第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
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分子发光分析法_
液池 检测器
ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
①两个单色器
检测器
em
放大器及记录器
②检测器与激发光互成直角
1、光源
激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的 光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线 以365 nm 的谱线最强
二、分子荧光分析法的特点 1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强 灵敏度荧光分析法比分光光度法高2~3个数 量级 2. 选择性好 选择不同的激发光波长 选择不同的检测荧光波长 3. 实验方法简单 4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范 围较广
§ 7- 2
荧光和磷光光谱法
应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm 很强的连续光源
2、单色器
第一单色器作用：分离出所需要的激发光， 选择最佳激发波长 ex ，用此激发光激发液 池内的荧光物质 ex 第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质 所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光 波长 em。 在选定的 em 下测定荧光强度， 定量分析
1 荧光Fluorescence 2磷光Phosphorescence 3 化学发光Chemiluminescence 关键词：激发光谱，荧光光谱，量子产率；
荧光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被 测物质浓度的关系；荧光分析仪器；定量分析
方法
§ 7- 1
概述
一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃 迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态， 这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的 分析方法为分子发光分析法
ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
①两个单色器
检测器
em
放大器及记录器
②检测器与激发光互成直角
1、光源
激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的 光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线 以365 nm 的谱线最强
二、分子荧光分析法的特点 1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强 灵敏度荧光分析法比分光光度法高2~3个数 量级 2. 选择性好 选择不同的激发光波长 选择不同的检测荧光波长 3. 实验方法简单 4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范 围较广
§ 7- 2
荧光和磷光光谱法
应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm 很强的连续光源
2、单色器
第一单色器作用：分离出所需要的激发光， 选择最佳激发波长 ex ，用此激发光激发液 池内的荧光物质 ex 第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质 所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光 波长 em。 在选定的 em 下测定荧光强度， 定量分析
1 荧光Fluorescence 2磷光Phosphorescence 3 化学发光Chemiluminescence 关键词：激发光谱，荧光光谱，量子产率；
荧光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被 测物质浓度的关系；荧光分析仪器；定量分析
方法
§ 7- 1
概述
一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃 迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态， 这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的 分析方法为分子发光分析法
分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法分子荧光光谱法是一种非常有用的分析技术，它可用于测定溶液中分子结构、组成、组分和吸收特性，以及提供关于反应机理的许多信息。
它被广泛应用于化学研究、生物研究、环境研究和制药技术等多个领域。
荧光光谱反应的本质是，一些物质能够从激发态吸收来自外部光源的一定能量，并从激发态到低能量的稳定态跃迁，从而释放出某种光，而这些释放出来的光就是荧光光谱。
基本原理在分子荧光光谱中，激发态是将能量投射到分子上，使其进入一种不稳定的、能量较高的激发态，然后分子会自动以一定的速率从这种高能态向低能态跃迁，跃迁过程中会释放出一定能量的荧光光谱。
具体而言，当激发态的分子能量超过一定的最低能量时，它将进入具有较低能量的稳定态，从而释放出光子。
通常说，这些释放出的光子的频率与激发态的能量有关。
应用分子荧光光谱法可以用于识别、测定和分离不同物质，它可以用于研究有机物、无机物、金属离子和药物，也可用于检测有毒物质。
分子荧光光谱法还可以用于研究分子间相互作用、分子构型变化和反应机理等问题，可以用来研究复杂有机化合物中的加合反应，也可以用来研究金属离子与有机物之间的相互作用。
优缺点分子荧光光谱法具有灵敏度高、分析结果准确、操作简单、检测范围广等优点，可用于大量的物质的有效分析。
此外，它还具有自动控制设备、能测出大量小浓度物质等优点。
然而，分子荧光光谱法也有一些缺点，比如它只能测量没有涂料、沉淀物和色素的物质，而且只有在激发态跃迁释放出荧光时，它才能完成光谱测量。
结论分子荧光光谱法是一种广泛应用的分析技术，它具有敏锐的测量特性，可以快速、准确地测量多种物质，因此被广泛应用于诸多研究领域。
不仅如此，它的测量过程还简单易行，使它可以成为一个非常有用的分析工具。
分子荧光和磷光光谱讲解
?-R、-SO 3H、-NH 3+→对? f 无影响
影响荧光的外部效应
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都 将使化合物的荧光发生变化；
?极性↑→? f↑→F↑→l↑
?粘度↓→分子间碰撞几率↑→F↓ ?含重原子(CBr 4、CH 3CH 2I)→F↓ ?形成氢键→S1*(V=0) 分子↓→F↓
能级图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发
单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一
定的荧光(如l
‘ 2
)。
镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。
镜像规则
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
(1)定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If = ? Ia
由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10-? l c ) If = ? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c )
浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 ? I0 ? l c = Kc
硫胺荧浓度
吡啶硫胺荧浓度
42
荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
