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体外诊断试剂分析性能评估资料
首先，标准化管理是体外诊断试剂分析性能评估的重要环节。
试剂的
制造过程应符合国家规定的生产质量管理标准，包括试剂的生产、储存和
运输等环节。
同时，制定并执行合适的标准操作程序（SOP）以确保试剂
的质量可控。
其次，可靠性评估是体外诊断试剂分析性能评估的关键要素之一、通
过对试剂进行临床样本的测试，可以评估试剂的可靠性和稳定性。
试剂应
具有良好的稳定性，能够在一定的适用期内保持准确性和可靠性。
准确性评估也是体外诊断试剂分析性能评估的重要内容之一、试剂的
准确性是指试剂所测定的结果与真实值之间的差异程度。
可以通过与参考
方法的比对来评估试剂的准确性。
准确性评估需要考虑试剂与不同样本类
型和浓度的适应性。
重复性评估是评估体外诊断试剂分析性能的另一个关键要素。
试剂的
重复性是指在相同条件下，试剂对相同样本的重复测定结果之间的差异程度。
重复性评估通常通过反复测试同一样本的重复测定来进行。
最后，精确度评估是评估体外诊断试剂分析性能的重要标准。
试剂的
精确度是指试剂所测定的结果与真实值之间的关系。
可以通过与参考方法
对比或者使用模拟样本进行评估。
综上所述，体外诊断试剂分析性能评估包括标准化管理、可靠性评估、准确性评估、重复性评估和精确度评估等方面。
只有通过全面评估试剂的
性能，才能确保其准确性和可靠性，为疾病的诊断提供准确的结果。
因此，在日常使用前和使用过程中，应对体外诊断试剂进行充分的分析性能评估，以确保其质量和安全性。
体外诊断试剂分析性能评估资料
充分反映该试剂的性能特征
摘要：本文旨在评估体外诊断试剂的分析性能，针对固定性、灵敏度、特异性等性能进行详细的分析，对试剂的性能特征进行系统的探讨，为了
评估试剂的性能特征，本文分析了该试剂的变异系数、溶液特性、固定性、灵敏度、特异性以及其他相关性能特征。
通过对上述性能参数的测试，本
文评估了体外诊断试剂的分析性能，并针对测试结果提出了适宜的建议和
改进意见。
1引言
体外诊断试剂（IVD）是生命科学领域的一项重要发展。
它主要应用
于临床检测与诊断，用于检测疾病的抗原和标志物，并对其结果进行分析，以确定疾病发展的趋势，从而提供医疗服务和支持医疗决策。
近年来，随
着基因技术、检测技术和生物技术的迅速发展，IVD试剂的性能也在不断
改善，IVD试剂在检测和诊断中发挥着越来越重要的作用。
有效的IVD试
剂分析性能不仅有利于检测和诊断的高效性，而且有助于改善患者的治疗
水平，为患者提供更好的服务。
附件5：体外诊断试剂分析性能评估（准确度-方法学比对）技术审查指导原则一、前言准确度评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。
定量检测方法的方法学比对试验是评估准确度的方法之一，可以与参考方法或临床公认质量较好的已上市产品进行比对。
本指导原则基于国家食品药品监督管理局《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》的有关要求，参考CLSI有关标准，对采用方法学比对进行准确度评估的实验方法和数据处理方法进行了原则性要求。
其目的是为生产企业采用方法学比对进行准确度评估并准备准确度评估资料提供原则性指导，也为注册管理部门审核该部分分析性能评估资料提供技术参考。
由于体外诊断试剂产品发展速度快、专业跨度大，国家食品药品监督管理局将根据体外诊断试剂发展的需要，适时对本指导原则进行修订。
二、适用范围本指导原则适用于首次申请注册、申请许可事项变更的用于定量检测的体外诊断产品。
因体外诊断产品评价是将仪器、试剂、质控品、校准品等作为一个系统进行评价，因此方法学比对的评价采用系统的概念进行描述。
如特殊产品不适用于本指导原则，可进行详细说明并采用适当的方法进行准确度评价。
三、基本要求（一）方法学比对实验的基本要求1.操作者应熟悉待评价系统和比对系统的操作。
2.编写系统标准操作规程，其中包括校准程序和室内质控程序，采用合适的校准品、质控品并保持仪器处于正常状态。
