发酵工程实验讲义

发酵⼯程实验讲义

发酵⼯程实验（适合发酵⼯程原理与技术）

张建国⽤

前沿

发酵⼯程（Fermentation Engineering）属于⽣物技术的范畴，⽣物技术⼜称⽣物⼯艺学现代⽣物技术作为⼀门新兴的⾼科技术产业，它的⽣命⼒在于他对社会经济和发展的各个⽅⾯都带来了极⼤冲击和影响。

发酵⼯程是指在最适发酵条件下，发酵罐中⼤量培养细胞和⽣产代谢产物的技术。

发酵⼯程由于涉及到⽣物催化剂，因⽽与化学反应有关。由于⽣物技术的最终⽬标是建⽴⼯业⽣产过程为社会服务，因⽽该⽣产过程可称为⽣物反应过程（亦称为⽣化反应过程）。

在发酵技术中⼀般包括微⽣物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利⽤固定化酶，固定化细胞所做的反应器加⼯底物（即有⽣化催化剂参加），以及培养加⼯后产物⼤规模的分离提取等⼯艺。主要是在⽣物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。如酸碱度、湿度、底物浓度、通⽓量以及保证⽆菌状态等研究内容。

⽣物技术产品具有多样性，各个学校的教学资源和课时不同，所进⾏的实验种类不同。本实验内容根据本校的具体条件进⾏安排。安排的思路是以最简洁有效的⽅式针对发酵过程的重要要素进⾏实验，便于学⽣对教学内容有个较好的认识，理顺学习思路，为进⾏社会科学实践打下良好基础。

第⼀篇野⽣型菌株的筛选

经典的发酵产物来⾃微⽣物，⼟壤是微⽣物的⼤本营。⽣产菌株的选育源头都来⾃于⾃然界。如何从⾃然界中筛选⽬的微⽣物，可以根据⽬的微⽣物和产物的特性作为筛选条件，进⾏筛选提⾼筛选效率，从⽽有效的解决菌株从⽆到有的问题。

实验⼀产淀粉酶菌株的筛选（4学时）

⼀．实验⽬的

筛选⼀株能够合成分解淀粉的微⽣物。

⼆．原理

⾃然界微⽣物种类繁多，有些微⽣物能够以淀粉作为碳源进⾏⽣长繁殖是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从⾃然界中定向分离出合成淀粉酶的微⽣物。当能合成淀粉酶的微⽣物在固体培养基中⽣长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围，将菌落周围的淀粉⽔解成为⼩分量的糊精、聚糖和单糖。这些⽔解物不能包裹单质碘从⽽在菌体周围形成透明圈。

三. 材料与仪器1. 材料

蛋⽩胨，⽜⾁膏，NaCl，琼脂条，可溶性淀粉，碘液。2. 仪器

⽜⽪纸、培养⽫、试管、涂布棒、恒温培养箱、玻璃珠

四．⽅法与步骤1. 筛选培养基的配置

可溶性淀粉2g ，NaCl 5g，⽜⾁膏5g ，蛋⽩胨10g，琼脂20g ，⽔1000ml2. 碘液的配置

称取KI 2.0g，⽤50mL去纯⽔溶解KI，迅速称量I2 0.5g并加⼊KI溶液中，⽤纯⽔定容到100ml，搅拌溶解后保存在棕⾊瓶中，橡⽪塞封⼝。3. ⼟样的采集

⑴每⼤组取三种不同环境的⼟样并记录当时取样环境情况（每⼀⼩组以其中⼀个地⽅进⾏分离）。

⑵以⼩组为单位进⾏稀释分离。取⼟样1克，加⼊9mL ⽆菌⽔，逐步稀释⾄105、106、107。（每个梯度涂2个

瓶⽫）。

⑶30℃恒温培养48⼩时

⑷产淀粉酶菌株的鉴定。

挑选单菌落影印到⽆菌瓶⽫上，同时⽤签字笔对各单菌落在底⽫标号。标记接种过的培养⽫30℃培养24h，取其中⼀⽫喷洒稀碘液记录有⽔解圈的单菌落。与此对应找出合成淀粉酶的菌株。

⽐透明圈＝透明圈直径（mm）/ 菌落直径（mm）[5]每⼩组调去活性优良的菌株接⼊斜⾯试管保存，待下⼀次⽤。

五．记录与结果1.环境情况

地点⼀：

地点⼆：

地点三：2. 绘制出透明圈数据共享

六．结果分析

从不同地点获得的结果进⾏分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结论。

七作业1. 为什么要⽤淀粉作为碳源？

2. 在观察结果的过程中为什么要及时观察,否则会有什么的后果.

3. 为什么同样⼀个同样要稀释⼏个不同梯度进⾏涂平板.

