碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多

碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。

碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。

本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。

碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。

2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。

3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。

4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。

通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。

5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。

注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。

例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。

2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。

培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。

3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。

4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。

5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。

总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。

混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1）在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜；（已经完成）（2）取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（3）加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；（4）加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5）加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min；（6）12000rpm离心5min；（7）吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8）小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9）加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min。

质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。

碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。

碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

）细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。

下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。

溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

质粒DNA抽提实验报告一.实验目的：1. 掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA勺方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCRT增等。

2. 学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA勺纯度，构型，含量和分子量大小。

二.实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三.实验仪器及试剂：1.5mlEP管、高速离心机、移液枪溶液I : 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)2毫克/毫升溶菌酶溶液II : 200 mmol/L NaOH、1% SDS溶液III : 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl 、pH 7.51 mmol/L EDTA四.实验步骤：1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min,去上清液(重复一次)2、加200卩l溶液I重悬浮细胞3、加200卩l溶液U,轻轻摇匀，放置5min4、加150卩l溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min& 去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min, 12000rpm/min离心10min7、70汇醇洗涤沉淀2次，风干8、加20ddHO溶解沉淀，-20 C下保存备用.实验结果：得到大肠杆菌质粒DNAPCR以及电泳实验报告一•实验原理：PCR该技术是在模板DNA引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

第1篇一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取细菌质粒的原理和操作步骤。

2. 了解质粒DNA在分子生物学研究中的应用。

3. 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

二、实验原理质粒是细菌细胞内的一种小型、环状、双链DNA分子，独立于细菌染色体之外。

质粒携带的基因可以赋予细菌额外的生理代谢能力，如抗生素耐药性等。

碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法，其原理如下：1. 在碱性条件下，蛋白质与DNA发生变性，质粒DNA与染色体DNA分开。

2. 加入盐溶液使pH值恢复至中性，质粒DNA迅速复性，而染色体DNA不易复性，形成网状结构。

3. 通过离心，将质粒DNA与蛋白质、染色体DNA等杂质分离。

三、实验材料与仪器1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量移液器、紫外灯、凝胶成像系统、电泳仪、凝胶制备装置等。

2. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、NaOH溶液、SDS溶液、KAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA Marker、染色剂等。

3. 菌种：含质粒的大肠杆菌菌株。

四、实验步骤1. 菌液的制备：将含质粒的大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2. 收集菌体：取适量培养液，4000r/min离心2min，收集菌体。

3. 菌体裂解：向菌体中加入NaOH和SDS溶液，65℃水浴10min，使蛋白质与DNA变性。

4. 质粒DNA的纯化：向裂解液中加入KAc溶液，混匀后4℃静置10min，使质粒DNA沉淀。

5. 离心：4000r/min离心10min，收集沉淀。

6. 洗涤：向沉淀中加入70%乙醇，混匀后4℃静置10min，再次离心，收集沉淀。

7. 干燥：将沉淀干燥至完全无水。

8. 溶解：向沉淀中加入适量TE缓冲液，溶解质粒DNA。

9. 琼脂糖凝胶电泳检测：取适量质粒DNA溶液，加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

五、实验结果与分析1. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，质粒DNA在凝胶上呈现清晰的单一条带，表明质粒DNA已成功提取。

碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。

1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。

（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。

（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。

注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。

溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。

因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。

乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。

（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。

确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。

注意不要振荡。

将离心管放置于冰上5分钟。

注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。

碱裂解法提取基因组dna的原理
碱裂解法是一种用于提取基因组DNA的方法。

其原理是通过碱性条件下，破坏微生物细胞壁和膜，使得DNA从胞内中释放出来，加入酸性物质后使得DNA质粒被还原为单股线形式，最终形成可溶于水的DNA溶液。

具体步骤如下：
细菌分离：利用细菌分离技术，将菌落分离出来，得到单一种类的细菌样品。

细胞收集：将细菌样品转移到离心管中，并进行离心来收集细胞。

碱裂解：使用含有NaOH和SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液，对细胞进行碱裂解，破坏细胞壁和膜，并释放DNA进入溶液中。

