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两种猪瘟疫苗抗原检测方法对比分析一、实时荧光定量PCR将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
可以实时定量检测目标的基因拷贝数。
优势方便，快捷，灵敏，非常微量的样品，在几个小时内就可以出结果。
劣势1、无法区别活的病毒和死亡的病毒，检测的结果只是病毒的基因拷贝数，跟活病毒数量无关。
针对这个问题，可以进行一个小实验。
疫苗企业、猪场、检测单位如果有兴趣均可以试试。
方法很简单，选择同一批次的三瓶疫苗，选择其中一瓶疫苗，加入适量甲醛灭活，然后与不灭活的剩余两瓶疫苗同时使用荧光定量PCR方法检测，看其检测结果。
2、无法鉴别出BVDV和猪瘟病毒的基因容易出现假阳性。
3、受操作影响较大，定量数据有一定偏差。
4、检测出的基因拷贝数跟在猪体上的免疫效果没有直接相关性。
5、没有标准可以参考，各自为战。
用处使用实时荧光定量PCR方法只能大致定量疫苗中的病毒基因数量，无法确定猪瘟疫苗中的活病毒的抗原含量，只可以在同等条件下大致评估疫苗中的基因含量高低，检测出的基因拷贝数量跟疫苗中的活病毒数量和免疫效果完全没有相关性。
目前，实时荧光定量PCR均是各个检测机构的自建方法，检测流程、引物与耗材等均按照自己的标准进行，没有国家标准可以参考，而且进行操作的实验室环境控制参差不齐。
因此，同一个样品，可能各个试验室检测的结果会有明显偏差。
二、兔体感染量(RID)检测按照疫苗瓶签注明的头份，使用生理盐水按照内控标准进行稀释，然后接种家兔，上下午各测体温一次，48小时后每隔6小时测定体温一次，当兔子出现典型的定型热反应时，疫苗判断合格。
实验研究 2019年10月下不同猪瘟疫苗对仔猪免疫效果对比试验石少悦（天津威特生物医药有限责任公司，天津 300301）摘 要：目的：总结不同猪瘟疫苗对仔猪免疫效果对比结论。
方法：在2019年1月到3月开展本次研究，采用基础免疫比较好的某两种场作为案例进行研究。
总共选取40头保育仔猪，检测所用的母源抗体合格后在30天日龄时开展研究。
本次研究中所使用的疫苗均属于规模猪场使用量最大的疫苗，最终选取脾淋苗与细胞苗。
在日龄30d时进行首次免疫，在首次免疫后28d时进行二次免疫。
总结不同时间两组仔猪的免疫效果。
结果：首次免疫后两组仔猪均未达到免疫标准，数据差异不适用统计学标准（P＞0.05）；2次免疫后两组仔猪的免疫指标相对于2次免疫前均有明显数据优势，对比结果适用统计学标准（P＜0.05），但组间对比结果不适用统计学标准（P＞0.05）。
结论：不同猪瘟疫苗对仔猪免疫效果对比差异不突出，首次免疫均无法达到免疫效果，2次加强免疫效果突出，可以更好的强化机体抗体，可用于紧急免疫接种，值得推广。
关键词：猪瘟疫苗；仔猪；免疫效果；效果对比猪瘟主要是因为猪瘟病毒所导致的一种高度接触性、出血性以及致死性的传染病，在具体的疾病表现方面是以小点状的出血、脾脏边缘性坏死、急性的发热、细小血管病变等为主。
因为生猪属于我国重要的养殖品种，猪瘟的发生对于养猪业的影响非常显著，对于猪瘟的干预措施主要是以预防为主[1]。
对此，为了更好的提高对猪瘟的预防水平，本文以研究方式探讨不同猪瘟疫苗对仔猪免疫效果对比，具体研究方法、结果如下。
1 资料和方法1.1 一般资料在2019年1月到3月开展本次研究，采用基础免疫比较好的某两种场作为案例进行研究。
总共选取40头保育仔猪，检测所用的母源抗体合格后在30天日龄时开展研究，试验所用的自主品种均属于杜×长×大商品猪。
1.2 方法本次研究中所使用的疫苗均属于规模猪场使用量最大的疫苗，最终选取脾淋苗与细胞苗。