实验⼆排斥美兰放线菌的筛选

⼀．实验⽬的

筛选能够和美兰发⽣排斥反应的放线菌。

⼆．原理

放线菌⽬前是合成⼀些抗⽣物质的主要微⽣物种群。美兰在酸性条件下带正电荷，个别放线菌在⽣长过程中可以释放出带正电荷的产物。两者在固体培养基中能够形成特殊的排斥圈。⽬前研究表明这种产物有可能是⼀种⽣物碱性物质，对其他菌体有良好的抑制和杀灭作⽤，可以作为药物的靶向载体和⾷品添加剂。放线菌⼀般⽣长条件在中性，⽽美兰在酸性条件下带正电荷，所以培养条件选择在中性偏酸性。在筛选过程中会有⼤量的杂菌⽣长从⽽影响筛选效果的观察和筛选分离，为此要在培养基中加⼊⼀些对杂菌有抑制作⽤但对放线菌抑制作⽤较⼩的化学物质⾼锰酸钾。为了避免杂菌的影响要及时的观察和分离。

三. 材料与仪器1. 材料

葡萄糖,酵母粉，NH4SO4，K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, ZnSO4, FeSO4,2. 仪器

⽜⽪纸、培养⽫、试管、涂布棒、恒温培养箱、玻璃珠

四．⽅法与步骤1. 筛选培养基的配置

1）培养基成分

葡萄糖50 g·L-1,酵母粉5 g·L-1，1 NH4SO410 g·L-1，0.8g K2HPO4 0.8 g·L-1, KH2PO4 1.36 g·L-1, MgSO4 0.05 g·L-1,ZnSO4 0.05 g·L-1, FeSO4 0.03 g·L-1,调节pH为6.8，1×105 Pa 灭菌30 min，酵母膏单独灭菌。

2）. ⾼锰酸钾溶液的配置

称取7.5 g K2Cr2O7，⽤100mL去纯⽔溶解灭菌待⽤。3）. 美兰溶液配制

称取0.2g美兰，⽤100mL去纯⽔溶解灭菌待⽤。

在培养基冷却⾄70~80℃左右时，分别加⼊⾼锰酸钾溶液和美兰溶液，使培养基中的含量分别为75mg/L和0.002g/L。3. ⼟样的采集和样品的处理

⑴每⼤组取三种不同环境的⼟样并记录当时取样环境情况（每⼀⼩组以其中⼀

个地⽅进⾏分离）。

⑵以⼩组为单位进⾏稀释分离。

取⼟样1克，加⼊9mL ⽆菌⽔，逐步稀释⾄10-1、10-2、10-3。（每个梯度涂2个瓶⽫）。4. 培养

（1）30℃恒温培养120⼩时

（2）三天后开始间隔24⼩时观察，⽣长和形成透明圈情况

五．记录与结果1.环境情况

地点⼀：

地点⼆：

地点三：2. 绘制出透明圈数据共享

六．结果分析

从不同地点获得的结果进⾏分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结论。

七作业1. 为什么要⽤加⼊重铬酸钾和美兰？

2. 在观察结果的过程中为什么要及时观察,否则会有什么的后果.

3. 为什么同样⼀个同样要稀释⼏个不同梯度进⾏涂平板.

附

柠檬酸产⽣菌的分离

◆柠檬酸⼜名枸橼酸，它是存在于柠檬等⽔果中的⼀种有机酸。学名为3-羟基3-羧

基戊⼆酸。

◆柠檬酸具有令⼈愉快的酸味，它⼊⼝爽快，⽆后酸味，安全⽆毒，是发酵法⽣产的最重要有机酸。它在⽔中的溶解度极⾼，能被⽣物体直接吸收代谢。它的许多特殊优点使它在各个⼯业部门得到了⼴泛的应⽤。柠檬酸的盐类和衍⽣物也各具优点，⽤途⼴泛，在国民经济中占有重要地位。

◆实验⽬的：

1、了解⿊曲霉菌在⼯业⽣产中的不同作⽤；

2、复习掌握从⼟壤中分离⼯业⽤微⽣物的原理及⽅法；

3、掌握利⽤变⾊圈法筛选产酸菌的⽅法。

实验原理：

◆1、新菌株的分离⼤致可分为采样、增殖（富集）培养，分离鉴定、性能测定等

步骤。

◆2、柠檬酸可由曲霉菌发酵糖类⽽⽣成，其中尤以⿊曲霉产酸能⼒最强。⽬前⼯

业⽣产中多以⿊曲霉为柠檬酸产⽣菌。

◆3、⿊曲霉耐酸性较强，在pH值1.6时仍能良好⽣长。利⽤其产酸⾼、耐酸强的

⽣理特征，使⽤pH1.6的酸性营养滤纸分离该菌，简单易⾏，再加上⽤变⾊圈法进⾏初筛，使产柠檬酸的菌株更易被选出。

◆4、⿊曲霉产⽣的柠檬酸,可利⽤Deniges⽒液鉴别；其产酸量可⽤0.1N氢氧化钠

滴定。

柠檬酸产⽣菌的分离实验步骤:

