琼脂糖凝胶电泳完整整理版(ppt)

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实验三琼脂糖凝胶电泳ppt课件

2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒连在了一起）。同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII

琼脂糖凝胶电泳 ppt课件

• 有热可逆性
• 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
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ppt课件
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳在脉冲凝胶电泳上分析不合适
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注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。
注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
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ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液

琼脂糖凝胶电泳24页PPT

1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有久久不会退去的余香。
琼脂糖凝胶电泳 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子

DNA的琼脂糖凝胶电泳分析ppt课件

❖ 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应，中间电场比较均匀；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物
采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱（即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响），，加H2O800ml，待完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。

实验琼脂糖凝胶电泳的原理与方法 PPT

六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
按电泳法分:
按超速离心法分:
乳糜微粒(CM)
乳糜微粒CM ( < 0、96 )
-脂蛋白 (-位) 极低密度脂蛋白VLDL(0、961、006)
前-脂蛋白(2-位) 低密度脂蛋白LDL (1、0191、063) -脂蛋白 (1-位) 高密度脂蛋白HDL(1、0631、21)
进行印迹转移电泳时,要注意缓冲液得离子强度要低,pH要远离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好得Tris-缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过高。
五、交变脉冲电场凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb得DNA。这就是因为在琼脂糖凝胶中,DNA分子得有效直径超过凝胶孔径时,在电场作用下,迫使DNA变形挤过筛孔, 而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向,则DNA分子必须改变其构象,沿新得泳动方向伸直,而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。
D-半乳糖
3,6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖链依分子内与分子间氢键及其它力得作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。
冷却
松散,随机地,盘绕地琼脂糖链
双螺旋结构区域与线性链相链接
淬火
溶胶状态
初级胶
最终得凝胶结构
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下: (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事
按支持物得装置形式不同,区带电泳可为: ➢平板式电泳,支持物水平放置,就是最常用得电泳方式; ➢垂直板式电泳,聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳; ➢垂直柱式电泳,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类; ➢连续液动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸垂直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向下流, 与电泳方向垂直。

琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤ppt课件

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TAE和TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液，二者相比：
1）TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；
2）TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%；
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。
琼脂糖凝胶电泳的优点
1. 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗
2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。
3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、
核酸、病毒等大分子物质。
4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。
5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定
6. 样品易回收，常用于制备。
精选ppt
1
• 天然琼脂（ agar ） : 又名琼胶、菜燕、冻粉是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
琼脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷
D-半乳糖
精选ppt
2
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段
⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。
⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。

琼脂糖凝胶电泳试验课件

0.3 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 5~60 ( kb) 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3 100~2000 ( bp) 80~500 60~400 40~200 25~150 6~100
PAG
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0
不同（空间）不同（空间）类型核酸的凝胶电泳：
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。
缓冲液的离子强度离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般离子强度在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样值品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向正极泳动。在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环 DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。
2）凝胶孔径大小）
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。
凝胶
琼脂糖
胶浓度（）线状DNA分子的有效分胶浓度（%）线状分子的有效分离范围
三、实验原理
概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向
正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约 200bp~50kb。

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载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载样缓冲液有三个作用：
增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于上样操作；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。
上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰FF。
琼脂糖凝胶载样缓冲液
溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰 FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4% 浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。
琼脂糖凝胶缓冲液
琼脂糖凝胶缓冲液
琼脂糖凝胶缓冲液
TBE可以使用10次左右，而TAE用2~3次就要更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条带模糊或不规则DNA带迁移。
电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电流加大，凝胶发热。
琼脂糖凝胶载样缓冲液
注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。
5. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3－5 mm 之间。
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。
凝胶电泳技术
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳：实验原理
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。
注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
琼脂糖凝胶缓冲液
有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳
Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E 缓冲液） Tris-硼酸盐缓冲液(TBE) Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)
琼脂糖凝胶电泳：实验原理
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。
琼脂糖与琼脂的区别
琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶（agaropectin）组成的。琼脂糖的结构单元是 D半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似，但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通常在0.2%以下，电内渗比较小，通常在 0.13%以下。简言之，琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。
琼脂糖凝胶电泳完整整理版(ppt)
琼脂糖凝胶电泳完整整理版
分子生物学实验技术专题
电泳技术简介
什么是电泳技术？电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、
核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
电泳技术的分类
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。
自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充分混匀——不提倡使用。
2 凝胶的浓度
3 DNA的构象使用的电压移4速简率言就之越，低浓，度反越之大迁，移分速子率孔就径大就。越小，DNA迁
另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，
大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，
所4 以分使子大用的的迁移电慢。压
等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋>线
性5DN琼A）脂糖的种类电泳缓冲液形6 状一越般接来近说球，形分，子则带其的电电泳荷迁量移越速大度、越直快径。越小、
7 嵌入染料的存在
影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小
琼脂糖凝胶载样缓冲液
影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小 2 凝胶的浓度 3 DNA的构象 4 使用的电压 5 琼脂糖的种类 6 电泳缓冲液 7 嵌入染料的存在
影响电泳迁移率的因素 1 DNA分子的大小
2 凝胶的浓度
DNA的构象碱3 基D对NA数分目子）大。小分迁子移越速大率，U摩与擦log阻N力成越反大比，（同N为时
琼脂糖凝胶电泳特点
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。