2001年美国遭受911袭击时，美国世贸大厦内一共 有2万5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊 叹的纪录：两座大楼里，1万8千多人在上百层的大楼 完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。
分子荧光
N
ON 8-羟基喹啉 N=N 石榴茜素R SO3Na
无机化合物的分析：
铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧
光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法 测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化 荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。
2
荧光分析仪器
• 测量荧光的仪器主要由四个部分组成： • 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
I0 F I
光源： 最常用的是高压汞蒸气灯、高压氙灯、激光光 源。 单色器：第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm 的紫外光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波 长λ2 ，与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。 样品池：采用低荧光材料，通常为石英池。 检测器：光电倍增管。
有机物的荧光分析 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能 发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能 进行荧光分析。 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能 发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活 性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方 法
为提高测定的灵敏度，有时也将芳香 族化合物与适当试剂反应之后进行测 定
荧光强度与浓度的关系
Lambert-Beer 定律：
I I0 e
2.303bc
3
分子荧光的分析及应用
（一） 分子荧光定量分析
①标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制 标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强 度，在标准曲线上求出浓度。
②比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，
荧 光 强 度
荧光激发光谱
荧光光谱
200
ON 8-羟基喹啉 N=N 石榴茜素R SO3Na
无机化合物的分析：
铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧
光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法 测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化 荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。
2
荧光分析仪器
• 测量荧光的仪器主要由四个部分组成： • 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
I0 F I
光源： 最常用的是高压汞蒸气灯、高压氙灯、激光光 源。 单色器：第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm 的紫外光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波 长λ2 ，与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。 样品池：采用低荧光材料，通常为石英池。 检测器：光电倍增管。
有机物的荧光分析 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能 发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能 进行荧光分析。 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能 发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活 性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方 法
为提高测定的灵敏度，有时也将芳香 族化合物与适当试剂反应之后进行测 定
荧光强度与浓度的关系
Lambert-Beer 定律：
I I0 e
2.303bc
3
分子荧光的分析及应用
（一） 分子荧光定量分析
①标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制 标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强 度，在标准曲线上求出浓度。
②比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，
荧 光 强 度
荧光激发光谱
荧光光谱
200
分子荧光光谱法
的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速 度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
• 单重态： 一个分子中所有电子自 旋都配对的电子状态。
• 三重态：有两个电子的自旋不配 对而平行的状态。激发三重态能 量较激发单重态低。
2020/8/21
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应用固体化学研究中心
分子的激发与失活
2020/8/21
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应用固体化学研究中心
• 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级
回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同 多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为 106~109s-1。
• 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发研究中心
1.概述
• 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以
物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行 的定量分析，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行 行的定性分析．
• 光致发光（Photoluminescence）:物体依赖外界 光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发 光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射 三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之 间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于 激发态的运动。紫外辐射、可见光及红外辐射均 可引起光致发光。如磷光与荧光。
光
S0
l1
2020/8/21
l 2 l 2
l3
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（2）激发态分子的失活
