球菌和肠道杆菌病原学检测

肠杆菌科（Enterobacteriaceae)—— 一群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，常寄居在人和动物肠道内，亦存在土壤、水和腐物中。

大多数为胞内寄生菌【共同的生物学特性】1、形态结构：中等大小（0.3-1.0）um ×（1-6）um 的革兰阴性杆菌，大多数有菌毛，多数有周鞭毛，少数有荚膜，全部不产生芽孢2、培养特性：营养要求不高，兼性厌氧或需氧，在普通培养基上可以形成直径2-3mm 的湿润、光滑、灰白色的中等大小菌落；血平板上有些可以产生溶血环；液体培养基中呈均匀混浊生长3、生化反应：触酶阳性，氧化酶阴性（和其他发酵与不发酵G-杆菌不同），志贺菌和沙门菌等致病菌不发酵乳糖4、抗原结构：①菌体O 抗原：存在于细胞壁LPS 的最外层，属特异性。

耐热。

细菌若失去，菌体则出现S-R 变异。

IgM②鞭毛H 抗原：存在于鞭毛蛋白，不耐热。

IgG 。

志贺菌属没有鞭毛H 抗原 ③荚膜抗原：存在于O 抗原的外围多糖，能阻止O 抗原凝集现象，不耐热 5、抵抗力：无芽孢，抵抗力弱（60℃30min 杀死，易被一般化学消毒剂杀灭）6、变异：自发或者经噬菌体、质粒、转座子和毒力岛的介导变异，常见耐药性变异【大肠埃希菌】 1、生物学性状 特征 简述备注形态结构 G-，有周鞭毛，菌毛，无芽孢1、IMViC 试验：吲哚、甲基红、VP 、枸橼酸盐2、O111:K58:H23、可产生大肠杆菌素（colicin)4、易产生耐药性（R 质粒） 培养特性营养要求：不高，普通琼脂平板，兼性厌氧温度：37℃培养结果：普通：24h 后形成2-3mm 的圆形、凸起、灰白色S 菌落生化反应 生化反应活泼：发酵葡萄糖并产酸产气、大多数可发酵乳糖 IMViC 试验：++--抗原O 抗原、K 抗原、H 抗原（O:K:H)抵抗力无芽孢，抵抗力弱（60℃30min杀死，易被一般化学消毒剂杀灭）2、致病物质致病类型致病物质简述侵袭力粘附素使细菌紧密粘着在泌尿道和肠道上，避免排尿和肠道蠕动而被排出特异性高：定植因子CFA/Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；集聚粘附菌毛AAF/Ⅰ、Ⅲ；P菌毛；Dr菌毛等荚膜+侵袭性物质侵袭质粒抗原蛋白、载铁蛋白和Ⅲ型分泌系统毒素内毒素革兰阴性菌均会产生内毒素外毒素志贺菌毒素Ⅰ和Ⅱ（Stx-1/2)、耐热肠毒素a/b(STa/b)、不耐热肠毒素Ⅰ/Ⅱ（LT-Ⅰ/Ⅱ）、溶血素A（HlyA)3、所致疾病①肠道外感染（除新生儿脑膜炎之外，均为内源性感染）Ⅰ、败血症：大肠埃希菌是从败血症患者中分离到的最常见的G-菌（45%），如肠穿孔导致的伴有败血症的腹腔内感染，死亡率很高Ⅱ、新生儿脑膜炎：<1岁婴儿Ⅲ、泌尿道感染：来源于结肠，为上行性感染，女性感染率高于男性，尿道致病性大肠埃希菌（P菌毛、AAF/Ⅰ、AAF/Ⅱ、Dr菌毛和溶血素HlyA）②胃肠炎：外源性感染4、微生物学检查①标本采集：肠道外感染采取中段尿、血液、脓液、脑脊液等；胃肠道感染采集粪便②分离培养与鉴定6、防治原则【志贺菌属】Shigella 痢疾杆菌1、生物学性状特征简述备注形态结构G-，无鞭毛，无荚膜，无芽孢，有菌毛，通常有0-5个质粒1、我国细菌性痢疾的优势流行株为福氏志贺菌2a型301株2、痢疾志贺菌（A群）发酵甘露醇3、宋内志贺菌（D群）具有鸟氨酸脱羧酶活性4、常引起水源或食物型的暴发流行5、多重耐药性（磺胺和抗生素的使用）培养特性营养要求：不高，普通琼脂平板温度：37℃培养结果：普通：24h后形成直径为2mm的半透明的S菌落（宋内志贺菌为扁平的R型）生化反应生化反应活泼：发酵葡萄糖，产酸不产气；除宋内志贺菌个别菌株迟缓发酵乳糖外，均不发酵乳糖；硫化氢阴性；动力阴性抗原O抗原、K抗原（O:K)O抗原是分类依据，分为4群和40余血清型（包括亚型）抵抗力比其他肠道杆菌弱，加热60℃10min可杀死，对酸和一般消毒剂敏感5、大肠菌群数：卫生细菌学以其作为饮水、食品等粪便污染的指标之一。

