂直 的方向观测荧光的强度。
3.要考虑成型工艺，合理计 算累积公差，以防按键手感 不良。
荧光分光光度法
16
原理：
药物及代谢物在光照射下吸收紫外光或可见光的能量， 使外层电子由基态跃迁到较高能级的激发态。当处于激发 态的电子又回到基态时，可将这部分能量以光子形式发射 出而产生荧光。产生的荧光其能量比吸收光的能量小一 些．因此荧光的波长比照射光的波长要较长一些。
11
根据光的吸收定律： A＝εCL，一阶导数dA／dλ＝dε／ dλ·C·L 二阶导数d2A／dλ2＝d2ε／dλ2·c·L，依次类推，在 任意波长处，导数光谱上的导数值与浓度成正比，这就是 导数光谱定量的理论依据据。20世纪60年代后期，有了双 波长分光光度计，20世纪70年代中期，微处理机被装配到 了分光光度计上，人们利用它的记忆及数据处理功能，可 以直接描绘出一阶、二阶、三阶、四阶等导数光谱，这样 就使得导数光谱的应用得到较快的发展。由于导数光谱灵 敏度高、分辨能力好，能消除杂质干扰，提高被测物光谱 的纯度，作为一种紫外分光光度法的定量方法，受到人们 越来越多的重视。
一般情况下二次萃取的回收率较一次萃取低但样本净化好并可以通过调节测定液的ph值改变被测物的吸收光谱使之避开干扰所以二次萃取的方法在hplc上及gc法中相对运用较少而在紫外可见分光光度法中相对应用较在应用紫外可见分光光度法测定体内药物分析时究竟采用一次提取还是二次提取应根据被测药物浓度所用有机溶剂提取能力的强弱分析方法的专属性等全面考虑
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500106 6 c 8.9510 （mol L1 ) 55.85
则根据朗伯—比尔定律 ，A
εbc
A 0.197 4 -1 1 1.1 10 L.mol . cm bc 2.0cm 8.95 10 6
例2-2 精密称取维生素B12样品25mg,用水配成100ml。精密 吸取10.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，取此溶液 在1cm的比色皿中，于 361nm处测定吸光度为 0.507,求 B12的 质量分数？已知a(Fe)=207 L · g –1 · cm -1 。 解 根据朗伯—比尔定律 :

T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 全部透射 T = 0.0 % T = 100.0 %
2、 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律
A Kbc
K--吸光系数 b--吸光液层的厚度(光程)， cm c--吸光物质的浓度， g / L, mol / L
当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时， 其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成 正比.
S= 0.001 103 M

=
M

( g/cm 2 )
例7邻二氮菲光度法测铁 :(Fe)=1.0mg/L,
b=2cm , A=0.38 ,计算 ，a 和
E
1% 1cm
解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3 g/L /55.85g/mol

=1.8×10-5mol/L 0.38 4 -1 -1 = = 1.1 10 （ L mol cm ） 2 1.8 10-5
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
0.1mm～1m
103 cm
无 线 电 波
105 cm
10nm~
750nm~0.1cm
1m～1000m
可
远紫外
（真空紫外）
见
400～750 nm
光
近紫外
10nm~200nm 200~400nm
2、微粒性
光是由光子流组成，光子的能量：
二、光与物质的作用
1.吸收光与透射光 当复合光照射到物体上时，一部分光被 吸收，而另一部分光则被透射过去。即： 入射光=吸收光＋透射光
互补 吸收光 透射光
光的作用方式
光谱示意
复合光
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
物质的颜色与光的关系
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm 颜色 紫 蓝 互补光 黄绿 黄 400-450 黄 橙 红 450-480
25.0 106 g 4 1 5 . 00 10 （ g L ) 3 50.0 10 L
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
A 0.300 -2 -1 1 a 3.00 10 L.g . cm b 2.0cm 5.00104 g L1
而ε= Ma = 64.0g· mol-1×3.00×10-2 L· g-1· cm-1 =1.92 (L· mol-1· cm-1)
在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表
示 εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力。
吸光度的加合性
在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作用这时体系总 的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。
A＝ Ai
吸光度的测量：
用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液 的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射， 溶剂、试剂对光的吸收等。
朗伯-比尔定律的适用条件
单色光
应选用max处或肩峰处测定.
吸光质点形式不变
离解、络合、缔合会破坏线性关系,
应控制条件(酸度、浓度、介质等).
稀溶液
浓度增大，分子之间作用增强.
例2-1 已知含Fe3+浓度为500μg/L溶液，用KSCN显色，于波 长480nm处，用2.0cm比色皿测得A=0179，求摩尔吸光系数ε 。已知M(Fe)=55.85。 解
• 1、紫外-可见吸收光谱定性分析的依据：光 吸收程度最大处的波长叫做最大吸收波长， 用λmax表示，同一种吸光物质，浓度不同 时，吸收曲线的形状不同，λmax不变，只 是相应的吸光度大小不同，这是定性分析 的依据。
2、吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比--定 量分析基础
同一种物质不同浓度下，其吸收曲线形状相似λmax不变。 在λmax处吸光度A随浓度变化的幅度最大。所以测定最灵 敏。此特性可作为定量分析时选择入射光波长的重要依据。
a=M/ =55.85/1.1×104=0.0051 (g/cm2)
A= E
1% 1cm
b c
c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL = 1.0×10-4 g/100mL
1% -4 3 -1 1 E1 = 0.38/2.0 10 = 1.9 10 （ 100mL g cm ） cm
显示器
0.00
吸光度与光程的关系 A = Kbc 朗 光源 伯 检测器 定 参 律 比
b
0.20
0.10
(1760)
2b
显示器
0.00
吸光度与浓度的关系 A = Kbc 比 光源 检测器 尔 参 定 比 律
(1852)
c
0.20
0.10
2c
A = kb c
吸光系数(K) 物质的性质 入射光波长 温度
c －真空中光速 ：~3.0 ×108m/s
－波长：1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1Å=10-10m －频率，单位：赫兹 Hz 次/秒
n －折射率，真空中为1：
= c ； 波数σ = 1/ = /c
光谱区间

