碱裂解发制备质粒DNA原理

碱裂解发制备质粒DNA原理碱裂解法是一种常用的制备质粒DNA的方法，其原理是通过使用碱性溶液将细菌细胞膜和核酸中的蛋白质进行裂解，从而分离出质粒DNA。

下面将详细介绍碱裂解法的原理和步骤。

碱裂解法的原理是利用强碱溶液（如NaOH或KOH）对细菌细胞进行裂解，同时可去除细胞膜及其上的蛋白质，使质粒DNA从细胞内部释放出来。

此外，碱性环境可以使DNA表现为单链结构，这使得DNA与其他形式的核酸（如RNA和DNA-蛋白复合物）有所区别，有助于后续的提取和纯化。

制备质粒DNA的碱裂解法的步骤如下：1.菌液培养：选取含有质粒的细菌菌株，在适宜的培养基中培养至合适的生长期。

2.收获细菌细胞：采用离心等方法将细菌细胞从菌液中收集。

通常使用蒸馏水进行细菌菌液的稀释，以确保细菌能够在蒸馏水中悬浮均匀。

3.清洗细菌细胞：使用理化方法（如洗涤剂、EDTA、乙醇等）将细菌细胞洗净。

这一步骤的目的是去除掉附着在细菌细胞表面的杂质，减少对后续步骤的影响。

4.裂解细菌细胞：将清洗后的细菌细胞悬浮在碱性溶液（如0.2MNaOH）中，使其完全裂解。

碱性溶液的作用是破坏菌细胞膜结构，去除蛋白质，并使DNA变为单链结构。

5. 中和反应：在细菌细胞裂解后，添加中和剂（如2 M Tris-HCl, pH 7.4），将溶液的pH值迅速调整到酸性，以中和碱性溶液中的氢氧根离子。

6.沉淀DNA：通过离心将细菌细胞碎片和其他残余物沉淀下来，将上清液（含有质粒DNA）收集。

7.聚集DNA：通过旋转浓缩、加入盐类或乙醇等方法，将质粒DNA聚集成颗粒状沉淀。

8. 洗涤和纯化：使用缓冲液（如低浓度Tris-HCl或盐溶液）洗涤和纯化质粒DNA，去除残余的盐和杂质。

9.确定DNA浓度和纯度：通过分光光度法或凝胶电泳等方法，测定质粒DNA的浓度和纯度，以确定提取的质粒DNA是否适合下游实验。

总之，碱裂解法通过利用强碱溶液裂解细菌细胞，去除蛋白质，使质粒DNA释放出来，并通过离心、沉淀、洗涤和纯化等步骤，得到高纯度的质粒DNA。

碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。

碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。

本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。

碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。

2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。

3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。

4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。

通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。

5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。

注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。

例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。

2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。

培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。

3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。

4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。

5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。

总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。

实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。

5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。

冰上放置15min。

7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。

8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。

9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。

12000r/min，离心5min。

碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳一．实验原理碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。

在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构互补链变性解开。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。

当用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调其pH值至中性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。

而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。

通过离心将细胞碎片，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA及部分RNA，蛋白质则存在于上清中，再用RNaseA 处理，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀而获得质粒DNA。

质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。

天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。

质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。

质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。

1.质粒的结构：(1)抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)ori, Origin of replication)； (2)启始复制子（(3)多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)2.细菌裂解的方法：（1）碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS（2）煮沸裂解法:沸水煮沸40秒（3）SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。

质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。

实验一碱裂解法抽提质粒DNA[实验原理]质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。

宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。

质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。

质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。

制备质粒载体是分子生物学的常规技术。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

[实验目的]1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。

2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。

[实验步骤]1、试剂配制（1）LB培养液10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。

碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。

碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

）细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。

下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。

溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

第1篇一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取细菌质粒的原理和操作步骤。

2. 了解质粒DNA在分子生物学研究中的应用。

3. 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

二、实验原理质粒是细菌细胞内的一种小型、环状、双链DNA分子，独立于细菌染色体之外。

质粒携带的基因可以赋予细菌额外的生理代谢能力，如抗生素耐药性等。

碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法，其原理如下：1. 在碱性条件下，蛋白质与DNA发生变性，质粒DNA与染色体DNA分开。

2. 加入盐溶液使pH值恢复至中性，质粒DNA迅速复性，而染色体DNA不易复性，形成网状结构。

3. 通过离心，将质粒DNA与蛋白质、染色体DNA等杂质分离。

三、实验材料与仪器1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量移液器、紫外灯、凝胶成像系统、电泳仪、凝胶制备装置等。

2. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、NaOH溶液、SDS溶液、KAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA Marker、染色剂等。

3. 菌种：含质粒的大肠杆菌菌株。

四、实验步骤1. 菌液的制备：将含质粒的大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2. 收集菌体：取适量培养液，4000r/min离心2min，收集菌体。

3. 菌体裂解：向菌体中加入NaOH和SDS溶液，65℃水浴10min，使蛋白质与DNA变性。

4. 质粒DNA的纯化：向裂解液中加入KAc溶液，混匀后4℃静置10min，使质粒DNA沉淀。

5. 离心：4000r/min离心10min，收集沉淀。

6. 洗涤：向沉淀中加入70%乙醇，混匀后4℃静置10min，再次离心，收集沉淀。

7. 干燥：将沉淀干燥至完全无水。

8. 溶解：向沉淀中加入适量TE缓冲液，溶解质粒DNA。

9. 琼脂糖凝胶电泳检测：取适量质粒DNA溶液，加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，质粒DNA在凝胶上呈现清晰的单一条带，表明质粒DNA已成功提取。

碱裂解法提取质粒DNA细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb~200kb以上不等。

存在于细胞之中，独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成分。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的一种方法，它利用染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异来达到分离的目的。

其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中（PH12.6）裂解时，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补连不会完全打开，当加入KAc（PH4.8）中和后，质粒DNA分子能够迅速复性，成溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体DNA难于复性而成絮状，离心时可与细胞碎片一起沉淀下来。

试剂：1.溶液I:50mmol/L 葡萄糖（使悬浮的大肠杆菌不会快速沉积到底部，其次调节渗透压）25 mmol/L Tris.HCl (PH8.0) (缓冲体系)10 mmol/L EDTA （PH8.0）(Ca离子、Mg离子等二价阳离子的螯合剂，抑制DNase活性)2.溶液II: 使用前临时配制0.2 mmol/L NaOH (溶解细胞)1% SDS （使细胞膜崩解）与此同时，提高溶液PH，使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性。

3.溶液III：100mL5mol/LKAc 60mL (Na被K置换成十二烷基磺酸钾PDS，PDS结合蛋白质沉淀，同时牵连染色体发生沉淀)冰醋酸11.5 mL（中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。

基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了）ddH2O 28.5 mL注意：①NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

要新从浓NaOH稀释制备0.2M的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。

此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。

这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。

7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。

碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。

1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。

（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。

（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。

注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。

溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。

因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。

乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。

（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。

确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。

注意不要振荡。

将离心管放置于冰上5分钟。

注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。

一、实验原理碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH12.6的高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，所以当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。

而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、实验器材1.台式离心机，2.震荡混匀器，3.Ep管，4.可调式微量移液量，5.移液器吸头。

三、实验试剂1. pUC质粒转化菌。

2. LB液体培养基：蛋白胨10g、酵母浸出粉5g、NaCl 10g，用重蒸水溶至1000ml，用5mol/L NaOH(约0.2ml)调pH值至7.0，高压灭菌。

3. 氨卞青霉素：用无菌水配制储存液为100mg/ml，临用时1∶1000稀释。

4. GET溶液，终浓度为：500mol/L葡萄糖、10mol/LEDTA、25mol/LTris-HCl(pH8.0)，高压灭菌，4mg/ml溶菌酶(临用前加入)。

5. 1mol/L NaOH6. 5% SDS7. 3mol/L KAC(pH4.8)。

8. 饱和重蒸酚。

9. 氯仿。

10. TE缓冲液(pH8.0)。

终浓度为：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA高压灭菌。

11. RNase 10mg/ml12. 无水乙醇。

四、操作步骤1. 将含有puc19质粒的大肠杆菌100μl接种到含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培养液中，在37℃振摇过夜。

2. 取1.5ml培养物转入Eppendorf管中，8000rpm离心1分钟。

(如菌液较稀，可在弃去上清后，再取1.5ml菌液离心)。

3. 弃去离心后的上清液，使细菌沉淀物尽可能干一些。

4. 将沉淀物悬浮于100μl冰冷的GET溶液中。

碱裂解法提取质粒DNA二、实验原理先以低速离心从培养液中收集菌体，带有质粒的细菌经EDTA破坏外膜后，由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经去垢剂SDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性崩解而使胞内DNA全部释放出来。