3.比对系统的选择比对系统应具有以下条件：（1）具有比待评价系统更好的精密度；（2）同待评价系统检测结果具有相同的单位；（3）如有参考方法应具有与参考方法已知的偏差。
比对系统应该选择正确性经过验证的系统，根据实际条件，选择的顺序如下：参考方法、原装系统、配套系统、经过验证的非配套系统。
4.待评价系统的处理进行方法学对比实验前，应该对待评价系统进行初步评价，并且对待评价系统进行精密度及线性的评价（参考相关标准），只有在以上评价完成并且符合相关标准要求后，才可进行方法学对比实验。
体外诊断试剂分析性能评价灵敏度是指试剂对目标物质的检测能力。
在体外诊断中，血象仪的性能评价指标之一便是指百分之多少的微量物质能够被检出。
灵敏度越高，则意味着能够更早地进行病情诊断，对患者的治疗更加准确和有效。
特异性是指试剂对目标物质的选择性。
在体外诊断中，特异性评价包括两个方面：一是试剂对目标物质的特异性反应，即试剂只与目标物质反应，而不与其他物质反应；二是试剂对其他物质的干扰程度，即试剂对非目标物质的选择性。
特异性评价的目的是排除干扰因素，避免误诊和误治。
准确性是指试剂对目标物质的准确测量能力。
准确性主要包括两个方面：一是试剂对目标物质的测量值与真实测量值的接近程度；二是试剂中存在的系统误差和随机误差的大小，即试剂的重复性和恢复性。
准确性评价的目的是确保试剂检测结果的可靠性和准确性。
稳定性是指试剂在储存和使用过程中性能的稳定性。
稳定性评价主要包括两个方面：一是试剂的储存稳定性，即试剂在指定的储存条件下，其性能是否能够保持稳定；二是试剂的使用稳定性，即试剂在使用过程中，其性能是否受到环境因素的影响。
稳定性评价的目的是保证试剂在长期使用过程中，性能能够持续稳定。
为了进行体外诊断试剂的性能评价，需要制定相应的评价方法和标准。
评价方法主要包括实验法、检测技术法、临床比较试验法等，评价标准主要依据国内外相关法规、标准和临床实践经验等制定。
总之，体外诊断试剂的性能评价对于确保其可靠性和准确性具有重要意义。
灵敏度、特异性、准确性和稳定性是评价试剂性能的关键指标，需要通过相应的评价方法和标准进行验证。
只有评价合格的试剂才能被广泛应用于临床诊断和治疗中，为患者提供准确和可靠的医疗服务。
体外诊断试剂性能分析评估体外诊断试剂是疾病诊断与治疗的重要辅助手段。
一个新开发的试剂能否真正面市，除了进行反应模式和体系等优化外，合理的性能分析与评估，是必经的程序，也是质量保障的基础。
通常，体外诊断试剂产品性能评估包括检测限、线性范围、可报告范围，准确度，精密度，干扰实验，稳定性，参考区间。
1.检测限检测限是指检测方法可检测出的最低被检测量浓度，也称为分析灵敏度。
分析灵敏度：一般用95％可信限计算：重复测定空白样本20次，计算20次反应测得的均值（X）和标准差（SD），以X+2SD（夹心法）或X-2SD（竞争法）计算出相应的浓度，即为体外诊断试剂的分析灵敏度，也是注册资料所需提供的内容。
功能灵敏度：将低值样本倍比稀释后重复测定10次以上，计算每个低值样本检测信号的均值、标准差和变异系数（CV），选择CV大于20％时所对应的低值样本平均浓度，这就是体外诊断试剂的功能灵敏度。
2.线性范围线性范围是指检测系统最终输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度成正比的范围。
建立一种定量测定方法的线性范围，需在预期测定范围内选择7-11个浓度水平。
准备足量的高值（H）样本和低值（L）样本，经不同比例混合配制成中间浓度样本，比例关系可按等间距或其他确定的比例。
其中，有几个重要的浓度水平需要考虑：1）最低分析浓度或线性范围下限；2）不同的医学决定水平值；3）最高分析浓度或线性范围上限。
3.可报告范围可报告范围是指对检测有意义的待测物浓度范围。
可报告范围低限：以方法性能指示的CV值为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最低浓度水平作为可报告范围低限。
可报告范围高限：当测定值超出线性范围上限时，此测定值应视为不准确值，需要对标本进行稀释。