10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
0.1nm～
1.0
T
100
A
T = 0.0 %
A
T%
A=∞
T = 100.0 %
0.5
50
A = 0.0
0
c
0
溶液的T越大,说明对光的吸收越小,浓度低; T越小，溶液对光的吸收越大，浓度高
.透光率 (透射比,Transmittance )
入射光强度 I0 透射光强度It
一束平行单色光
透光率定义:
It T I0
例2-4
解
根据朗伯—比尔定律 :
A abρ
A 0.19 2 –1 · -1 L · g cm a 1 . 9 10 b 2 5.00104
mol –1 · cm -1 Ma 55.8 1.9 102 1.1104 L ·
例5 浓度为25.0μg/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草酰二腙 分 光光度法 测定 ， 于 波长 600nm 处 ，用 2.0cm 比色皿测得 T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数ε。已知M(Cu)=64.0 。 解 已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，b=2.0cm,
例2-3 略
解：根据朗伯—比尔定律 ，
A εbc
Ax c x b cx 1.5 3 A cb 1.00 10
1 得：cx 1.50103 molL
钢样品中Mn的质量m cxVM 1.5 103 0.25 54.95 0.0206g
钢样品中 Mn 的质量分数 Mn 0.0206 100 % 2.06% 1.00
M（基态）+hv------M*（激发态） 这就是对光的吸收作用。
2.吸收光谱曲线
S2 h
(Absorption Spectra)
A
S1
S0 分子内电子跃迁
带状光谱

用不同波长的单色光照射，测吸光度— 吸收曲线
紫外可见吸收光谱：分子价电子能级跃迁。电子跃迁的 同时，伴随着振动能级、转动能级的跃迁。带状光谱。
得白光，这两种光就叫互为补色光。物质呈现的颜色和 吸收的光颜色之间是互补关系。
M + h

M*
M + 热
M + 荧光或磷光
基态 激发态 E1 （△E） E2 物质对光的吸收满足Plank 条件
E E j E0 h
hc

物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同， 这就构成了物质对光的选择吸收基础。
与浓度无关,取值与浓度的单位相关
c：mol / L
K κ K a
摩尔吸光系数，L · mol –1 · cm -1
Α=κbc
c： g / L
质量吸光系数， L · g –1 · cm -1
Α=αbc
κ=αM
摩尔吸光系数ε的讨论
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数
（2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。 在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身 的性质有关，与待测物浓度无关； （3）同一吸光物质在不同波长下的ε值是不同的。
第二章
紫外可见分光光度法 UV-VIS
紫外可见分光光度法是：利用物质对 紫外可见光的吸收特征和吸收强度，对物质 进行定性和定量分析的一种仪器分析方法
第一节基本原理
一、 光的基本性质
光 的 波 粒 二 象 性
波动性

光的折射 光的衍射 光的偏振
光的干涉
粒子性
E
光电效应
1、波动性
光的传播速度:
c V = = n
4、 偏离朗伯—比耳定律的原因
标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线
常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对
朗伯—比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。