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细胞/组织高质纯化溶酶体（lysosome）分离试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞/组织高质纯化溶酶体（lysosome）分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出活性完整而高度纯化的溶酶体细胞器的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
适合于动物软组织（肝或脑组织）和培养细胞的溶酶体的制备。
产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。
技术背景溶酶体（lysosome）是一种普遍存在于真核细胞中的细胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各种细胞残渣和废弃物质，包括过多的或破损的其它细胞器、食物颗粒、吞噬的细菌和病毒等。
其大小为0.5至1.5微米，球圆形，溶酶体内pH为5.0左右。
溶酶体功能异常会引起溶酶体贮积症（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性白痴病（Tay-sachs disease）和庞贝氏症（Pompe’s disease）。
溶酶体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。
从任何组织或细胞分离溶酶体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得溶酶体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的溶酶体。
产品内容清理液（Reagent A）毫升裂解液（Reagent B）毫升净化液（Reagent C）毫升强化液（Reagent D）毫升分离液（Reagent E）毫升高纯液A（Reagent F）毫升高纯液B（Reagent G）毫升高纯液C（Reagent H）毫升高纯液D（Reagent I）毫升高纯液E（Reagent J）毫升保存液（Reagent K）毫升产品说明书1份保存方式保存净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备HANK平衡盐缓冲溶液（HL12028）或PBS缓冲溶液（HL12033）：用于清理细胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（HL12052）：用于细胞处理所需的培养基15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作的容器6毫升超速离心管：用于超高速离心的容器4℃台式离心机：用于沉淀细胞4℃超速离心机：用于分离细胞器成分DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞实验步骤一、动物软组织溶酶体分离（组织匀浆法）实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移取xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。
E B E R 检尝试剂盒（本位纯接）之阳早格格创做（支配之前请仔细阅读此证明书籍）检测本理战意思EBER 是EB 病毒编码的小RNA ，是EB 病毒的表黑产品，正在EB 病毒熏染的细胞核中以下拷贝数存留.根据EBER 的特有序列安排的EBER 单链 DNA 探针能特同天与EBER 靶序列互补、纯接，进而检测EB 病毒是可存留.此要领检测石蜡构造切片中的EB 病毒具备极下的特同性战敏捷性.暂时EBER 本位纯接已成为构造战细胞中EB 病毒的尺度检测要领，正在国际上广为使用.试剂盒提供的资料战试剂（注意：EBER 纯接液请-20℃保存）成 份保存要领 提供量20人份 50人份1 EBER 纯接液 -20℃ 400ul2 蛋黑酶K 4℃ 40ul 100ul3 一抗 4℃ 1ml l4 两抗4℃ 1ml l 5 HRP 散合物 4℃ 1ml l 6 DAB 底物 4℃ 1ml l 7 DAB4℃ 20ul 50ul 8 18X18mm 盖玻片 4℃/室温 20片 50片 9干盒删效液4℃/室温30ml30ml♦用户自备资料战试剂1. 55℃恒温培植箱 8. 两甲苯2. 37℃恒温培植箱 9. 酒粗3. 光教隐微镜 10. PBS(pH=7.6)4. 移液器 11. 苏木素5. 计时器12. 氨火 6. 玻片染色缸战染色架 13. 盐酸酒粗 7.干盒2个♦ 真验前需配试剂 30％干盒删效液与干盒删效液及蒸馏火，按3:7配造成30%干盒删效液备用. ♦ 真验时需配试剂 A 、1X 蛋黑酶K将蛋黑酶K 与1×PBS 按1：25的比率配造备用.（现配现用）B 、DAB 隐色液依据需要配造DAB 隐色液，以可覆盖所有构造的量为宜.与DAB 与DAB 底物，依照1：50的比率混匀，躲光保存备用.(现配现用) ♦支配步调1．切片处理：将4um 薄度的构造粘附正在APES 处理的载玻片上，切片于60-70℃烘烤60分钟以上.（修议屡屡真验共时附加阳性、阳性对于照片） 2．脱蜡及火化：（注意：使用过的两甲苯，应相映延少脱蜡时间，以包管脱蜡真足）黑酶K 消3．蛋化：甩搞切片, 将构造周围液体用滤纸吸搞, 每弛切片滴加适量1×蛋黑酶K 处事液(约50 ul ，根据构造大小删、减量), 室温孵育5分钟.蒸馏火洗涤1×1分钟，留神揩搞构造周围液体. 4．纯接：4.1 每弛切片滴加适量纯接液(约20 ul ，根据构造大小删、减量)，并加盖玻片（本试剂盒配备，可根据加进纯接液量举止剪裁）；4.2 搁置火干盒中，55℃恒温箱孵育60-90分钟；4.3 转至37℃孵育4-16 小时（搁置于30%干盒删效液干盒中）.修议过夜（＜16小时）以包管矮拷贝样本的纯接效验；4.4 48℃（PBS 预温）浸泡切片，留神移去盖玻片，继承浸泡5分钟； 4.5 48℃PBS 洗涤3x 5分钟 (沉微振荡容器)；（注意：盖玻片规格应与纯接液量匹配，切片正在所有考查历程中要脆持干润状态，预防搞片）5．旗号搁大与隐色：5.1 留神揩去构造周围液体，滴加适量一抗(约50 ul ，根据构造大小删、减量)，37℃，火干盒中孵育30分钟；37℃PBS 浸泡3x2分钟（沉微振荡容器）；5.2 留神揩去构造周围液体，滴加适量两抗(约50 ul ，根据构造大小删、减量)，室温，火干盒中孵育20分钟；室温PBS 浸泡3x2分钟(沉微振荡容器)；溶液 次数×时间（分）两甲苯 3×10 100%酒粗 1 ×3 95％酒粗 1 x 3 80%酒粗 1 ×3 蒸馏火 1 x 35.3 留神揩去构造周围液体，滴加适量HRP散合物(约50 ul，根据构造大小删、减量)，室温，火干盒中孵育30分钟；室温PBS浸泡3x2分钟 (沉微振荡容器).5.4 留神揩去构造周围液体，滴加适量DAB隐色液(约50 ul，根据构造大小删、减量)，室温，火干盒中孵育约10分钟（分歧样本的隐色时间大概有所没有共，修议镜下瞅察隐色历程）；室温PBS浸泡3x2分钟(沉微振荡容器).5.5 自去火浑洗，苏木粗复染（可用盐酸酒粗瓦解及氨火返蓝）.