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3500/3500XL简易操作手册1.空间定位和光谱校正1.1设置DyeSet进入library界面，选择DyeSets菜单，点击Create，在DyeSetName中输入“AGCU_E5”作为我公司DyeSet名称，从Chemistry下拉菜单中选择“MatrixStandard”，从DyeSetTemplate下拉菜单中选择“E5Template”，设置完成后点击Save保存设置。
1.21.2孔反一个载96试并自2.2.1创建。
按下图所示选择或设置各个参数，设置完成后点击Save保存。
注意将ProtocolName命名为“AGCU_E5_STR”，进样电压设置为3kv，进样时间可设置为6～10sec，DyeSet选择1.1步骤中已设置好的“AGCU_E5”，其他参数设置请参照下图。
2.2创建SizeStandard进入library界面，选择SizeStandards菜单，点击Create。
在SizeStandard 中输入“AGCU_SIZ500”，DyeColor下拉菜单中选择“Orange”，在左侧对话框中依次输入75、100、139、150、160、200、300、340、350、400、450、490、500，每次输入结束后点击中间“AddSize”菜单即可将所输数字加入右侧对话框中。
待全部输入结束后点击Save保存。
2.3创建QCProtocol进入library界面，选择QCProtocols菜单，点击Create。
在ProtocolName 中输入“AGCU_QC”，SizeStandard下拉菜单中选择在2.2中已创建的“AGCU_SIZ500”，将UseBaselining改为38。
其他参数均按下图所示进行设置，设置完成后点击Save保存。
2.4创建Assay进入library界面，选择Assays菜单，点击Create。
在AssayName中输入“AGCU_STR”，ApplicationType下拉菜单中选择“HID”，InstrumentProtocol下拉菜单中选择2.1中创建的“AGCU_E5_STR”，QCProtocol下拉菜单中选择2.3中创建的“AGCU_QC”。
3500基因测序仪操作流程一、启动仪器1．按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。
2．打开与仪器连接的计算机，点击Ctrl+Alt+Delete界面，点击Administrator，输入密码：Administrator。
等待Daemon（隐藏图标），Server Monitor程序完全启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。
3．打开3500 Data Collection 软件，出现3500 Log In 登录界面，输入用户名和密码，本机用户名为：Administrator，密码为：Administrator1，点击“OK”，打开软件。
检查所有耗材的剩余用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护提示灯信息。
4. 确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至室温。
注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP 胶在仪器上存放一周后需置于2-8℃保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。
5. 将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh，确认所有耗材均为有效状态。
二、仪器维护1. 于软件主界面点击Dashbord，于菜单栏中选择Maintenance Wizards选项。
2. 将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择WASH pumper chamber and chanels选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给毛细管灌胶直至完成全部操作。
3. 从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。
结果应满足如下要求：①峰高大致相同（大于6000）；②峰型尖锐，左右堆成；③橙色十字在峰顶端；④峰间距为13-16。
当结果满足要求时，选择“Accept Results”，否则，选择“Reject Results”，重新进行空间定位。
4. 从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。
基因测序仪器使用说明书一、前言基因测序仪器是一种用于测定DNA或RNA序列的设备，它在生物科学研究、医学诊断等领域具有重要应用价值。
本使用说明书将详细介绍基因测序仪器的组成、使用方法以及注意事项，以帮助用户正确、安全地操作仪器，获得准确的测序结果。
二、仪器组成1. 主机：基因测序仪器的主要组成部分，包括光学系统、电子系统、激光系统等。
2. 数据分析软件：用于对测序结果进行分析和解读的计算机软件。
3. 数据存储设备：用于存储测序原始数据和分析结果的设备，如硬盘、U盘等。