激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁的 方式回到基态。
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• 单重态： 一个分子中所有电子自 旋都配对的电子状态。
• 三重态：有两个电子的自旋不配 对而平行的状态。激发三重态能 量较激发单重态低。
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分子的激发与失活
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• 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级
回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同 多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为 106~109s-1。
• 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发研究中心
1.概述
• 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以
物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行 的定量分析，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行 行的定性分析．
• 光致发光（Photoluminescence）:物体依赖外界 光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发 光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射 三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之 间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于 激发态的运动。紫外辐射、可见光及红外辐射均 可引起光致发光。如磷光与荧光。
光
S0
l1
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l 2 l 2
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（2）激发态分子的失活
激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁的 方式回到基态。
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分子荧光分析法
如：苯胺在不同的pH下的荧光效率不同。
NH 3
OH OH
NH 2
H
NH
pH＜ 2 pH7～12 pH＞13 无荧光 蓝色荧光 无荧光 4 荧光熄灭剂的影响： 荧光熄灭 ：指荧光物质分子与溶剂分子或溶 质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 荧光熄灭剂：能够引起荧光熄灭的物质。
H
如： X离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合 物、重氮化合物和羧基化合物。
作用：鉴别荧光物质； 选择适当的荧光测定波长。 激发光谱和荧光光谱类似“镜像对称”关系
荧 光 强 度
300 nm 400 nm 500 nm
硫酸奎宁的激发光谱（虚线）及荧光光谱（实线）
3 溶液荧光光谱的特征
A 斯托克斯位移：Stokes shift 1852年，Stokes首先观察到：溶液荧光光谱中， 荧光波长总是大于激发光波长。 原因：内转换、振动驰豫达到第一激发单线态 的最低振动能级；激发态分子与溶剂相互作 用；激发态分子返回到基态的各不同振动能 级，进一步损失能量。 B 荧光光谱的形状与激发波长无关：荧光发射 通常发生于第一电子激发态的最低振动能级； 而与激发到哪一个电子激发态无关。
V3
体系间跨越
V2 V1 V0
V3
T1
S0
V2 V1 V0
V3
荧光与磷光产生示意图
发射荧光过程约为 109 107 S ，返回基态 时，可停留在任一振动能级上，因此，可得几 个非常靠近的荧光峰谱线。
有关概念： ① 振动弛豫：vbrational relexation 物质分子被激发后，其电子可能跃迁到第一 电子激发态或更高的电子激发态的几个振动能 级上，在溶液中，激发态分子通过与溶剂分子 碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电 子则返回到同一电子激发态的最低振动能级上， 此过程称为～。
分子光谱9分子发光分析
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因 素，都可增强荧光。
实际上，对于高荧光分子，例如荧光素， 其量子产率在某些情况下接近1，说明kI很 小，可以忽略不计。一般来说，kf主要取决于 化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同 时也与化学结构有关。
2. 2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历或n激 发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再 发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃 迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光。这 是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一 般比n大100-1000倍），其次，跃迁的 寿命约为10-7—10-9s，比n跃迁的寿命10-5— 10-7s要短。此外，在跃迁过程中，通过系 间窜跃至三重态的速率常数也较小（S1T!能级 差较大），这也有利于荧光的发射，总之， 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。
系间窜跃
S1
S2
T1
S0 吸光l1
吸光l2 荧光l3
荧光、磷光 能级图
磷光发射
电子由基态单重态激发至第
一激发三重态的几率很小，因为 这是禁阻跃迁。但是，由第一激 发单重态的最低振动能级，有可 能以系间窜跃方式转至第一激发 三重态，再经过振动驰豫，转至 其最低振动能级，由此激发态跃 回至基态时，便发射磷光，这个 跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁 阻的，其发光速率较慢，约为104-10s。因此，这种跃迁所发射的 光，在光照停止后，仍可持续一 段时间。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因 素，都可增强荧光。
实际上，对于高荧光分子，例如荧光素， 其量子产率在某些情况下接近1，说明kI很 小，可以忽略不计。一般来说，kf主要取决于 化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同 时也与化学结构有关。
2. 2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历或n激 发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再 发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃 迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光。这 是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一 般比n大100-1000倍），其次，跃迁的 寿命约为10-7—10-9s，比n跃迁的寿命10-5— 10-7s要短。此外，在跃迁过程中，通过系 间窜跃至三重态的速率常数也较小（S1T!能级 差较大），这也有利于荧光的发射，总之， 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。
系间窜跃
S1
S2
T1
S0 吸光l1
吸光l2 荧光l3
荧光、磷光 能级图
磷光发射
电子由基态单重态激发至第