由于基质效应的影响，任何标本并非可以做无止境的稀释。
也就是说，每一个实验项目有其最大稀释倍数。
这个最大稀释倍数与线性范围上限的乘积即为可报告范围高限。
4.准确度准确度是指检测结果与被测量真值之间的一致程度。
体外诊断试剂分析性能评估资料
分析性能评估主要包括以下几个方面：
1.准确性：体外诊断试剂的准确性是指试剂对试样中目标物质的检测
结果与实际浓度之间的接近程度。
准确性评估通常通过对标准样品进行检测，然后与已知浓度进行比较，并计算出误差值。
准确性是评价试剂性能
的重要指标，直接影响诊断结果的准确性。
2.灵敏度：体外诊断试剂的灵敏度是指试剂对疾病标志物的最低检测
限度。
灵敏度评估通常通过检测已知浓度的标准样品，并找到可以产生可
靠信号的最低浓度。
3.特异性：体外诊断试剂的特异性是指试剂能够正确识别出目标物质，而不受其他可能存在的干扰物质的影响。
特异性评估通常通过检测不同样
品中目标物质的存在与否，以及对其他可能存在的干扰物质的反应情况。
4.精密度：体外诊断试剂的精密度是指试剂在重复试验中产生的结果
之间的一致性程度。
精密度评估通常通过重复检测同一样品的多个平行样本，并计算出相关的统计参数，如标准偏差和变异系数。
5.范围：体外诊断试剂的范围是指试剂能够正常工作的浓度范围。
范
围评估通常通过检测已知浓度的标准样品，并找到试剂能够准确检测的最
高和最低浓度。
以上是体外诊断试剂分析性能评估的一般内容，每种试剂的评估方法
可能会有所不同，但总体目标都是确保试剂的准确性、灵敏度和特异性。
分析性能评估是体外诊断试剂研究和应用的关键环节，对于确保诊断结果
的准确性和可靠性具有重要意义。
体外诊断试剂研制分析性能评估要点作者：嵇昊曹宁刘俊张莉来源：《科技风》2017年第26期摘要：根据国家及地方食品药品监督部门的政策法规要求和作者从事体外诊断试剂产品审评工作的经验，阐述临床化学体外诊断试剂分析性能评估研究要点，为此类产品的研发和申报提供指导性建议。
关键词：临床化学；体外诊断试剂；评估要点目前，临床所应用的化学体外诊断试剂超过50 种，按常规分类可将其大致分为酶类、基质类、血脂类、免疫类等，在临床中广泛用于测量肝脏功能、肾功能、心肌酶谱、风湿性疾病、心血管功能、体液电解质、免疫性疾病、血脂、血糖等[1]，不管在健康人群体检过程中，还是疾病患者的诊断过程中，这些临床化学指标都是最基本也是最重要的检测项目，而当今疾病的预防、诊断和治疗也越来越多地依靠检验科室提供的检测信息，这些信息将直接影响临床医生对疾病的正确诊断和治疗[2]。
1 主体本文中，主要探讨的是符合GB/T 261242011 临床化学体外诊断试剂（盒）国家标准，即用于医学实验室进行临床化学项目定量检验所使用的基于分光光度法原理的体外诊断试剂，并且在管理上属于二类医疗器械的产品的分析性能评估要点分析[3]。
在申请人提交的产品注册资料中，分析性能評估资料是最重要的基础资料，内容主要包括空白吸光度、灵敏度、精密度、批间差、线性范围、准确度、干扰实验、稳定性、参考区间等项目，各项目均应有具体的试验数据、统计分析以及接受标准等详细资料[4]。
产品性能评估将直接影响注册产品的质量。
1.1 空白吸光度空白吸光度是用指定的空白液加入试剂作为样品测试时所得到的吸光度值，测试条件一般为37℃、测试主波长、1 cm 光径。
在实际研发过程中，企业通常采用的空白液为蒸馏水或生理盐水，还有很少企业采用含牛血清白蛋白的缓冲液。
在临床检测过程中样本一般为血清、血浆或尿液等，空白液具体选用哪种，须考虑不同试剂的反应特性和检测样本的基质效应具体而定。
目前市场中产品空白吸光度的表示方法一般为“空白吸光度>某数值”或“空白吸光度对于采用速率法的临床化学体外诊断试剂，则应以空白吸光度变化率作为性能指标，即采用仪器启动稳定后测定的吸光度和约5 min 后的吸光度来计算试剂的空白吸光度变化率。
体外诊断试剂分析性能评估资料一、背景信息二、试剂性能评估目的明确试剂性能评估的目的，例如比较不同试剂的性能、验证其中一试剂的精确度或在特定样本中的准确性等。
