第四章 放射自显影技术.

• 2、冰冻切片 冰冻切片用以研究可溶性的小分子放射性成分 的分布，必须将新鲜组织块量于液氮冷却的异戊烷或丙烷中或 干冰丙酮中快速冷冻，固定活体结构，防止冰晶形成，然后以 不同方法进一步处理。 • （1）组织块处理 • ① 冻干－渗蜡 首先深冻组织块，低温真空干燥，通过升华 使组织脱水；然后真空渗蜡：冻干组织块置于试管固体石蜡上， 抽真空后，在60℃水浴渗蜡。 • ② 冷冻取代 用有机溶剂取代水分子而使组织脱水。吉林农 科院：在广口热水瓶中放入干冰，在有胶塞的试管中充入经无 水硫酸钠反复脱水和蒸馏后的纯丙酮，插入干冰中预冷。速冻 的组织块于低温干燥条件下迅速转入试管中，密封。并置于冰 箱中，每天加干冰，一周后，拉试管胶塞于冰面中，自然升温 至室温，取代完毕。 • （2）恒冷切片箱中切片 冰块装于恒冷箱切片机上，在低温 下切片，切片浮于益玻片上，再将盖玻片于黑暗中沾于乳胶干 板上，在低温下曝光，即为融表法。
第四章 放射自显影技术
• 第一节 放射自显影的基本概念 • 一、放射自显影的定义 • 利用放射性物质发出的射线能使照相乳胶感光的这一 特性，来检测样品中的放射性的技术，称为放射自显 影技术。 • 将放射性样品在黑暗中与照相乳胶接触在一起，即使 照相乳胶暴露于射线中，射线使乳胶中的溴化银感光， 产生潜影，经定影，定影后在乳胶上形成与样品中放 射性物质所在的部位和活度相对应的有银粒组成的图 象。 • 放射自显影技术是利用放射性样品能在照相乳胶上产 生图像的特性来检测样品中放射性及其分布的一种同 位素示踪技术。
• 曝光时间的长短和射线的种类( 能量、半衰期) 、活度和感光材料的 类型及自显影的种类有关，同时也要考虑到放射性分布的无均匀性。 • 对 X- 光片， 105 ～ 106 粒 /cm2 能产生可显影的潜影， 107 ～ 1010 粒子 / cm2 产生好的潜影。因此可以此数除以单位面积样品的放射性活度 （dpm/ cm2）来粗略的估计曝光时间（t=(dpm/ cm2)/( 107～1010粒 子 / cm2) ，再结合实验曝光确定适宜的曝光时间，即在正式制片的 同时，压制相同样品的预备片，在不同时间取出显影，直至出现清 晰的图象。 • 2、显影 显影过程是在显影剂的作用下，使感光的银颗粒还原，使 潜影显现出来。是一个自催化的过程，在还原已开始的晶粒中比还 原还没有作用的晶粒还原的快，因此在含有潜影银的晶粒中首先开 始作用，溴化银转化成银原子，聚积在潜影形成的位置上，溴离子 从晶粒中扩散出去。在没有潜影的银粒中也能显影，但要慢的多， 显影要掌握在正好使感光晶粒还原，而未感光的晶粒还未还原，结 果使形象显示出来。 • 显影液一般用D19-6或市售的显影粉配置。温度在19±1℃，时间一般 在2～3 min。
• 3 、定影
定影剂的主要成分是 Na2S2O3（硫代硫酸钠），
目的是去掉未显影的晶体颗粒，使图像得以长久保存。 • 其反应式如下： • Na2S2O3+AgBr→NaAgS2O3+NaBr； • NaAgS2O3+ Na2S2O3→Na3Ag(S2O3)2。
• 定影的时间一般为15 min或更长，温度控制也没有显影过