病原微生物的检验项目及结果解释病原微生物的检验项目及结果解释微生物检查包括：细菌、真菌、衣原体、支原体及病毒等。

这对于查明致病原因和选择用药十分重要。

但除细菌和真菌外，直接查找方法比较复杂。

细菌培养，采集血、痰、咽试子、大便、小便、创面分泌物等标本进行培养，看有无致病菌生长，正常应为阴性或少量非致病菌；真菌检查，标本涂片或培养，检出真菌为不正常。

病原微生物的检验主要是检测与l临床患者致病性有关的病原性微生物，对感染性疾病进行快速、准确地诊断，密切结合临床提出及时有效的治疗方案，防止微生物产生耐药性和医院内感染的发生。

基础知识1.什么是微生物?什么是病原微生物?微生物是需借助光学显微镜或电-y：显微镜放大观察到的结构简单，个体微小的生物的总称。

微生物的种类很多，医学微生物尤其是临床微生物主要有细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等。

微生物在自然界中广泛存在，与人类和自然界其他生物共生共存，绝大多数对人类和自然界是有益的，只有少部分可以引起人类和动植物发生疾病，这部分微生物才称为病原微生物，比如结核分枝杆菌可引起结核病，痢疾杆菌可以引起痢疾等。

2.什么是细菌?细菌分哪几种?细菌是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。

其体积微小，以微米作为测量单位，无色半透明，只有经过染色才能观察到细菌的轮廓及其结构。

经革兰染色，可将细菌分为两大类，即革兰阳性菌和革兰阴性菌。

细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成，有的细菌还有夹膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。

根据形状则可分为三类，即：球菌、杆菌和螺旋菌(包括弧形菌)。

3.什么是病毒?病毒分哪几种?病毒是结构最简单、体积最微小(纳米)的一类非细胞型微生物，介于生命和非生命之间的一种物质形式，其必须严格寄生在活细胞内，含有单一种核酸即脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的基因组和蛋白质外壳，没有细胞结构，对抗生素不敏感，但对于干扰素敏感。