利用染色体DNA与质粒DNA在强碱条件下变性与复性的差异分离质粒DNA。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开变性。

质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液将pH值调节至中性时，变性的质粒DNA 会恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。

用等体积饱和酚或氯仿使沉淀变性的蛋白质和染色体分离，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNA。

②氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

③溶液I(pH8.0)：终浓度需称/量取葡萄糖 50mmol/L； C6H12O6.H2O 1.982 gEDTA 10mmol/L； 0.5mol/L 4 mLTris-HCl（PH8.0） 25mmol/L； 1mol/L 5 mL 加DDW定容至200ml，高压灭菌后于4℃保存备用。

④溶液II(pH12.5)：NaOH 0.4mol/L；称取1.6g，加DDW定容至100mlSDS 2%（W/V）；称取2.0g，加DDW定容至100ml室温存放，临用时将二者对半混匀即可。

⑤溶液Ⅲ(pH4.8)：100ml5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5mlDDW 28.5ml高压灭菌后于4℃保存备用。

⑥TE(pH8.0)：Tris-HCl（PH8.0） 10mmol/LEDTA（PH8.0） 1mmol/L⑦TE+R:1mlTE+5ulRNase⑧溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl (pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃⑨ 3mol/ L NaAc (pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。

碱裂解法提取质粒原理
PCR (聚合酶链反应，polymerase chain reaction) 是一种可以在体外放大特定DNA
片段的技术，也称为扩增（amplification）技术。

PCR法可以有效地检测和扩增DNA片段。

该方法被用来在受检实体中提取、检测、识别和检测DNA多样性。

质粒可以通过PCR线性化来提取，也就是说，可以使用多个特异性引物（特异性对特
定片段的DNA的结合）及特定的片段的DNA作为模板，以获得一条目标片段（目标片段）。

碱裂解特定质粒原理是利用酵素将核酸中几个碱基分解，从而模拟碱基降解，如激酶
能够代表核酸序列几个碱基中的某一碱基。

碱裂解法检测质粒的方法通常用PCR技术来实现，这是因为扩增的方式允许在给定片段的碱基顺序上获得更高的灵敏度和特异性。

碱裂解能够确定质粒的结构，利用一种叫做“碱裂解”的方式，这种方式可以将一段DNA拆分成其他的片段，从而了解其结构，增强检测能力。

碱裂解技术包括酶具（如酶切酶），这些对特定碱基序列特异性，可以用来解析特定质粒，检测出质粒中特定载荷裂解
了的区域片段，以及分析质粒的尺寸。

通过PCR与碱裂解技术，可以高效提取质粒，检测其结构，从而改善生物体的检测以
及疾病的治疗。

此外，碱裂解技术还可以进一步改善基因密码的加密状态，以及鉴定新的
质粒结构。

碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理主要基于碱性条件下DNA的
特性。

在这种方法中，碱性条件能够使得DNA变性，即双链DNA分子被分解成
两条单链DNA。

这种变性的DNA在碱性条件下会呈现出单链的形态，使得质粒
得以被提取出来。

在进行碱裂解法提取质粒时，首先需要将含有目标质粒的细菌进行培养，使得
细菌大量繁殖并产生大量的质粒。

随后，通过离心等方法将细菌进行分离，得到含有目标质粒的细菌菌体。

接下来，将细菌菌体进行溶解，使得细菌菌体内的细胞壁和膜被破坏，释放出含有质粒的细胞内液。

此时，碱性条件的作用就体现出来了。

通过加入碱性溶液，使得DNA发生变性，双链DNA分子被分解成两条单链DNA。

在这种碱性条件下，质粒的DNA与
细菌染色体的DNA会有不同的解旋速度，从而使得质粒的DNA得以被分离出来。

质粒的DNA呈现出线性形态，方便后续的提取和纯化。

在质粒的DNA被分离出来后，可以通过中性化等方法使得DNA重新回到双
链的形态，从而得以进行后续的分析和应用。

碱裂解法提取质粒的原理简单而有效，被广泛应用于分子生物学领域中。

总的来说，碱裂解法提取质粒的原理是基于碱性条件下DNA的变性特性。

通
过使DNA变性，质粒的DNA得以被分离出来，从而实现了质粒的提取。

这种方
法简单易行，成本低廉，适用于大规模的质粒提取工作。

因此，碱裂解法在分子生物学研究中具有重要的应用价值。