三、性能指标1.精确度：通过比较试剂结果与真实值的一致性来评估试剂的精确度。
可以使用已知浓度的标准物质来进行精确度评估，或者与其他常用试剂进行对比。
2.灵敏度：指试剂能够检测到的最低浓度或最小的目标物质量。
可以使用逐级稀释的样品来评估试剂的灵敏度。
3.特异性：确定试剂的特异性，即是否仅检测目标物质，而不受其他干扰物质的影响。
可以使用其他物质来进行干扰性评估，以评估试剂的特异性。
4.精密度：通过重复测试同一样本来评估试剂的精密度，以确定结果的一致性和可重复性。
可以使用同一样本进行多次测试，然后计算结果的方差或标准差来评估试剂的精密度。
5.稳定性：评估试剂在不同环境条件下的稳定性，如温度、湿度等。
可以进行一系列稳定性实验，例如长时间储存后的试剂性能评估、加速老化测试等。
四、方法描述五、结果与分析给出实验结果的详细数据，包括浓度、吸收值、阳性/阴性判断等信息，并进行相应的分析。
可以绘制图表或使用统计学方法来表示结果，并进行结果的可视化展示和数据解读。
六、讨论与结论对实验结果进行讨论，并得出结论。
讨论可以包括与其他试剂的比较、方法的优缺点、可靠性和可重复性等方面。
最后，总结试剂的性能评估结果，并提出对试剂改进和应用的建议。
以上内容仅为体外诊断试剂分析性能评估资料的基本内容，具体内容和格式可根据实际需求进行调整和完善。
1 定量标记免疫分析方法分析性能评估的主要指标1.1 灵敏度1.1.1 分析灵敏度：试剂盒的灵敏度即最低检出量是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。
一般用95％可信限计算：重复测定零剂量点（n≥10），计算反应量的均（x_）和标准差（SD），以x_+2SD（夹心法试剂盒）或均值x_-2SD（竞争抑制法试剂盒）的反应量计算出相应的浓度，即为该试剂盒的分析灵敏度，这是我们医疗器械注册资料所需提供的内容。
1.1.2 功能灵敏度：将低值样本倍比稀释后重复测定（n≥10），计算反应量的变异系数（CV%），CV%大于20％时所对应的剂量点，即为该试剂盒的功能灵敏度。
1.2 特异性诚如我们所认识到的，标记免疫分析是特定抗体对特定抗原的特异识别。
不同来源的抗体与结构类似物结合从而产生交叉反应是客观存在的，因此特异性检验是正确认识该试剂盒对结构类似物抗干扰能力的指标。
特异性检验通常有两种标定方法：1.2.1 交叉反应率：一定浓度的结构类似物在本试剂盒上的测定结果（物质的量）与该类似物的量的比值的百分率。
如：1 000 pmol/L的结构类似物，在某试剂盒上测定结果是5 pmol/L，其交叉反应率＝5 pmol/L/ 1 000 pmol/L * 100%=0.5%。
1.2.2 实际测量值：对于不能用物质的量表示的被测物，如糖蛋白激素FSH、LH、TSH 和HCG，这4种激素具有相同的α亚单位，仅仅是α亚单位上部分氨基酸不同，实际操作中很容易产生交叉反应，而这4种激素又分别有各自的同形异构物，其量的表达方法还不能用物质的量（mol/L，ng/mL）表示，而只能借助于生物测定的活性单位（IU/L，mIU/L）表示，而每一种激素的活性单位（IU）又有完全不同的生物学意义，相互之间没有任何关联，即并且每一种激素定义的单位意义完全不同，不同来源相同质量的某一种激素的活性单位也不同，它们之间的交叉反应绝对不能用交叉反应率表示，因此往往选择实测值表示。
1.2.3 选择交叉反应对照物：当交叉反应的测量结果高于我们期待的结果时，可以从两个方面分析：首先，该试剂盒抗体确实与这一交叉反应因子存在交叉反应，如FSH在结构上与另外3种激素仅仅是α亚单位上个别氨基酸的不同，其特征抗体与其它位点有一定程度的结合的可能性是存在的，这种非特异结合被限制在一定范围内是可以接受的。
在另一方面，如果选择的交叉反应对照物中含有少量的被测物，如：欲考察FSH试剂盒对LH的交叉反应，选择的LH抗原中含有少量的FSH，高浓度的这种抗原在FSH试剂盒中的测量结果很可能高于所期待的结果，应充分认识到这种结果并不是由于FSH抗体的交叉反应引起的。