《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。

因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。

1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。

病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。

对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。

2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。

若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。

3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。

另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。

4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。

如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。

【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。

当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。

细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。

一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。

穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。

2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。

伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。

3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。

二、链球菌属（一）概念链球菌属为触酶阴性，兼性厌氧，呈圆形或卵圆形的革兰阳性球菌，在液体培养基中生长时易形成长链而表现为沉淀生长（但肺炎链球菌为混浊生长）。

（二）生物学特性1.形态与染色：革兰染色阳性。

菌体呈圆形，直径为0.8～1.0μm，呈链状排列，在液体培养基中易成长链。

在脓汁标本中为短链，成双或单个散在。

无鞭毛、无芽胞、某些菌株在血清肉汤中可有荚膜。

2.培养特性：本属细菌大多为需氧或兼性厌氧菌，少数微需氧及专性厌氧。

营养要求较高，在含有腹水的培养基上生长良好。

最适温度为35℃～37℃，最适pH为7.4～7.6，在5%C02环境下生长更好。

在血琼脂平板上，经35℃ 18～24h培养后可形成灰白色、圆形、凸起、直径为0.1～0.75mm细小菌落，菌落周围出现不同溶血环。

3.生化反应：本属细菌触酶试验阴性（与葡萄球菌属鉴别）4.分类（1）根据溶血能力分类：利用链球菌在血平板上溶血情况分为三类，1）甲型（α）溶血性链球菌：又称草绿色链球菌。

本菌为条件致病菌。

2）乙型（β）溶血性链球菌：通称溶血性链球菌，透明溶血环。

该型细菌致病性最强，常引起人和动物多种疾病。

3）丙型（γ）链球菌：无溶血环。

一般无致病性。

（2）根据链球菌细胞壁抗原（即C抗原）分类：即常用Lancefield血清分型法，将链球菌分为A、B、C、D……T等18个群（其中Ｉ和J缺），对人类有致病性的90%属A群，B、C、D、G群链球菌感染较少见。

5.对理化因素的抵抗力：不强。

（三）致病性A群链球菌：草绿色链球菌：属条件致病菌，常与亚急性心内膜炎相关。

B群链球菌：是新生儿肺炎、脑膜炎和败血症的病原体。

D群链球菌：引起呼吸道和泌尿道感染。

治疗原则：A群链球菌感染，青霉素G被列为首选。

B群链球菌常采用青霉素G和一种氨基糖苷类合用。

（四）微生物学检验方法与原理1.标本采集：不同疾病采集不同标本。

2.检验方法及鉴定（1）直接镜检：革兰染色，镜检。

如符合链球菌的形态特征可初报。

肠道致病菌，常选3种检测法⊙上海嘉定区疾病预防控制中心 陈培超肠道致病菌是指排除大肠正常菌群，能够致病的菌种，其具有严重危害性，通常会引发感染性腹泻、痢疾等肠道传染病，或者可以借助水体、食物等的传播，引发流行性疾病，也可能污染人类食物造成食物中毒，甚至会威胁人们生命健康安全。

因此，全面了解和掌握肠道致病菌的各种类型很有必要。

沙门氏菌沙门氏菌是常见的主要食源性致病菌之一，感染沙门氏菌会引起肠炎和败血症，导致急性腹泻、腹痛、发烧和呕吐等症状。

其污染途径非常广泛，在畜禽肉、蛋类、蔬菜及水果中都有存在，其中畜禽产品中的沙门氏菌是人们感染该菌的主要来源。

沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可分为菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面（Vi）抗原3种。

以不同菌体抗原结构为依据，可将其分为A、B、C、D、E、F、G、H、I等血清群，再以不同的鞭毛抗原为依据，分为各种血清型。

现阶段，已知沙门氏菌的血清类型达到两千多种，我国拥有的血清类型为322个，与人相关联的血清型属于A-E 中，其中只有少数几种类型可以导致人患病，常见的有鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等。

志贺氏菌志贺氏菌又称为痢疾杆菌，是人类细菌性痢疾的病原菌，在人与人之间可以广泛的传染。

志贺氏菌属于革兰氏染色阴性杆菌，一般分为4类，分别是痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌以及宋内志贺菌等。

志贺氏菌感染非常常见，潜伏期一般是7天以内，出现的症状主要是发热、腹痛、腹泻、里急后重以及黏液脓血便等。

临床中一旦出现志贺氏菌阳性，应该立即应用相关的抗生素进行对症处置。

大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌属于埃希菌，主要特点是肠毒素和侵袭力，可以导致婴儿腹泻，严重者甚至会发生死亡。

