固定化细胞技术

固定化技术及其应用摘要固定化细胞技术是酶工程的核心技术之一，它将酶工程提高到一个新水平。

该技术简化了工业分离纯化的步骤，并使酶反应的连续生产成为现实。

目前，该技术已经广泛应用于食品、发酵、三废处理等行业，经济效益显著。

首先分析了固定化细胞的优缺点，介绍了近年来在食品、发酵和三废处理行业的应用，最后对其应用进行了展望。

关键词固定化酶；食品；发酵；三废处理；应用引言固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。

是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。

【1】固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。

最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点【2】。

固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景。

在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化成本，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键。

固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径, 相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯、对贴壁型和非贴壁型细胞【3】都适用的优点, 因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。

本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。

酶作为一种蛋白质，其催化活性与空间结构密切相关，在大多数情况下固相酶的催化活性较低，以固定化氨基酰化酶为例，选择比较好的载体材料和固定化方法，其活性一般也仅为游离酶的50％～60％。

固定化技术应用－酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。

选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。

也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。

问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。

将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。

酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。

经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。

2.固定化酶技术的发展以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。

1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。

科学家们就开始了同定化酶的研究工作。

1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。

我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。

当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。

邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。

Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。

酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术，在制药、化工、食品等领域广泛应用。

酶是一种天然催化剂，在一系列生化反应中起到了至关重要的作用。

然而，酶在传统的反应过程中通常难以重复利用，并且容易受到环境因素的影响导致其活性降低。

为了克服这些困难，研究人员发明了酶固定化技术，即将酶固定在固体基质上，从而提高其稳定性和功效。

使用固定化酶，可以在更广泛的工业应用场景中实现更高效、经济的生物转化过程。

固定化技术不仅可以应用于酶，还可以用于固定化细胞。

细胞固定化是将细胞固定在一种固定化基质上，以便在化工过程中重复使用。

固定化细胞繁殖能力更强，可稳定持续的提供所需生产物。

比如，用固定化酵母发酵葡萄汁制成果酒或啤酒。

固定化技术的实现方式有很多种，例如物理吸附、共价键结合、交联等。

其中最常见的方法是交联法，通过交联剂，如谷氨酸或戊二醛，将酶或细胞固定在载体上。

经过固定处理后，酶或细胞的增稳特性明显增强，同时也具有更广泛的适应性。

在化学反应中，固定化酶可用于一系列生产过程，包括生成和破坏多种化学键以及催化合成。

这种方法还可以改善化学反应的选择性和增加产物的纯度。

总之，酶及细胞固定化技术已成为现代生物工程的重要组成部分，它为生产高品质、低成本的化学品、食品、医药品以及可再生能源等提供了新的可能性。

由于固定化技术的成熟和发展，它在未来的研究和应用中将会得到越来越广泛的应用。

张 海 龙山东教育学院 生物系Shan Dong Institute of Education第九章　第九章　固固定化酶与固定化细胞技术第一节固定化酶•固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。

•酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的特点（与游离酶相比）•（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化；•（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化；•（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性；•（4）酶的反应过程能够严格控制；•（5）酶的利用率提高，生产成本降低；•（6）能够进行多酶反应；•（7）可以增加产物收率，提高产物的质量；•（8）增加了生产的成本；•（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。

一、固定化酶的制备方法•根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则：–（1）必须维持酶的催化活性以及专一性；–（2）有利于实现连续化和自动化；–（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量；–（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用；–（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应；–（6）成本要低，以便于工业使用；实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。

•（一）包埋法：–1、网格型–2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法•（二）吸附法：–1、物理吸附法–2、离子吸附法•（三）、共价偶联法•（四）、交联法•（五）、共价结合法–1、结晶法–2、分散法酶固定化方法示意图二、固定化酶的性质1、稳定性2、最适温度最适pH pH3、最适4、底物特异性go稳定性比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度2040608010030405060708090Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A BA 固定化酶B 游离酶稳定性(续)（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白（4）对变性剂）对变性剂((如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等))的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同pH pH pH稳定性提高稳定性提高稳定性提高..(back back))最适温度与游离酶差不多050100150200250300350304050607080Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A B最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，5-10℃;比游离酶高比游离酶高5-105-15 ℃以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为30 ℃同一种酶;80 ℃，比固定化前提高了，比固定化前提高了30用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度 <60烷基化法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 67离子键结合法DEAE-DEAE-纤维素纤维素 72离子键结合法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 60游离最适温度最适温度((℃ ） 方法载体载体最适pH 值酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pH pH pH和酶和酶—pH pH曲线常发生偏曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响带负电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH 的影响原因:吸引作用带正电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的低H +H +H +H +H +H +H +偏酸微环境OH -OH -OH -OH -OH -OH -H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体，固定化酶最适pH 值一般不变(2)产物酸碱性对最适pH 值的影响酸性酸性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的高值比游离酶的高碱性碱性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的低值比游离酶的低中性中性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值一般不变值一般不变原因原因::载体障碍产物的扩散底物的特异性与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关;;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等;;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。

酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。

但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。

因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。

本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。

【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。

20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。

工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。

所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。

固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。

一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。

一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。

吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。

后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。

2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。

延伸阅读1 细胞固定化技术1.1细胞固定化技术概要1.1.1 固定化细胞[1]固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的新技术，即一项利用物理或化学手段将游离的微生物（细胞）或酶，定位于限定的空间区域，并使其保持活性且能反复利用的技术。