中和：加入氢氯酸（HCl）中和反应液，使溶液变为酸性。

沉淀：将反应液中的DNA沉淀出来，用乙醇洗涤、干燥等步骤进行纯化。

重溶：添加缓冲液或去离子水等溶剂，将DNA溶解于液体中，得到基因组DNA。

碱裂解法提取基因组DNA具有操作简单、适用范围广、获得的DNA量大等优点。

由于该方法不需要特殊的设备和试剂，被广泛应用于微生物基因组研究领域中。

实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。

该方法提取质粒DNA是基于
线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的的。

在pH12.0~ 12.5的碱性条件下,染色体线性DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开;共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。

当pH调至中性并在高盐及低温条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态。

通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA留在上清中,然后用有机溶剂酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
●是基于线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的
●在pH12.0~12.5的碱性条件下
●细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋
结构被破坏而发生变性。

●共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态
●pH调至中性并在高盐条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS
的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态
三种溶液
平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大
量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了
醋酸：
是为了中和NaOH
75%酒精：
主要是清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强
酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上
步骤
具体步骤参见对应试剂盒
DNA提取基本步骤：
●材料准备
●破碎细胞或包膜——内容物释放
●核酸分离纯化
●沉淀或吸附核酸,并去除杂质
●溶解核酸于缓冲液或水中。

碱裂解法提取质粒原理
PCR (聚合酶链反应，polymerase chain reaction) 是一种可以在体外放大特定DNA
片段的技术，也称为扩增（amplification）技术。

PCR法可以有效地检测和扩增DNA片段。

该方法被用来在受检实体中提取、检测、识别和检测DNA多样性。

质粒可以通过PCR线性化来提取，也就是说，可以使用多个特异性引物（特异性对特
定片段的DNA的结合）及特定的片段的DNA作为模板，以获得一条目标片段（目标片段）。

碱裂解特定质粒原理是利用酵素将核酸中几个碱基分解，从而模拟碱基降解，如激酶
能够代表核酸序列几个碱基中的某一碱基。

碱裂解法检测质粒的方法通常用PCR技术来实现，这是因为扩增的方式允许在给定片段的碱基顺序上获得更高的灵敏度和特异性。

碱裂解能够确定质粒的结构，利用一种叫做“碱裂解”的方式，这种方式可以将一段DNA拆分成其他的片段，从而了解其结构，增强检测能力。

碱裂解技术包括酶具（如酶切酶），这些对特定碱基序列特异性，可以用来解析特定质粒，检测出质粒中特定载荷裂解
了的区域片段，以及分析质粒的尺寸。

通过PCR与碱裂解技术，可以高效提取质粒，检测其结构，从而改善生物体的检测以
及疾病的治疗。

此外，碱裂解技术还可以进一步改善基因密码的加密状态，以及鉴定新的
质粒结构。

碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理主要基于碱性条件下DNA的
特性。

在这种方法中，碱性条件能够使得DNA变性，即双链DNA分子被分解成
两条单链DNA。

这种变性的DNA在碱性条件下会呈现出单链的形态，使得质粒
得以被提取出来。

在进行碱裂解法提取质粒时，首先需要将含有目标质粒的细菌进行培养，使得
细菌大量繁殖并产生大量的质粒。

随后，通过离心等方法将细菌进行分离，得到含有目标质粒的细菌菌体。

接下来，将细菌菌体进行溶解，使得细菌菌体内的细胞壁和膜被破坏，释放出含有质粒的细胞内液。

此时，碱性条件的作用就体现出来了。

通过加入碱性溶液，使得DNA发生变性，双链DNA分子被分解成两条单链DNA。

在这种碱性条件下，质粒的DNA与
细菌染色体的DNA会有不同的解旋速度，从而使得质粒的DNA得以被分离出来。

质粒的DNA呈现出线性形态，方便后续的提取和纯化。

在质粒的DNA被分离出来后，可以通过中性化等方法使得DNA重新回到双
链的形态，从而得以进行后续的分析和应用。

碱裂解法提取质粒的原理简单而有效，被广泛应用于分子生物学领域中。

总的来说，碱裂解法提取质粒的原理是基于碱性条件下DNA的变性特性。

通
过使DNA变性，质粒的DNA得以被分离出来，从而实现了质粒的提取。

这种方
法简单易行，成本低廉，适用于大规模的质粒提取工作。

因此，碱裂解法在分子生物学研究中具有重要的应用价值。