我国食物中毒事件中细菌性食物中毒的人数占据很大比例，约为42.8%，其中主要是由致泻性大肠埃希氏菌导致，在我国引发感染性腹泻的发病率中位居所有传染病首位。

国际上将其分为5种类型，分别是肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC）、致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、黏附性大肠埃希氏菌（EAEC）。

病原性球菌及检验病原性球菌及检验（一）●考点葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、奈瑟菌属﹥生物学性状﹥微生物学检查法﹥临床意义（致病性、所致疾病）[讲义编号NODE70103300130100000101：针对本讲义提问]【内容讲解】[讲义编号NODE70103300130100000102：针对本讲义提问]普及共性，单记个性生物学性状﹥形态与结构：革兰染色性，菌体形态，大小，排列状态，特殊结构。

﹥培养特性：对气体需求，营养要求，最适pH值，最适温度，在培养基中的生长现象。

﹥生化反应：特殊生化。

﹥抗原：﹥分类：[讲义编号NODE70103300130100000103：针对本讲义提问]致病性﹥致病物质﹥所致疾病微生物学检查：针对生物学性状和致病性。

[讲义编号NODE70103300130100000104：针对本讲义提问]一、葡萄球菌属一群革兰阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状而得名。

（一）生物学特性1.形态与结构G+，球形，0.5～1.5μm，呈葡萄串状成堆排列（在脓汁、肉浸液培养物中，可见单个，成对或短链排列），无鞭毛和芽胞[讲义编号NODE70103300130100000105：针对本讲义提问]2.培养特性需氧或兼性厌氧，营养要求不高，最适pH为7.4，最适温度为35～37℃。

普皿：圆形、凸起、表面光滑湿润、边缘整齐并且不透明的菌落，直径为2～3mm。

可产生不同的脂溶性色素，如金黄色、白血琼脂平板：几乎所有的葡萄球菌可产生α、β、γ和δ溶血素。

液体培养基：生长迅速呈均匀混浊状。

3.生化反应触酶试验（+）；多数能分解葡萄糖、麦芽糖及蔗糖，产酸不产气；分解甘露醇产酸、液化明胶和产生血浆凝固酶（多数致[讲义编号NODE70103300130100000106：针对本讲义提问]4.抗原（1）蛋白抗原：为完全抗原，有种属特异性，无型特异性。

存在于葡萄球菌的表面，结合在细胞壁的粘肽部分，具有抗吞（2）多糖抗原：是半抗原，具有型特异性，有三种：①A型多糖抗原；②B型多糖抗原；③C型多糖抗原。

一、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽抱杆菌（枯草、地衣）。

5种有害菌：大肠杆菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。

4种二、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。

5种需氧菌：芽抱杆菌。

1种兼性厌氧菌：大肠杆菌，沙门氏菌。

2种注：空肠弯曲杆菌：微需氧菌,在含2.5-5%氧和10%C02的环境中生长最好。

最适温度为37〜42C。

在正常大气或无氧环境中均不能生长。

肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占比例较少。

三、一般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。

需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。

四、无氧环境的简易操作：1、方法来自文献《健康羊驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》采用干燥器培养空间用焦性没食子酸Wg、10%氢氧化钠溶液100mL,按比例取10%的氢氧化钠液置于干燥器皿底部，然后放置2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸美蓝指示剂一管。

盖上缸盖并用石蜡封闭。

再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。

置于温箱37c培养24 — 48h观察结果。

2、方法来自文献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》后者先拧紧瓶盖，放入密封性较好的玻璃罐（用凡士林封口），通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。

五、CO 2培养箱不可代替无氧培养箱厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生物都是厌氧微生物；而二氧化碳培养箱里面是5%二氧化碳+95%空气，里面是有一部分氧气的。

一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中02的浓度必须小于WOOPpm （千分之一），更严格的环境是小于300Ppm （万分之三），本实验室C02培养箱C02浓度范围为280-2000ppm,所以CO2培养箱是不能用来培养严格厌氧菌。