第三章基因工程工具酶

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。

2．类型：来自原核生物，有三种类型。

Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。

Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。

另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。

同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。

与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。

常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。

但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。

Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。

三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。

第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。

2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。

生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。

科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。

社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。

一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。

↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。

↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。

史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。

↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。

↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。

↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。

↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。

↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。

二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。

(2)原理：基因重组。

(3)操作水平：基因(分子)水平。

2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。

在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。

本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。

一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。

它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。

1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。

它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。

一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。

1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。

它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。

通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。

二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。

在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。

2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。

它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。

2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。

它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。

通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。

三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。

在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。

3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。

它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。

3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。

它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。

第三章基因工程制药第一节：基因工程制药基本环节基因工程技术六个基本过程：分离→酶切→连接→转化→筛选→验证。

（一）基因工程中常用的工具酶：ⅰ：核酸限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶，简称内切酶。

主要存在于原核微生物中。

（1）限制和修饰系统：原核微生物中存在限制性内切酶及甲基化酶，它们对DNA底物有相同的识别序列，但有相反的生物功能。

而甲基化酶具有宿主专一性，可识别宿主双链DNA分子的特定序列进行甲基化修饰，而不修饰外源性DNA分子，从而避免了限制酶对宿主DNA的降解。

（2）限制性内切酶的分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。

其中Ⅱ型限制性内切酶识别和切割产物是特异性的。

（3）Ⅱ型核酸限制性内切酶：1．酶切方式有两种：①断裂位置交错，形成粘性末端，又可分为从5′粘性末端和3′粘性末端；②对称轴处断裂形成平头末端。

2．同裂酶：是指来源不同，识别序列相同的酶，其切割位点同，产生平头或粘性末端。

3．同尾酶：来源和识别序列都不同，但切割后产生相同的粘性末端的酶。

4．限制性内切酶产生的末端的连接方式有三种：①匹配粘性末端的连接②平端连接③不匹配粘性末端的连接（有两种：67）5．限制性内切酶反应的影响因素：DNA的纯度、反应速度、反应体系的缓冲液、酶量、体积、时间、DNA甲基化程度、DNA的分子构型等。

ⅱ：DNA连接酶：是指催化两条分别具有5′-磷酰基末端与3′-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶。

目前使用的DNA连接酶:T4噬菌体DNA 连接酶、大肠杆菌（E.coli）DNA连接酶。

特点1．T4-连接酶：能够连接含粘性末端或平头末端连接的DNA片段或双链DNA 的切口。

连接反应中 ATP+作能源辅助因子。

2．大肠杆菌：只能连接粘性末端DNA片段或双链DNA的切口，不能连接平头末端DNA片段。

在连接反应中用NAD+作能源辅助因子。

ⅲ：聚合酶：（68）（二）载体：概念：（1）载体：是指凡来源于质粒或噬菌体的ＤＮＡ分子，可以供插入或克隆目的基因ＤＮＡ并具有运载外源ＤＮＡ导入宿主细胞能力的片段。