三、操作步骤1. 准备工作a. 确保基因测序仪器处于水平放置的稳定表面上，有足够的工作空间和通风条件。
b. 检查仪器的供电情况，确保电源线连接牢固且通电正常。
c. 检查仪器内部的耗材和试剂，确保有足够的库存，并检查其有效期。
2. 样本处理a. 根据实验设计，准备待测样本。
b. 提取DNA或RNA，并进行纯化和浓缩处理。
c. 根据实验要求，进行必要的片段扩增、连接和修复。
3. 测序准备a. 根据测序类型选择合适的芯片或测序流程。
b. 准备所需的引物和试剂，并按照说明书中的要求进行稀释和配置。
c. 将样本与引物和试剂按照比例混合，并尽快投入仪器进行测序。
4. 仪器操作a. 打开仪器主机电源，待仪器启动完成后，进入操作界面。
b. 将样本混合液注入仪器芯片中，并按照仪器界面指引进行操作。
c. 在测序过程中，注意仪器显示的实时数据，并根据需要调整相关参数。
5. 数据分析与结果解读a. 测序完成后，将测序结果数据导出到计算机上。
b. 打开数据分析软件，导入测序结果数据。
c. 根据实验目的，选择相应的分析方法，对数据进行处理和解读。
d. 结果解读时，结合实验设计和相关文献，对数据进行合理的解释。
四、注意事项1. 安全操作：在操作过程中，务必佩戴手套和口罩，避免接触样本和试剂。
2. 仪器维护：定期检查仪器的光学系统和电子系统，保持清洁，并按照维护手册进行维护和保养。
快速参考手册3500/3500xL Sequencing Standards, BigDye™ Terminator v3.1简要操作说明货号：4404312适用仪器：SeqStudio™和 3500/3500xL 仪器产品简介：Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit包含了一段已知序列的DNA片段，用于开展SeqStudio™和 3500/3500xL 仪器上的光谱校正/安装性能测试和运行对照。
试剂中所含的DNA已被冻干，以保持最佳的稳定性。
产品组分和存储:一．准备用于光谱校正的测序标准品1. 瞬时离心测序标准品管，将所有组分离心至管底。
2. 加入300μL Hi-Di（货号4311320），将步骤1中测序标准品重悬。
3. 高速涡旋1分钟，然后瞬时离心。
4. 盖上盖子，将离心管在95°C下加热2分钟，使DNA片段变性，然后立即置于冰上。
5. 取10μL变性的标准品分装至96孔反应板各孔中：•对于4道毛细管仪器：使用孔A1-D1；•对于8道毛细管仪器：使用孔A1-H1；•对于24道毛细管仪器：使用孔A1-H3。
6. 将96孔板进行离心，确保所有标准品离心至管底并且无气泡。
7.使用96孔胶垫（Septa）覆盖反应板。
更多信息，请参阅仪器的英文版用户指南或快速参考手册。
二、准备用于测序的测序标准品1. 瞬时离心测序标准品管，将所有组分离心至管底。
2. 加入300μL Hi-Di（货号4311320），将步骤1中测序标准品重悬。
3. 高速涡旋1分钟，然后瞬时离心。
4. 盖上盖子，将离心管在95°C下加热2分钟，使DNA片段变性，然后立即置于冰上。
5. 取10μL变性的标准品分装至96孔反应板各孔中：•对于4道毛细管仪器：使用孔A1-D1;•对于8道毛细管仪器：使用孔A1-H1;•对于24道毛细管仪器：使用孔A1-H3。
基因测序技术的使用教程基因测序技术是一项重要的生物学工具，它可以帮助我们了解生命的奥秘。
本文将介绍基因测序技术的使用教程，包括前期准备、实验步骤和数据分析等方面，希望能为读者提供一些有用的信息。
一、前期准备在进行基因测序之前，我们需要准备一些实验材料和设备。
首先，我们需要提取待测序的DNA样本，可以从人体组织、细胞培养物或其他生物体中获得。
其次，我们需要准备一台高通量测序仪，例如Illumina HiSeq或PacBio Sequel等。
此外，还需要一些实验耗材，如试剂盒、试管、离心管等。
在准备实验材料和设备的过程中，我们需要注意实验室的安全和卫生。
二、实验步骤1. DNA样本制备：将提取的DNA样本进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量进行测序。
这一步通常使用PCR技术，可以选择特定的引物扩增目标DNA片段。
2. 文库构建：将扩增得到的DNA片段连接到测序文库中。
文库是一系列DNA片段的集合，它们将在测序过程中被读取和分析。
在文库构建过程中，我们需要选择适当的文库构建方法，如Illumina TruSeq或NEBNext Ultra II等。
3. 测序反应：将文库装载到测序仪中，进行测序反应。
不同的测序仪使用不同的测序技术，例如Illumina测序仪使用桥式扩增和碱基荧光标记技术，而PacBio测序仪则使用单分子实时测序技术。
4. 数据生成：测序仪将读取文库中的DNA片段，并将其转化为数字化的测序数据。
这些数据将被存储为FASTQ文件格式，包含了每个DNA片段的序列信息和质量值。
三、数据分析1. 数据预处理：在进行数据分析之前，我们需要对测序数据进行预处理。
这包括去除低质量的序列、去除适配序列和进行序列比对等步骤。
常用的数据预处理工具包括Trimmomatic、Cutadapt和BWA等。
2. 序列比对：将测序数据与参考基因组进行比对，以确定每个DNA片段的来源。
常用的比对工具有Bowtie、BWA和STAR等。