因此，当交叉反应的测量结果高于我们期待的结果时，可以选择另一来源的交叉反应对照物重新测试，以排除由于抗原不纯而引起的对该试剂盒抗体交叉反应的误解。
1.2.4 交叉反应物对测定结果的影响：多大的交叉反应是可能接受的，主要取决于被测物和交叉反应物在人体内的相对含量。
如3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸(Triindonhyroxine，T3)和甲状腺素(Thyroxine，T4)，因为血清中T4的含量是T3的近千倍，所以对于测量T4的试剂盒而言，与T3存在10%以下的交叉反应率都不会影响T4的测定，而如果对于测量T3的试剂盒而言，即使与T4存在1%的交叉反应率，都会严重影响T3的测定。
1.2.5 其它影响因素：评价试剂盒时还应注意其它因素，如：溶血、高血脂、抗凝剂、其它药物、异嗜性抗体及自身免疫性疾病患者等对样本测定结果的影响，这种影响对不同方法、不同检测项目的影响程度是不一样的，应逐一充分认识。
此部分内容可放入抗干扰能力。
1.3 剂量－反应曲线建立定量标记免疫分析的最主要特征就是建立剂量－反应曲线，通过已知浓度的校准物质（自变量，X）和相应的反应量（因变量，Y）建立剂量－反应关系，并同时测量待测品，通过待测样品的反应量（Y'），计算出未知样品的浓度（X'），因此，这种剂量－反应关系需要有良好的相关性，即统计学上的“相关系数（r）”（coefficient correlation），当相关系数越趋近于1时，表明剂量－反应关系越密切。
建立剂量－反应曲线时应注意：1.3.1 选择适当的数学模型拟合如前所述，在评价试剂盒时，我们通常用双对数（适用于非竞争性双位点夹心法标记免疫分析）数学模型和log-logit（适用于竞争法标记免疫分析）数学模型。
一般认为，经适当的函数转换后的标记免疫分析的剂量－反应相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于0.9900。
1.3.1.1 双对数数学模型：顾名思义，双对数数学模型因函数自变量（剂量）和因变量（反应量）都经对数转换而得名。
自然对数和常用对数对剂量－反应曲线的影响仅仅在于截距（A）的不同，通常我们取自然对数：lnY=A+B*lnX。
大量的经验表明：多数夹心法标记免疫分析（特别是微量或超微量分析，小于10－9克）经双对数函数转换后，相关系数都能大于0.9900；对于微克级的被测物，选择半对数函数有时能得到更好的相关系数。
1.3.1.2 log-logit数学模型：经验表明，对于抑制法标记免疫分析，log-logit数学模型因其计算方法相对简单，且大多数情况下可以得到较好的相关性，因此是评价这类试剂盒的首选数学模型。
方程式：logit Y = A + B*log X，式中：logit Y =B/B0 /( 1－B/B0)对于这类试剂盒，还应要求有效剂量值（ED25、ED50、ED75或ED20、ED50、ED80）应在剂量－反应曲线最高浓度点和最低浓度点之间，即25%（或20%）结合率（B/B0%）所对应的剂量浓度点应小于曲线最高剂量点，75%或（80%）结合率（B/B0%）所对应的剂量浓度点应大于曲线最低剂量点，使曲线在规定的剂量范围内有足够的落差。
1.3.2 标记免疫分析在选择了特异抗体对特异抗原的特定识别以后，剂量－反应曲线在适当浓度的抗原、抗体配伍下，在一定范围内，应呈现良好的相关性，相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于0.9900。
否则应从如下几个方面考虑：①抗体的浓度是否与抗原浓度相适应；②选择的剂量范围是否合适；③选择的函数方程是否合适。
1.4 精密度评价精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同实验结果的能力的指标，通常用重复多次样本测量结果的变异系数（CV%）表示，精密度评价是质量控制的重要内容。
1.4.1 分析内(intra assay)精密度：同一次实验内（同一块微孔板上或实验条件完全相同的情况下）同一样本（如：质控血清）重复测定（n≥10），测定结果的变异系数(CV%）应不高于10.0%。