10．目前市场上有细胞苗，组织苗，脾淋苗等不同类型的猪瘟苗，什么情况下用哪种比较适合，各有什么优缺点？①猪瘟犊牛睾丸细胞疫苗：优点是生产成本低，适合工厂化生产，安全性好，不易发生过敏反应等。
缺点是疫苗稳定性差，毒效价低，易感染牛腹泻病毒；一般用于仔猪超前免疫与首次免疫。
4天产生免力，保护期为1年。
②猪瘟脾淋疫苗：优点是免疫效果好，质量易控制，免疫保护期较长。
缺点是生产成本高，产量较低，生产用家兔供应较困难，个别的注射后发生过敏反应等。
一般用于猪瘟的加强免疫（2免）和紧急预防接种。
4天产生免疫力，保护期为18个月。
③猪瘟乳兔弱毒疫苗：其优缺点介于细胞苗与脾淋苗之间，大、中、小猪都可使用，安全、免疫效果良好。
中国畜牧兽医学会动物传染病学分会万遂如脾淋苗，也属于组织苗，是用成年兔的免疫器官做成的，效果好。
缺点是成本较高，应激反应比较大。
一般不用于超前免疫，现在很多专家建议这个疫苗一般用在种猪免疫，因为成年猪的应激反应要小一些。
乳兔苗，制作成本相对脾淋苗要低一些，效果不如脾淋苗好。
细胞苗，一般采用犊牛睾丸细胞，属于基因工程苗，可以大批量生产，成本低。
效果具有争议性，有些专家认为细胞苗的效果不错，有些专家认为细胞苗的效果没有前面两种好，尤其是高热病发生以后。
现在也有一些生物制品厂家，为了降低成本，通常在脾淋苗中添加细胞苗，而细胞苗最大的问题是，在生产过程中，可能会受到牛流行性腹泻病毒的污染，这个病毒也会引起猪发病。
关于这三种疫苗的使用，我觉得在刚刚结束的中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会上，有一个专家的提议很不错。
他的观点是一个猪场采购一批猪瘟疫苗，然后对这批疫苗进行牛流行性腹泻病毒的检测，同一批次的检测结果应该是一样的。
如果没有检测牛流行性腹泻病毒出来说明这批疫苗是安全的，可以使用；如果检测出来，说明这批疫苗是不合格的。
这个方法值得一试。
河南省粮油进出口集团公司代广军按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年版）收录的资料，我国的猪瘟疫苗分为猪瘟活疫苗（I）和猪瘟活疫苗（II）。
两种不同猪瘟疫苗的免疫效果比较分析
作者：梁亮
来源：《湖北畜牧兽医》2017年第01期
摘要：试验随机选取24头30日龄（体重范围为7.5～9.0 kg）健康仔猪，16头健康后备母猪。
24头小猪随机分成两组，每组12头；16头母猪随机分成两组，每组8头；各分为试验1组和试验2组。
其中仔猪和母猪的试验1组接种猪瘟疫苗A，试验2组接种猪瘟疫苗B。
疫苗在0 d进行首免，30 d进行二免。
每头接种2 mL。
仔猪试验1组和试验2组在首免后第15、30、60天各采血，分离血清，检测猪瘟抗体阻断率。
母猪试验1组和试验2组在首免后第30、60天分别采血，分离血清，检测猪瘟抗体阻断率。
结果表明，不管仔猪还是母猪，接种的两种猪瘟疫苗A和B的免疫效果差异不显著（P>0.05），且从总体上来看，两种猪瘟疫苗免疫60 d后都能使仔猪和后备母猪获得良好的保护力。
关键词：猪瘟疫苗；抗体阻断率；免疫效果
中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2017）01-0011-02
猪瘟（HC）俗称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒（HCV）引起的一种急性、热性、高度接触性的病毒性传染病，是威胁养猪业的主要传染病。
其特征是发病急，高热稽留，小血管壁变性，全身泛发性小点状出血及脾梗死。
该病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。