• 三、照相过程 • 1、曝光 • （1 ）潜影的形成过程 射线粒子进入晶体，能从溴离子中打出电子， 形成电子与银离子的离子对，只要能量足够，这个电子能离开轨道， 进入导电带，在晶体内移动，并移向缺陷处，形成阴电层，银离子 向阴电层移动，获得电子，形成银原子，银原子聚集形成潜影。同 时，失去电子的溴离子成为溴原子，并从晶体表面释放出，跑到明 胶中。 • （2）曝光条件 紧密曝光，固定，安全曝光，无外源放射性，安全 位置，别人不会拿动或作上标记，湿度不能太高，低温下能增加敏 感度。 • （3）曝光时间 曝光时间不足，来不及形成潜影，不能得到显影形 象。因为在一般显影条件下，要使银粒显影，需要有一定的银粒数 及每粒含有一定数量的银原子数。曝光时间过长，本底增加，降低 了分辨力，特别是β 射线，由于散射使形象模糊。在曝光时间过长 情况下，有时感光度反而降低，因为银原子与溴原子重新结合，称 为潜影衰退（ image fadding ）。过量的水分，大气中的 O2 、 H2O2 过 大或不均匀的压力，过高的温度都能增加潜影衰退。因此在曝光之 前必须使乳胶完全干燥，如需长时间曝光，可除去空气，在 N2 或氩 气中暴光，并且在低温下进行。
• 第三节 光学显微自显影（IMARG）的制作 • IMARG是在光学显微镜的水平上观察放射性物质的分布，所用的样品 通常是粘在载玻片上的切片。根据所研究物的性质和观察的结构部 位的大小，制作不同厚度的包埋切片或细胞涂片。然后在切片上覆 盖乳胶膜。经暴光，显影，定影后，连同切片一起观察乳胶中的银 粒分布。 • 一、固定和包埋材料及切片的制备 • 1、石蜡包埋切片 取新鲜的组织块（经放射性标记， 0.5cm×0.5cm×0.5cm）→固定（保持新鲜状态的结构，一般采用卡 诺氏Ⅰ（96%乙醇：冰醋酸=3：1 V/V）或卡诺氏Ⅱ（96%乙醇：氯仿： 冰醋酸＝6 ：3 ：1 V/V/V ） 固定液固定24 小时，若要保存核蛋白， 可采用甲醛：70%乙醇：冰醋酸=5：90：5（V/V/V）固定液）→脱水 （用逐级酒精脱水）→浸透（1/2 二甲苯+1/2 酒精→二甲苯） →透 明（1/2二甲苯+1/2石蜡）→包埋（将融化石蜡中的组织块，量于用 纸折成或特殊的包埋盒内的适宜位置，灌入融化石蜡，投入冰水中 冷却） →修块（将样本周围所涂石蜡切掉，修成适宜切片的一定形 状的蜡块）→切片→展片→脱蜡→复水→干燥。 • 若要在高倍显微镜下观察，制作0.5～1μ m的半薄切片，则采用树脂 包埋。其处理过程与上述基本相同，但要求更精细的操作，要用性 能良好的切片机和玻璃刀。
程那么严格。定影完成后，充分水洗，除去定影剂和硫化
物，然后凉干。
•四、宏观自显影（Macor-autoradiography）的观察 •1 、肉眼观察 观察发黑的部位和程度，如果放射性只分布在个别部 位，或放射性比较弱，发黑不明显，必须有实物照片比较观察。用X－ 看片灯可以观察的比较清楚。 •2 、光密度测量 肉眼观察只能获得不同器官或组织放射性多少的相 对印象，不能给出具体的数据。光密度测量是用光密度计测量透过部 位的光的强弱，对底片黑化程度能给出定量数据。因此能较客观评价 各部位、器官、组织的放射性的相对分布。这种自显影定量的关键在 于制备和应用放射性阶标。即用逐级降低的已知放射性活度的阶梯性 标准（简称为放射性阶标），与待测样本一起曝光和加工，通过与阶 标的黑度相比，来确定标本的放射性（参考王成方等“大豆光合产物 运转分配的定量自显影研究”原子核农业应用，1985，4：26-29）。 •由于标本各处的组织结构的差异，自吸收及对乳胶接触的几何条件不 同，因而必须对用阶标法测出的标本的放射性活度进行修正后，才是 标本的实际放射性活度。即在自显影后，将标本的代表性部位取下， 称量，并液体闪烁计数仪测量放射性，与自显影片的值相比较，求出R 值（R=标本液闪测得放射性活度/自显影测得的放射性活度），再进行 校正。（参见刘鼎新，放射自显影技术的一些新进展，1980，1，核医 学进展；Rogers A.W.，Practical Autoradiograph，England Review， 1979，（20））。