分析内精密度的变化或异常升高，应从方法学改进、实验室条件改变、操作失当等方面排查原因。
1.4.2 分析间(inter assay)精密度：分析间精密度涵盖的内容非常广泛，至少应包含入下内容：同一试剂盒，不同批次之间；同一试剂盒，同一批次，不同实验室之间；同一试剂盒，同一批次，同一实验室，不同操作者之间；同一试剂盒，同一批次，同一操作者，有效期内不同时间之间等。
不同层次的分析间精密度的意义不尽相同，在评价试剂盒质量时应引起质量控制工作者的足够认识。
评价分析间精密度时，同一样本（如：质控血清）在上述条件下重复测定（一般n≥10），测定结果的变异系数（CV%）应不高于15.0%。
1.5 准确性评价准确性评价通常指测量结果趋近于真值的程度。
但是，正如我们所认识到的，对于标记免疫分析，特别是具有多种同形异构体的大分子物质而言，目前的分析方法还很难得到真值，因此，还没有真正意义上的“准确性评价”方法，目前通常是通过标准品核对实验或回收率实验进行考察。
1.5.1 标准品核对实验：试剂盒内校准品与相应浓度的国际或国家标准品同时进行分析测定，要求两条剂量－反应曲线不显著偏离平行（t测验），以国际或国家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测效价与标示效价之比应在0.900～1.100之间。
标准品核对实验应注意：①配制国际或国家标准品的稀释液应与试剂盒校准物质稀释液相同，以保证两条剂量－反应曲线在相同反应体系下反应；②配制国际或国家标准品的浓度范围应与试剂盒校准物质实际浓度范围相当，以保证反应能在试剂盒工作范围内进行。
1.5.2 回收率实验1.5.2.1 添加回收率：选择经纯化、分析过的，性能稳定的已知高浓度的抗原定量加入低浓度被测样本中，并进行分析测定，测定结果与已知理论浓度相比较，应在90.0%～110.0%范围内。
1.5.2.2 稀释回收率：同样选择经纯化、分析过的，性能稳定的已知高浓度的抗原，按照一定比例稀释成系列溶液，并与试剂盒剂量－反应曲线同时测定，高浓度抗原系列与剂量－反应曲线相比较，应不显著偏离平行（t测验），效价比应在0.900～1.100之间。
添加抗原溶液和稀释液同样应与试剂盒校准物质稀释液相同，以保证反应在相同体系下进行。
注意：至少配制3个不同浓度添加到空白中的测试物，每一浓度配制2份样品，每1次试验对6份样品重复测定3次，比较测定值和真实值求出回收率（%），即偏差。
1.6 检测范围（range）剂量-反应曲线的工作范围(working range)是指能达到一定精密度、准确性和直线性时，测定方法适用的高低限度或量的区间，应使其最精密的部分即曲线斜率最大的部分适合于临床试验测定需要的范围。
它既可以包括全部正常范围(适合于高于和低于这个数值均有诊断意义的物质，如血清胰岛素、地高辛测定)，也可以在正常范围的一端(即低于或者高于这个数值，不是两者均有诊断意义的物质，前者如血清雄烯二酮测定，后者如血清肿瘤标志物分析)。
1.7 高剂量钩变效应（HOOK效应）当标本中被测物浓度超过线性范围上界时，所得结果反而降低或呈阴性，这种现象被形象地称为高剂量钩变效应（HD-hook effect）。
由Miles等于1974年用双位点IRMA测血清铁蛋白时发现。
产生这种现象的原因可以归纳为：在一步法试剂盒中是由于大量过剩抗原与被捕获抗原竞争结合限量的标记二抗，二步法试剂盒与抗原的“质”（表位数量及其重复表达数量）有关。
固相捕捉抗体过量或有重复表达表位的抗原，呈饱和结合，标记二抗与抗原交叉重叠结合，产生立体效应，使抗原“异构”，与一抗的亲和力减弱。
洗涤时，标记二抗体与抗原形成的复合物自固相脱离。
用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩变效应的发生。
使用时，可以将这些样本进行稀释，使其测量结果落在剂量－反应曲线内，这一测量结果与稀释倍数的乘积即为该样本的原始浓度。
1.8 稳定性评价试剂盒在有效期内，在规定的条件下保存应保持稳定，各项性能指标应符合质量标准要求。