由于猪瘟病毒的高致病力和高致死率，给养殖业造成了巨大的损失。
猪感染高致病力毒株后在潜伏期就可以造成传染，经历急性猪瘟或亚急性猪瘟的猪在出现症状前大量排毒，但耐过后的猪只体内有明显的猪瘟抗体，且不再排毒。
感染温和性毒株的猪呈慢性感染，在病死前会长期或间歇性地排毒。
怀孕母猪可以通过胎盘感染胎儿导致流产、木乃伊胎或产出弱胎、畸形胎等。
先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状而向外排毒。
在预防过程中，疫苗的效价高低是免疫成败的关键。
低效价的疫苗免疫后猪体产生的抗体不足以抵抗野毒的侵袭，接种猪虽不发病，但终生带毒、排毒，这给净化猪群造成极大障碍。
因此许多猪场在实际防疫工作中都采用加大免疫剂量来解决这一不足，但疫苗种类的选择也与猪瘟免疫效果密切相关[1-6]。
本试验采用两种猪瘟疫苗分别对仔猪和母猪进行免疫，并使用猪瘟病毒抗体检测试剂盒来检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体对病毒的阻断率，通过试验结果分析哪种疫苗免疫效果更佳，以便为今后猪瘟疫苗的选择提供参考。
猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒是用来检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的检测试剂盒。
该试剂盒是用猪瘟病毒抗原包被的微量反应板，利用阻断ELISA原理来检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体。
如果被检样品中存在猪瘟病毒抗体，它们就会阻断辣根过氧化物标记的抗
猪瘟病毒的单克隆抗体。
单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的结合可以通过辣根过氧化物酶与底物的显色程度进行判定，即用酶标仪在单波长450 nm或双波长650 nm测定该反应体系的吸光度。
当被检样品中含有猪瘟病毒抗体（阳性结果）时，显色就会变浅，当被检样品中不含有抗猪瘟病毒抗体（阴性结果）时，显色就会变深。
样本的阻断率可以通过450 nm波长样本吸光度与阴性对照吸光度的比值来确定。
1 材料与方法
1.1 试验动物
福州长乐罗丰猪场随机选取24头30日龄（体重范围为7.5～9.0 kg）的健康仔猪及16头健康后备母猪。
1.2 血清采集
仔猪用前腔静脉采血法、母猪用耳静脉采血方法，析出血清，在4 ℃下保存。
1.3 主要试剂
猪瘟病毒抗原包被的ELISA反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、辣根过氧化物标记的抗猪瘟病毒的酶标抗体、样品稀释液（洗涤液10X、TMB底物、终止液）。
1.4 器材
微量移液器，10～1 000 μL的精密或多道微量移液器，一次性移液器吸头，量筒（500 mL，配制洗涤液用），96孔酶标仪，纯化水（去离子水或双蒸水），滴加和吸去洗涤液的设备，可以盛装液体和消毒液的容器，湿盒或密封反应板用的封条，涡旋混合装置，离心管或微量试管。
1.5 试验方法
仔猪和后备母猪的试验1组均接种猪瘟疫苗A，试验2组均接种猪瘟疫苗B。
疫苗在0 d 进行首免，30 d进行二免。
每头接种2 mL。
仔猪试验1组和试验2组在首免后第15、30、60天分别采血，分离血清，检测猪瘟抗体阻断率。
母猪试验1组和试验2组在首免后第30、60天采血，分离血清，检测猪瘟抗体阻断率。
检测用的猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒的使用和操作均严格按照说明书进行。
1.6 统计方法