文3500 简捷操作指南No/ Name预设值名称/ Study测量类型1 Abdomen 腹部Basic常规测量2 Kidney 肾脏Kidney常规测量3 OBST 产科Basic常规测量4 Fetal Heart 胎儿心脏Basic常规测量5 GYN 妇科GYN妇科测量6 Small Part 小器官Basic常规测量7 Breast 乳腺Basic常规测量8 Carotid 动脉Carotid Artery动脉9 Vein 静脉Lower EXT Veins下肢静脉注：各医院预设值顺序可能有所不同，以上仅提供中英文对照。
开始新患者检查1. 按下PRESET ,选择检查条件，仪器自动切换到对应探头。
如果设置了快捷键，可以直接按F1-F9进入对应的检查2. 按下New Patient 键，然后在病人信息栏中输入患者标识符、患者姓名、出生日期等数据(该操作是为了存储患者图像，如果不需要存储图像可以省略该2，3步骤)。
3. 轨迹球选择右下角OK 菜单,按SET 确认键,进入实时检查状态；（ 或按一次键盘左下角的ID 键也可以进入检查状态。
）屏幕显示信息：注释：1．按COMMENT ,屏幕出现一个光标，移动光标到需要注释的区域； 2．直接按注释字符，如LV , LIVER 等，如要大写，按一下CAPSLOCK (位于A 键的左边)，上面指示灯亮，此时输入字母都是大写。
重复按一次CAPSLOCK 又转为小写状态。
3． 要删除某个字母可以将光标移动到某个字母的后面，再按键（位于第二排键盘右边），则向前逐个字母消除。
体表标志探头方向焦点个数及聚焦区域对比度指视符号仍然在屏幕，可以继续注释；一旦按下解冻键，则自动退出注释状态。
如何快速获得频谱：在彩色多普勒模式，按 键，出现取样线和取样容积，将取样容积放置在血管中心，再按 键即获得频谱，如果需要重新取样，按 键返回到彩色和二维实时状态，再按 键获得频谱。
3500基因测序仪操作流程一、启动仪器1．按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。
2．打开与仪器连接的计算机，点击Ctrl+Alt+Delete界面，点击Administrator，输入密码：Administrator。
等待Daemon（隐藏图标），Server Monitor程序完全启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。
3．打开3500 Data Collection 软件，出现3500 Log In 登录界面，输入用户名和密码，本机用户名为：Administrator，密码为：Administrator1，点击“OK”，打开软件。
检查所有耗材的剩余用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护提示灯信息。
4. 确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至室温。
注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP 胶在仪器上存放一周后需置于2-8℃保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。
5. 将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh，确认所有耗材均为有效状态。
二、仪器维护1. 于软件主界面点击Dashbord，于菜单栏中选择Maintenance Wizards选项。
2. 将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择WASH pumper chamber and chanels选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给毛细管灌胶直至完成全部操作。
3. 从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。
结果应满足如下要求：①峰高大致相同（大于6000）；②峰型尖锐，左右堆成；③橙色十字在峰顶端；④峰间距为13-16。
当结果满足要求时，选择“Accept Results”，否则，选择“Reject Results”，重新进行空间定位。
4. 从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。
3500/3500XL简易操作手册1. 空间定位和光谱校正1.1 设置Dye Set进入library界面，选择Dye Sets菜单，点击Create，在Dye Set Name中输入“AGCU_E5”作为我公司Dye Set名称，从Chemistry 下拉菜单中选择“Matrix Standard”，从Dye Set Template下拉菜单中选择“E5 Template”，设置完成后点击Save保存设置。
1.2 空间定位进入3500 Data Collection Software主界面，选择Maintenance 菜单，在Maintenance界面中点击Calibrate下拉菜单中的Spatial按钮，选择合适的空间定位参数即可开始空间定位。
3500系列遗传分析仪空间定位与3100、3130系列类似。
1.2 光谱校正 a、光谱校正前先更换水和阴阳极Buffer，按10ul甲酰胺：0.5ul 5 Dye Matrix Standard的比例配制甲酰胺和光谱校正标准品混合物，轻轻震荡混匀后短暂离心。