梯度酒粗脱火，中性树胶启片.♦阳性截止推断尺度：仅为细胞核着色.胞浆战胞膜着色没有克没有及视为阳性，惟有当核团结时不妨出现胞浆阳性着色.♦其余事项：本试剂保量期为12个月.客户正在支到产品时请即时查看，如创造有中包拆破坏、试剂盒身分没有齐等产品问题，大概者正在使用历程中有所有疑问，请即时与泰普客户服务核心通联，咱们将即时为您办理.♦公司疑息：公司称呼：祸修泰普死物科教有限公司总部：祸修省祸州市金山金洲北路7号金山科技企业孵化器7号楼4层邮编：350002电话：800-804-8333，0591-2805 3600 传真：0591-2805 3700研收核心：北京市昌仄区北浑路中闭村死命科教园革新大厦A座207室邮编：102206电话：010-8072 0071 传真：010-8072 0072。
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法骨髓是一种重要的免疫器官，它主要负责成熟和存储多种不同类型的免疫细胞，如粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等。
因此，分离小鼠骨髓中的免疫细胞对于研究免疫系统的功能和生理学意义具有重要意义。
本文将介绍一种常用的分离小鼠骨髓中免疫细胞的方法。
一、实验材料准备1.小鼠骨髓2.磷酸盐缓冲盐水（PBS）3.甘露糖4. L-精氨酸血红蛋白（LymphoprepTM）离心管二、小鼠骨髓分离1.从小鼠胫骨和股骨中分离骨髓。
用PBS冲洗骨髓，使之保持湿润。
2.将骨髓加入含有10%甘露糖的PBS中，制成单细胞悬浮液。
3.将单细胞悬浮液缓慢地加入L-精氨酸血红蛋白离心管中。
4.用Lymphoprep离心管离心，离心条件为800 g，20分钟，室温。
三、免疫细胞的分离1.离心完成后，可以看到在离心管中分层形成了三明显的界面。
上层是血浆，中层是淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，下层是红细胞。
2.使用移液管沿着离心管壁缓慢吸取中层的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，并将其转移至新的离心管中。
3.加入PBS冲洗淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，使之保持湿润。
4.用PBS洗涤细胞三次，以去除离心试剂和其他污染物。
5.将细胞转移到培养皿中，并采用适当的培养基进行培养和分离。
四、实验注意事项1.在进行分离实验时，应尽量避免产生气泡，以免对细胞的分离和纯度产生影响。
2.离心时，离心管应该尽量垂直摆放，避免出现倾斜，以免影响细胞的分层。
3.分层完成后，移液管在取出上层血浆时，应尽量避开中层的细胞，以免受到污染。
五、实验结果通过上述方法分离得到的小鼠骨髓中的免疫细胞，其纯度高，可以用于继续进行免疫学、细胞生物学方面的实验研究。
六、结论分离小鼠骨髓中的免疫细胞是一个重要的实验技术，可以为后续的免疫学研究提供重要的细胞材料。
在实际操作中，需要严格控制每一个步骤，以确保分离得到的免疫细胞的纯度和活力。
同时，也需要注意安全操作，避免对实验材料和人员产生伤害。
单个核细胞的分离：（密度离心法）（一）外周血中的单个核细胞的分离：1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。
当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。
右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。
刺入浓度，小鼠约2～3mm。
当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。
若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。
若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。
左右两眼轮换更好。
体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。
用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。
采血完毕立即用纱布压迫止血。
每次采血量0.6-1mL。
2. 分离PBMC操作步骤：1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。
每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
（或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。
）4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书主要用途：淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液，达到特定比重，然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。
可以被用于动物（大鼠、小鼠等）单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。
产品严格无菌，即到即用，操作简易，分离出色，性能稳定，细胞活性保证。
技术背景：全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。
为了获得纯化完整的单核白细胞/淋巴细胞，采用Boyum（1968）的离心技术，可以方便快速地从全血和骨髓中分离。
产品内容：淋巴细胞分离液（200）毫升产品说明书1份产品特点：-密度变化率依照Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。
-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格检测标准：热源检测结果：＜0.5EU∕ml无菌检测结果：已检测应用人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。
这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞，包括骨髓血细胞、脐带血细胞及组织匀浆。
实验步骤实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液。
然后进行下列操作。
（注：上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。