试验数据采用SPSS统计分析软件作统计分析，结果以“平均数±标准差”表示。
2 结果与分析
由表1和表2可知，无论是仔猪还是后备母猪，试验1组（猪瘟疫苗A）的免疫效果均略高于试验2组（猪瘟疫苗B）。
注射猪瘟疫苗A的仔猪的被检样本猪瘟抗体阻断率从43.0%上升至72.8%，而后备母猪被检样本猪瘟抗体阻断率从74.8%上升至76.5%；注射猪瘟疫苗B的仔猪的被检样本猪瘟抗体阻断率从46.7%上升至76.1%，而后备母猪被检样本猪瘟抗体阻断率从78.4%上升至81.3%。
统计分析表明，不管仔猪还是母猪，接种的两种猪瘟疫苗A和B的免疫效果差异不显著（P>0.05），且从总体上来看两种猪瘟疫苗免疫60 d后都能使仔猪和母猪获得良好的保护力。
3 小结与讨论
在本试验中，注射猪瘟疫苗A的仔猪的被检样本猪瘟抗体阻断率从43.0%上升至72.8%，而后备母猪被检样本猪瘟抗体阻断率从74.8%上升至76.5%；注射猪瘟疫苗B的仔猪的被检样本猪瘟抗体阻断率从46.7%上升至76.1%，而后备母猪被检样本猪瘟抗体阻断率从78.4%上升至81.3%，表明疫苗A或B对母猪的免疫效果的提高并不显著，分析其原因可能有以下几点。
（1）疫苗的质量方面。
在实际应用中，疫苗从药厂冷库发出直至注射到猪体内，要经过一个运输转运过程。
由于中间环节多、情况复杂、温度变化无常、疫苗时融时冻，其质量无法保障。
要提高实际应用中疫苗的质量，必须加强运输系统的冷藏设施建设，从药厂到县级站用冷藏车运输；从县级到基层保证配备冷藏保温箱，加强对生物药品的管理，没有冷藏设施的一律不准经营疫苗，避免疫苗出厂后时冻时融的状况出现。
同时在县级动物防检机构内要设立疫（菌）苗检测室，定期检测或对每批疫苗进行效价测定，以确定免疫注射的剂量。
（2）母猪的体质方面。
后备母猪的免疫机制较仔猪更加完善和健全，对抗不同程度的猪瘟病毒的抵抗力更强。
试验所用的猪瘟疫苗A和B有可能对弱体质的仔猪有较强的免疫效果。
（3）操作规程的规范问题。
在实际注射操作中，要特别注意部位、针头、剂量和消毒等四个问题。
①注射部位。
在防疫注射中，防疫人员一般仅注意猪体部位，但更重要的是解剖部位，要把疫苗注射到肌间。
因此要把握好注射角度和深度，针头应与猪体成60°为宜，深度应根据猪体大小和肥瘦程度而定，要以达到肌肉深部为佳。
②针头的问题。
不仅要重视一猪一针，也要重视针头长度和粗细，要因猪而异。
③注射剂量。
一般在注射器上固定，注射时剂量一定要足。
④消毒。
注射部位消毒宜用2.0%～3.0%的碘酊，4.0%以上碘酊容易使疫苗失去活性。
针头要做到一猪一针一消毒[7-9]。
参考文献：
[1] 蒋冬福，施万球，韦家槐，等.兔脾淋组织液对猪瘟疫苗的免疫增强试验[J]中国兽医杂志，2001，37（7）：10-11.
[2] 吕仁洪，滕远.猪瘟免疫效果不佳的原因探讨[J]养猪业，2005（3）：37-38.
[3] 王琴，宁宜宝.猪瘟免疫失败主要原因的解析[J]中国兽医杂志，2005（6）：61-62.
[4] 王红宁，刘世贵，吴琦.规模化猪场猪瘟仿制中应注意的问题[J]中国兽医杂志，1999，25（12）：20-21.
[5] 韩雪清，刘湘涛，赵启祖.猪瘟病毒及其猪瘟疫苗研究进展[J].动物医学进展，2000，21（2）：1-7.
[6] 李连任.当前我国猪瘟免疫失败的原因及对策[J].当代畜牧，2005（2）：14-16.
[7] 汪令波.提高猪瘟疫苗免疫效果的措施[J].现代农业科技，2006（8）：14.
[8] 范玉芳.甘肃省酒泉市规模猪场猪瘟疫苗免疫抗体检测及效果分析[J].中国动物检疫，2007，24（8）：38.
[9] 韩红秀，宁国，张志宏.浅谈猪瘟免疫失败的原因与对策[J].猪与禽，2007，27（4）：68.。