准备一块新的96孔反应板，将配制好的混合物均匀的分装在前三列各孔中。
3500/3500xL进行光谱校正时仪器默认第一个Run，即前三列中加入了光谱校正混合物。
95℃加热3 min ，立即冰浴3 min，变性完成后装载96孔板并置于仪器托盘中。
b、点击Calibrate下拉菜单中的Spectral按钮，按照图示选择各种参数点击Start Run即可进行光谱校正。
注意在Dye Set中应选则在1.1中设置好的与AGCU试剂盒相匹配的Dye Ste。
如果光谱校正未达到仪器默认质量要求，仪器会自动重复跑样三次，并自动选择各次跑样中质量最好的通道作为此次光谱校正的最后结果。
光谱校正时应观察实时原始数据，以便及时做出相应调整，确保最终结果。
C、3500系列遗传分析仪与3100、3130系列遗传分析仪最大的区别之一就是光谱校正。
测序仪的原理与使用流程1. 测序仪的原理测序仪是一种用于测定DNA或RNA序列的设备。
它通过一系列复杂的化学反应和光学信号读取来确定碱基的顺序。
下面是测序仪的工作原理：1.DNA扩增：测序前需要将待测序列进行扩增，常用的方法有PCR（聚合酶链式反应）和文库构建法。
2.定向测序：定向测序是指选择一个起始点，由这个点开始一次测定一个较短的DNA片段的序列。
这个过程可以重复多次，最后通过合并这些片段得到完整的序列。
3.测序方法：目前常用的测序方法有Sanger测序、Illumina测序、IonTorrent测序和PacBio测序等。
4.Sanger测序: Sanger测序是使用荧光标记的二进制链终止法来测定DNA的序列。
通过添加不同颜色的荧光标记的碱基到扩增DNA链上，根据读取到的信号来确定每个碱基的顺序。
5.Illumina测序: Illumina测序利用逆转录和PCR扩增的方法将DNA片段固定在透明的流动单元上，然后将测序引物加入测序反应体系中。
在逐步加入不同的荧光标记的碱基时，通过扫描来记录每个碱基的信号。
6.Ion Torrent测序: Ion Torrent测序是通过检测DNA链合成过程中释放的氢离子来确定碱基的顺序。
这个方法通过观察每个碱基加入时的氢离子释放情况，来记录DNA的序列。
7.PacBio测序: PacBio测序是一种实时测序方法，通过观察聚合酶合成DNA链时释放出的荧光信号来确定碱基的顺序。
2. 测序仪的使用流程以下是测序仪的一般使用流程：步骤一：样品准备1.DNA或RNA提取：将待测序的样品进行DNA或RNA的提取和纯化。
2.DNA/RNA浓度和质量检测：使用分光光度计或荧光测量仪检测提取的DNA或RNA的浓度和质量。
(不需要出现网址)3.文库构建：根据测序需求，对提取的DNA或RNA样品进行文库构建，包括DNA片段的修剪、链接、可能的文库扩增，生成适合测序的DNA样品。
步骤二：测序前的准备1.芯片/流单元准备：根据测序平台的要求，准备好芯片或流动单元。
3500基因测序仪操作流程
一、启动仪器
1．按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。
2．打开与仪器连接的计算机，点击Ctrl+Alt+Delete界面，点击Administrator，输入密码：Administrator。
等待Daemon（隐藏图标），Server Monitor程序完全启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。
3．打开3500 Data Collection 软件，出现3500 Log In 登录界面，输入用户名和密码，本机用户名为：Administrator，密码为：Administrator1，点击“OK”，打开软件。
检查所有耗材的剩余用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护提示灯信息。
4. 确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至室温。
注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP 胶在仪器上存放一周后需置于2-8℃保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。
5. 将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh，确认所有耗材均为有效状态。
二、仪器维护
1. 于软件主界面点击Dashbord，于菜单栏中选择Maintenance Wizards选项。
2. 将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择WASH pumper chamber and chanels选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给毛细管灌胶直至完成全部操作。
3. 从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。
结果应满足如
下要求：①峰高大致相同（大于6000）；②峰型尖锐，左右堆成；③橙色十字在峰顶端；④峰间距为13-16。
当结果满足要求时，选择“Accept Results”，否则，选择“Reject Results”，重新进行空间定位。