如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离，需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。
1．准备无菌的锥形离心管2．加入淋巴细胞分离液3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1：1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。
3．小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。
（注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液）4．小心放进台式离心机离心30分钟，速度为400g5．小心取出离心管，切记不要震动6．可见，最上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环状层，然后为离心液层，最后为红色沉淀在管底的红细胞层。
猪外周血单核细胞分离
1.取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。
2.加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2
分钟。
例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。
本步骤在室温或4度操作均可。
注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
3.400-500g离心5分钟，弃红色上清。
4℃离心效果更佳。
4.如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。
通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
5.洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，
重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。
可再重复1次，共洗涤1-2次。
洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。
4℃离心效果更佳。
6.将细胞用RPMI1640完全培养基重悬后，以1×106/ml铺于细胞
培养瓶，24小时候，轻轻吸取未贴壁细胞，贴壁细胞即是单核细胞。
小鼠股骨单细胞悬液制备
股骨骨髓是小鼠骨骼系统中最丰富的造血组织之一，其中包含了造血干细胞和多种成熟血细胞。
股骨骨髓单细胞悬液制备技术是研究造血干细胞和血液系统发生、发展和功能的重要工具。
本文将介绍小鼠股骨单细胞悬液的制备和一些注意事项。
材料和方法
材料：
1.小鼠（6-10周龄）
2.70%乙醇
3.磷酸盐缓冲盐水（PBS）
4.10%牛血清白蛋白（BSA）
5.股骨
6.注射用针头（18G）
7.过滤器（70 μm）
方法：
1.将小鼠以适当的方式处死，立即取出双侧股骨。
2.用70%乙醇消毒股骨表面。
3.将股骨两端用18G注射针在PBS中冲洗数次，以去除骨髓内的血细胞。
4.用注射器注入10%BSA/PBS溶液，将股骨骨髓吹出并过滤，获得
单细胞悬液。
5.将细胞悬液在70 μm过滤器上过滤，以去除残留的组织碎片和细胞团。
注意事项
1.选择健康的小鼠，避免股骨受到外伤或感染。
2.消毒股骨表面是为了避免外界细菌的污染。
3.冲洗股骨是为了去除骨髓内的血细胞，以减少后续实验时的干扰。
4.使用10%BSA/PBS溶液是为了减少细胞间的黏附，保证单细胞悬液的纯度。
5.过滤细胞悬液是为了去除残留的组织碎片和细胞团，以获得单细胞悬液。
结论
小鼠股骨单细胞悬液制备是一种简单、有效的方法，用于研究造血干细胞和血液系统发生、发展和功能。
在制备过程中，需要注意材料的选择和操作的规范，以保证实验结果的准确性和可重复性。
灏洋生物向您介绍几种细胞的分离方法：白细的胞分离：〔加速红细胞沉降法〕加速红细胞沉降法利用高分子量的聚合物促使红细胞凝聚成串钱状，从而加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
常用的高分子聚合物有明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕及甲基纤维素等。
〔1〕试剂及配制3%明胶〔灏洋生物产〕〔粘度为25泊以上〕：选取优质明胶，用生理盐水配成3%溶液，置沸水浴加热溶解，分装，高压蒸汽灭菌8磅15-20min.6%右旋糖酐〔灏洋生物产〕〔分子量200-400KD〕：用生理盐水配制。
操作方法分为2种。
第一种：①取抗凝静脉血加入等量3%明胶盐水溶液中，混匀或用3份血液与1份3%明胶溶液混匀；②将试管直立静置室温或37℃温箱中30-60min,利用明胶与红细胞的粘合作用，促使红细胞快速下沉，而白细胞留在明胶溶液中；③用毛细吸管吸取富含白细胞的上层液，移入另一试管中；④按自然沉降法④-⑤操作。
第二种：①取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血，混匀；②按操作方法1的②-④操作。
外周血单个核细胞分离试剂：〔聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法〕外周血中单个核细胞〔PBMC〕包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。
利用比重1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
1．试剂及配制⑴聚蔗糖泛影葡胺分层液〔LTS1077〕：〔灏洋生物有成品供应〕，比重为1.077±0.001⑵台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml ,1500r/min离心15min,吸出上层液，即为4%水溶液。
用前，1.8%氯化钠溶液1倍，即为2%台盼蓝染液。
2.操作方法⑴取静脉血放入抗凝管，摇允，用Ph7.2-7.6 Hank 液稀释血液1-2倍。
⑵取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分层液〔灏洋生物产〕3-4ml,放入15X150mm试管中。
分离后分离前 水平离心血浆层 单个核细胞层 分离液层红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书：P9010/P9011200mL本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。