◆1、⼟壤采样

◆2、准备稀释分离⽤的器材

◆3、将平⽫、吸管包好后⼲热灭菌

◆4、配制察⽒培养基

◆5、做成固体斜⾯

◆6、配成蓝⾊的察⽒-多民培养基

◆7、湿热灭菌

◆8、摆斜⾯、倒平板

◆9、稀释⼟样

◆10、涂布均匀

◆11、倒置培养。变⾊圈反应

柠檬酸产⽣菌的初筛实验步骤

◆1、配制初筛发酵培养基并灭菌

◆2、观察菌落

◆3、挑选菌落变⾊圈，测量变⾊圈与菌落直径之⽐，取⽐值较⼤者

◆4、将选好的菌株编号，接⼊斜⾯。同时采⽤倒置接种法在培养⽫上点植接种

◆5、培养斜⾯和平⽫

◆6、摇瓶发酵◆7、柠檬酸鉴定

◆8、产酸量的测定。

思考题

◆1.简述从⼟壤中筛选产⽬的产物微⽣物菌种的过程。

◆2.⼟壤采样时应注意的哪些问题？

◆3.⿊曲霉柠檬酸产⽣菌菌株的富集应考虑利⽤哪些特点来进⾏富集？

第⼆篇菌种选育

微⽣物菌种的选育⽬的防⽌菌种退化解决⽣产实际问题，提⾼⽣产能⼒，提⾼产品质量，开发新产品。⽬前菌种选育的⽅法主要有⾃然选育、诱变育种、杂交育种、分⼦育种等⼿段。但是诱变育种还是育种的主流，诱变育种根据诱变剂的种类可分为化学诱变和物理诱变。本实验以紫外线作为物理剂进⾏诱变。诱变过程⼀般包括诱变出发菌株的选择、诱变剂量的选择和诱变及其筛选。

实验⼀产淀粉酶菌株的诱变育种（8学时）

（1）产淀粉酶菌株的诱变剂量选择（4学时）

⼀. ⽬的

通过对出发菌株进⾏不同剂量条件下的照射，找出最佳诱变剂量。

⼆. 原理DNA是遗传物质的基础，主要组成分为脱氧核酸。DNA的在260nm下有最⼤能量吸收峰，15W紫外灯在30cm处的紫外线波长多数为260nm左右。当菌体处在这样的波长条件下就会吸收⼤量能量造成DNA分⼦发⽣断裂、分⼦结构形式发⽣改变。有些微⽣物由于DNA分⼦⼤⾯积损伤⽽死亡有些因为菌体进⾏了修复⽽存活。在修复过程中有些虽然存活了但DNA碱基发⽣了改变从⽽形成了突变菌株。突变菌中有些发⽣了产量正突变有些发⽣负突变。通过选择的⼿段选择出实验要求的突变菌株。从⽽使野⽣型或出发菌株的性状得到改良。

三. 材料与仪器1. 材料（出发菌株选取⼀个；例如枯草芽孢杆菌）

蛋⽩胨，⽜⾁膏，NaCl，琼脂条，可溶性淀粉，碘液。2. 仪器

紫外灯、磁⼒搅拌器、报纸、红灯泡、灯⼝、电线、插座、瓶⽫、⽆菌三⾓瓶（内含玻璃珠）、含有磁针的⽆菌瓶⽫

四．⽅法与步骤1. 培养基

可溶性淀粉2g ，NaCl 5g，⽜⾁膏5g ，蛋⽩胨10g，琼脂20g ，⽔1000ml2. ⽆菌⽣理盐⽔

3. 出发菌株的制备（⽆菌条件下操作）

将出发菌株从试管中⽤25mL⽣理盐⽔多次洗出洗出，倒⼊含有玻璃珠的⽆菌三⾓瓶中，进⾏反复振荡20min。4. 诱变条件选择（操作过程在红光或⿊暗条件下进⾏）

吸出5mL⾄含有磁针的⽆菌瓶⽫中，置于磁⼒搅拌器上，缓慢加速磁⼒搅拌器。然后打开瓶⽫盖，再打开紫外灯迅速记时。时间到⽴刻关闭紫外灯。（5S、10S、15S、20 S、25 S、30 S、35 S、40 S）。5. 涂瓶⽫

⑴对照：将未进⾏辐射的菌悬液稀释适当倍数105，106，107，涂瓶⽫。

⑵处理组：将进⾏辐射的菌悬液稀释适当倍数103，104，105，涂瓶⽫。6. 30℃恒温培养48⼩时（培养物⽤⿊布袋或报纸包裹严实进⾏培养）。