由于固定化细胞保持了细胞的生命活动能力，它不但比游离细胞的发酵更具有优越性，而且比固定化酶有更多的优点，因为固定化细胞省去了制备酶或含酶细胞处理过程所需要的完整酶系.并能不断产生新酶及其所需的辅助因子，而且固定化方法较简单，成本也较低。

1.1.2 固定化细胞的优缺点[2]固定化细胞主要具有6个优点：一是不需要将酶从微生物细胞中提取出来并加以纯化，酶活力损失小、成本低。

二是细胞生长停滞时间短，细胞多、反应快，抗污染能力强，可以连续发酵，反复使用，应用成本低。

三是酶处于天然细胞的环境中，稳定性高。

四是使用固定化细胞反应器，可边加入培养基，边培养排出发酵液，能有效地避免反馈抑制和产物消耗。

五是适合于进行多酶顺序连续反应。

六是易于进行辅助因子的再生，因而更适合于需要辅助因子的反应，如氧化还原反应、合成反应等。

当然，固定化细胞也存在一些缺点，主要表现为：必须保持菌体的完整，防止菌体的自溶，否则会影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶的分解作用；由于细胞内有多种酶存在，往往有副产物形成。

为防止副产物必须抑制其他酶活力；细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。

1.2固定化细胞的特性[2]1.2.1 形态学特征固定化细胞多为球形颗粒，但也有制成立方块或膜状的。

用吸附法时，则取决于吸附物质的形状。

在球形固定凝胶内，细胞的分布并不均匀，而是接近于球的外表面。

有时细胞会在凝胶内的小泡中繁殖，直到最后充满整个可利用的空间。

1.2.2 生理学特征固定化细胞必需具有生命活力，因此创造良好的细胞载体或基质，选择恰当的固定化方法和生物反应器，最佳的反应溶液和周围微环境，维持细胞适度的生长和繁殖等尤为重要。

固定化细胞技术综述及其应用张弘扬1401024103 高娟丽1401024122天津农学院农学与资源环境生物技术（1）班摘要固定化细胞是将动植物或微生物细胞固定于合适的不溶性载体上的一种技术，它既可以提高生产效率和生产能力、延长生产周期，又易于细胞的分离和回收。

在生物、医药、环境保护、食品工业等方面得到了广泛应用。

本文主要介绍了固定化细胞技术的方法，载体的选择与应用，综述了固定化细胞技术在工业、环境中的应用，并对其发展前景进行展望。

关键词细胞固定化固定化方法细胞固定载体生物反应器酒精发酵环境治理固定化技术包括固定化酶技术与固定化细胞技术。

固定化细胞技术起步较晚，在20世70年代后才从固定化酶技术发展而来，它是指通过物理或化学的方法将分散、游离的微生物细胞固定在某一限定空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。

相对于固定化酶技术，该方法不需把酶从细胞中提取出来，且无需纯化，酶活力损失小。

目前，固定化细胞技术的应用范围涵盖生物学、生化工程、有机化学、合成化学、高分子化学、食品与发酵工业、环境净化、能源生产等多个领域，已经成为生物技术中十分活跃的跨学科研究领域。

本文主要对该技术及其应用进行了简单介绍，并对其发展前景进行展望。

一、生物细胞固定化技术1、细胞固定化的原理及方法固定化技术是使生物催化剂更广泛、更有效应用的一种重要手段，任何一种限制生物催化剂自由流动的技术都可以用于制备固定化生物催化剂。

由于细胞的种类多种多样，大小和特性各不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。

Karel 等人将其归纳为表面吸附、多介质包埋、隔离和自凝集4大类；王建龙把目前常用的固定化方法分为吸附法、包埋法、胶联法和截留法；杨文英等介绍了吸附法、包埋法、共价结合法、胶联法、多孔物质包络法、超过滤法、多种固定化方法联用等7种常用方法；成庆利等按有无外加载体将细胞固定化方法分为有载体固定化法和无载体固定化法2种；张磊等按照固定化载体与方式的不同将其分为吸附法、包埋法、共价结合法和胶联法。

微生物固定化技术的应用
微生物固定化技术是一种将微生物细胞或酶固定在载体上的技术，可以用于生物催化、废水处理、食品加工等领域。

这种技术的应用已经得到了广泛的关注和研究。

在生物催化方面，微生物固定化技术可以用于生产生物柴油、生物酒精、生物酸等。

通过将微生物固定在载体上，可以提高微生物的稳定性和活性，从而提高生产效率和产量。

此外，微生物固定化技术还可以用于生产生物降解剂，用于处理有机废水和固体废弃物。

在废水处理方面，微生物固定化技术可以用于处理含有高浓度有机物的废水。

通过将微生物固定在载体上，可以提高微生物的附着能力和生长速率，从而提高废水处理效率。

此外，微生物固定化技术还可以用于处理含有重金属的废水，通过微生物的吸附和生物转化作用，将重金属离子转化为无害的物质。

在食品加工方面，微生物固定化技术可以用于生产酸奶、酒精饮料、酱油等。

通过将微生物固定在载体上，可以提高微生物的稳定性和活性，从而提高产品的品质和口感。

此外，微生物固定化技术还可以用于生产发酵剂，用于加速食品的发酵过程。

微生物固定化技术是一种非常有前途的技术，可以用于生产、环保、食品等多个领域。

随着技术的不断发展和完善，相信微生物固定化技术的应用前景会越来越广阔。