外周血中单个核细胞（PBMC ）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090 g/mL 左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/mL ，血小板为1.030~1.035 g/mL 。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
密度 1.077±0.001g/mL渗透压 290~350 mOsm/kg H2O无菌 0.1μm 滤膜过滤本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。
无菌开封后，保存于室温。
1. 取新鲜抗凝全血（EDTA 、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS 稀释全血。
2. 在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL 时，加入3mL 分离液；大于等于3mL ，加入等体积分离液。
但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。
（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。
如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。
）3. 室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min （血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g ）。
4. 离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。
各种动物骨髓单核细胞分离液试剂盒
规格：200ml/kit
保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。
无菌开封后，保存于室温。
试剂盒组成：
试剂A200mL
试剂D200mL
全血及组织稀释液200mL
细胞洗涤液200mL
操作步骤：
1.制备骨髓的单细胞悬液。
2.取一支无菌离心管，先加入试剂A，再加入试剂D，使两者形成梯度界面（试剂A：试剂D的体积比为3：2，如细胞悬液的体积小于5ml，则先后加入3ml试剂A和2ml试剂D；如细胞悬液的体积大于5ml，试剂总量与细胞悬液量相等），两种试剂的分层一定要清晰。
3.将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。
（可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面）
4.室温，水平转子500~800g，离心20~30min（样本的体积越大所需的离
心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需自行摸索，离心转速最大不
超过1000g）。
5.离心后将出现明显的分层：第一层为稀释液层；第二层为白色单核细
胞层；第三层为透明试剂D液层；第四层为半透明试剂A液层；第五层为红细胞层（如图示）。
6.小心吸取第二层乳白色细胞层和第三层试剂D层到另一无菌的15ml离心管中，加入10mL细胞洗涤液或PBS，颠倒混匀，250g，离心10min。
7.弃上清，5mL的细胞清洗液或PBS重悬细胞，250g，离心10min。
稀释液
单核细胞层
试剂D
试剂A
红细胞层分层示意图
8.重复步骤7
9.弃上清，细胞重悬备用。
10.差异贴壁法纯化细胞：用单核细胞培养基以106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于细胞板或细胞瓶中，置于细胞培养箱中进行贴壁培养。
1)2~4h内贴壁的为单核细胞。
2)10~24h内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
3)不贴壁的为淋巴细胞。
根据不同细胞的贴壁时间存在差异，以达到简单纯化单核细胞的目的。
此法成本低，操作简便。
如需获得高纯度的目的细胞则需选用免疫磁珠分选或者是应用流式技术分选细胞。
骨髓单细胞悬液的制备方法
小动物骨髓的采集：
1.处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。
2.取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。
3.最终制备成2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。
大动物骨髓的采集：
大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。
操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。
连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。
用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。
常用的骨髓穿刺点：
股骨：穿刺部位在股骨内侧面，靠下端的凹面处；
胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处；
肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各点的中点；
胫骨：穿刺部位是股骨内侧、靠下端的凹面处。
如果穿刺采用的是肋骨，穿刺结束后要用胶布封贴穿刺孔，防止发生气胸。
注意事项：
A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。
B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。
4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。
C.血液样本最好为新鲜的抗凝血（采血2h以内），为保持单核细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。
D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。
E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。
F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件。
G.吸取过多的单核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加；吸取过多的血浆层可能会导致单核细胞中血浆蛋白及血小板污染。
H.如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。
I.不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。