4. 从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。
本仪器为8道毛细管，光谱校准品加样的位置为A1-H1，校准结果允许借用周边1道毛细管的结果；光谱校准通过显示绿色，借用信息为黄色箭头，失败为红色。
校准成功选择“Accept”，否则，选择“Reject”，重新进行光谱校准。
三、检测运行
1. 测序PCR（以BigDye Terminator v3.1试剂盒为例），标准质粒和样品推荐测序反应体系及反应条件如下：
标准质粒测序反应体系：引物4 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水10.5 μL，模板1 μL。
样品测序反应体系：引物（10 μM）0.5 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水14 μL，模板1 μL。
测序反应条件为：96 ℃ 1 min →(96 ℃10 sec →50 ℃ 5 sec →60 ℃4 min)×25个循环→4 ℃保温
2. 测序产物纯化（以CENTRI-SEP spin-columns纯化柱为例介绍）
①于纯化柱中加入800 μL的无RNase超纯水，颠倒混匀，室温静置30 min。
②上下颠倒除尽气泡，去掉纯化柱底部的盖子，置于2 mL洗脱管中，在将纯化柱上部的盖子打开后，盖上盖子，压入空气，柱中的液体自动流入洗脱管中直至自行终止，最后洗脱管中的液体大约为200-250 μL，弃掉滤液。
③750×g离心2 min去除多余液体，离心完毕后洗脱管中约有300 μL液体。
④将纯化柱转移至1.5 mL的样品收集管中，从柱的斜面上缓缓加入20 μL的PCR测序产物。
⑤ 750×g离心2 min，取滤液备用，静止重复离心。
3. 测序产物加样
①于待检测孔中加入10 μL的Hi-Di甲酰胺后，再次加入10 μL纯化后测序产物，混匀，尽量避免气泡产生，不加样的空中加入10 μL的超纯水。
②于96孔板上安装胶垫，按照顺序组装到自动进样器上。
4. 数据收集软件运行
①点击Start pre-heat预热30 min，POP7和POP4的胶预热到60 ℃，POP6的胶预热到50 ℃，预热后检查detection cell的温度。
②通过Main workflow键进入Set up视窗，选择Define Plate Properties界面建立新的样品反应板，在Name栏输入样品板的名称，板子类型：96孔板，毛细管长度：50 cm，胶以及测序类型根据需要选定。
③输入样本名称，选择相应的Assays，File Name Conventions，Results Groups。
④切换到Load Plates for Run视图，从Recent Plates找到要电泳的反应板，点
击Link Plate（灰色表示反应板连接上，黑色则表示没有连接上），点击Start Run 进行电泳。
⑤切换到Monitor Run 视图，通过Assay，Sample，EPT界面查看样品的电泳
情况；通过Flags Found 界面借助软件可直接判断样品的结果是否满足质量要求，红色旗帜表示不满足质量要求，绿色旗帜表示满足质量要求。
⑥进入Review Results视窗，点击View Fragment/HID Results 查看样品的电泳
结果。
如Offscale（峰过高，导致渗透峰产生），Board Peak（宽峰）等要素的图
标为绿色方块，Sizing Quality（内标的质量）为带对号的绿色方块，则表示满足质量要求；如Offscale，Board Peak 的图标为黄色三角形，Sizing Quality为带
X的红色方块，则表示不满足质量要求，可以通过Plot View和Sizing Table View 等界面分别查看样品的电泳图谱和内标的情况。
5. 测序结果分析
①点击sequence analysis V5.4软件，输入用户名DangDongCIQ，输入密码123456，打开软件。
②点击File，选择Add sample，选择所需分析测序文件。
③点击绿色三角形图标进行测序结果分析。
测序峰图的荧光信号强度正常范围为1000-3000，且峰间距明显，测序结果质量分数较高，可视为本次测序基本成功。
6. 常见问题及解决措施
（1）信号值太高
①样品浓度过高，应稀释样本浓度，降低进样时间。
②反应体系中DNA加入过量。
（2）无信号值
①测序反应失败。
②毛细管堵塞，重新灌胶。
③毛细管阵列弯曲，应重新更换毛细管阵列。
④毛细管破裂或损坏
（3）低信号值
①甲酰胺降解，更换新的Hi-Di甲酰胺。
②样本量不足，增加DNA的量。
③样本中盐浓度过高，采用蒸馏水或去离子水对样本进行稀释或采用去盐的纯化柱继续样本纯化。
④测序样本未充分混匀。
⑤DNA扩增效率低，重新扩增DNA或检查DNA质量。
⑥自动进样器超出校准范围。
检查样本体积，如果信号任然很低，联系ABI技术顾问。
（4）过高的基线
①管路中的胶可能存在污染，可采用conditional reagent清洗胶泵。
②胶中可能存在污染或晶体沉淀，将胶恢复至室温使用，如果胶已过期可更换新胶使用。
③弱的光谱校准，重新进行光谱校准。
（5）分辨率低
①进样量过多。
②低质量的水。
③POP胶已降解。
④毛细管阵列的进样次数超过160次。
⑤降解的甲酰胺。
⑥样品中盐浓度过高。
7. 关闭仪器
先将数据收集软件和
测序软件等程序关闭后，关闭仪器的电源，随
后关闭计算机。