• 二、自显影的制作 • 1、感光材料 通常为乳胶，其基本组成为溴化银晶体、支持 物、明胶（溴化银晶体的支持物）。 • 各种感光材料主要由于银盐的浓度，结晶颗粒的大小和乳胶层 的厚度不同而具有不同的敏感度和分辨能力，适于不同目的的 自显影。颗粒越大、越多，即越容易形成潜影。而分辨力与颗 粒的大小和乳胶层的厚度相关。 • 照相乳胶的类型有 X光片、幻灯片或电影正片、核乳胶、乳胶 干板、加强膜（荧光片增强感光）、照相底片。 • 2、自显影的制作 一般采用接触曝光，将样本平整的一面与X 光片或其它固体照相材料紧密接触，样本的另一面填上泡沫塑 料等松软材料。X光片上覆盖一层薄纸，压紧，使其和样本紧 密接触。市售的X光曝光盒底层有泡沫塑料，放一张保护纸后， 放样本，X光片在样本上面，再覆盖保护纸将盖子扣紧，就能 完全曝光。为防止薄层板上分离的纯化学物质或土壤中的化学 物质对感光材料的作用，可再薄层板或剖面上加保护膜，这对 32P样品没有影响，对14C、35S等软β 核素，可能将一部分射线 挡除，而对3H则完全把射线隔断。
• 二、制作放射自显影的基本过程 • 生物材料的标记→自显影样品的制备→自显影的制作→曝光→显影 →定影→观察与分析（定位及放射性测量）。 • 三、放射自显影的基本类型 • 依样品和观察部位的大小，分宏观和微观自显影；后者又有光学自 显影（IMARG）和电镜自显影（EMARG）。 • 1、宏观自显影 将宏观的标记样品与固体照相乳胶接触曝光，显影， 定影后，形成黑白图象，用肉眼观察或光密度计测量黑度来分析放 射性物质在器官组织中的分布情况。 • 2、光学显微自显影 通常在常规的组织学切片或涂片上涂上一层液 体乳胶膜，经曝光，显影，定影后，在显微镜下观察银颗粒的分布， 来了解放射性标记物在细胞间或细胞显微结构中的分布情况。观察 的范围很小，要求分辨力高，在材料标记，切片制作，乳胶膜的制 作及观察分析上要求更高的技术。 • 3、电镜自显影 在超薄切片上涂上单层乳胶膜，经曝光、显影、定 影后，在电子显微镜下观察银颗粒的分布，来了解放射性物质在细 胞超微结构中的分布情况。甚至可观察到生物大分子的标记部位。 观察的结构部位很小，要求分辨力高，在材料标记，切片制作，乳 胶膜的制作及观察分析上要求更高的技术。
• 第二节 宏观放射自显影（Macro-autoradiography）的制作 • 以宏观材料制作的自显影，肉眼或光密度计观察组织、器官中 放射性物质的分布。 • 一、样品的制备 • 1、植物材料 整株或部分器官（枝条、叶片、花蕾等），压 制成标本要求干而不脆，平整。若植株过大可折转或剪断。若 观察放射性物质在茎杆中的分布，可制成茎杆的纵横切片。 • 2、动物材料 整体切片：纵剖面或横剖面，或组织的宏观切 片。 • 3、层析谱 纸层或薄层板展开后，充分干燥，可喷射聚氯乙 烯或硝化纤维（polyvinyl chloride or nituocellalose）， 以防止自显影时薄层板上吸附剂粉的移动。 • 4、凝胶电泳块 为防止水分对乳胶的影响可采取：（1）干燥； （2）包蔽；（3）冰冻：在低温条件下曝光。 • 5、其他 如土壤剖面，可将土壤切成平整的剖面，用薄的聚 氯乙烯膜包蔽。