一激发三重态的几率很小，因为 这是禁阻跃迁。但是，由第一激 发单重态的最低振动能级，有可 能以系间窜跃方式转至第一激发 三重态，再经过振动驰豫，转至 其最低振动能级，由此激发态跃 回至基态时，便发射磷光，这个 跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁 阻的，其发光速率较慢，约为104-10s。因此，这种跃迁所发射的 光，在光照停止后，仍可持续一 段时间。
第九章紫外光谱分析
B带出现在255nm （ε MAX = 200）。这是由π→π＊跃迁与 振动重叠引起的。在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物 的B谱带有许多的精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子跃 迁上的叠加而引起的。在极性溶剂中，这些精细结构消失。
当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会 发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带。
10 4
在共轭体系中， π→π＊跃迁产生的吸收带又称为K （Konjugation）带。
K带 （ π→π＊ ）的特点：强度大，εmax› ；10 4 位置一般 在217～280nm；λmax和εmax的大小与共轭链的长短及取代 基的位置有关。
根据K带是否出现，可判断分子中共轭体系的存在情况。在 紫外光谱分析中有重要应用。
可见，有机化合物价电子一般主要有4种类型的跃迁：
n→π＊ 、 π→π＊ 、 n→σ＊ 和σ→σ＊。各种跃迁所对
应的能量大小为
n→π＊ < π→π＊ < n→σ＊ < σ→σ＊
[讨论]：
①σ→σ＊跃迁所需能量最大。σ电子只有吸收远紫外光 的能量才能发生跃迁，饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远 紫外区，吸收波长λ<200 nm，甲烷的λmax为125nm , 乙烷 λmax为135nm，只能被真空紫外分光光度计检测到；作为 溶剂使用。
有机化合物紫外吸收光谱（电子光谱）是由分子 外层电子或价电子跃迁所产生的。按分子轨道理 论，有机化合物分子中有：成键σ轨道，反键σ*轨 道；成键π轨道，反键π＊轨道（不饱和烃）；另 外还有非键轨道n（杂原子存在）。各种轨道的能 级不同，如图9-2所示。
相应的外层电子和价电子有三种：σ电子、π电子和n 电子。 通常情况下，电子处于低的能级（成键轨道和非键轨道）。 当用合适能量的紫外光照射分子时，分子可能吸收光的能量， 而由低能级跃迁到反键*轨道。在紫外可见光区，可形成下 列几种跃迁类型：
当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会 发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带。
10 4
在共轭体系中， π→π＊跃迁产生的吸收带又称为K （Konjugation）带。
K带 （ π→π＊ ）的特点：强度大，εmax› ；10 4 位置一般 在217～280nm；λmax和εmax的大小与共轭链的长短及取代 基的位置有关。
根据K带是否出现，可判断分子中共轭体系的存在情况。在 紫外光谱分析中有重要应用。
可见，有机化合物价电子一般主要有4种类型的跃迁：
n→π＊ 、 π→π＊ 、 n→σ＊ 和σ→σ＊。各种跃迁所对
应的能量大小为
n→π＊ < π→π＊ < n→σ＊ < σ→σ＊
[讨论]：
①σ→σ＊跃迁所需能量最大。σ电子只有吸收远紫外光 的能量才能发生跃迁，饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远 紫外区，吸收波长λ<200 nm，甲烷的λmax为125nm , 乙烷 λmax为135nm，只能被真空紫外分光光度计检测到；作为 溶剂使用。
有机化合物紫外吸收光谱（电子光谱）是由分子 外层电子或价电子跃迁所产生的。按分子轨道理 论，有机化合物分子中有：成键σ轨道，反键σ*轨 道；成键π轨道，反键π＊轨道（不饱和烃）；另 外还有非键轨道n（杂原子存在）。各种轨道的能 级不同，如图9-2所示。
相应的外层电子和价电子有三种：σ电子、π电子和n 电子。 通常情况下，电子处于低的能级（成键轨道和非键轨道）。 当用合适能量的紫外光照射分子时，分子可能吸收光的能量， 而由低能级跃迁到反键*轨道。在紫外可见光区，可形成下 列几种跃迁类型：
分子荧光光谱法
单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外 光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ， 与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。
样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。 检测器： 光电倍增管。
Ⅳ、荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量 分析，但是能产生荧光的物质较少，使其 应用范围较小。
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长 差值。 荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发 射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能 量。
（3）荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能 量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子 回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到 基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一 能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波 长λ1无关。
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc 即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质 的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
分子荧光产生机理
1.光谱类型
荧光光谱是物质分子 吸收紫外光后产生的分子 发射光谱。 2.跃迁类型
分子中原子的电子能 级跃迁，伴随振动能级的 跃迁。
3.分子的激发与失活
（1）分子的激发
基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射，跃迁一次到位。 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态 寿命最短的占优势。
分子荧光光谱法(原理和方法)
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
kf
k f ki kec kic
ห้องสมุดไป่ตู้
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程 （系间窜越、外转换、内转换）
的速率常数减小的因素都可使荧光增强。
根据朗伯-比尔定律
Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则F=ΦI0（1-10-εbc)=φI0(1-e-2.303εbc) 又因
e-2.303εbc=1-2.303 εbc-(-2.303 εbc)2/2!-(-2.303 εbc)3/3!
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。
法。
该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，然后在发然后在发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。
如果这种再发射约在 s 内发生，则称为荧光；若能在生，则称为荧光；若能在 s 或更长的时间后发生，则称磷光。
分子荧光光谱法就是利用这种再发射的荧光的特性和强度来对荧光物质进行定性和定量分析的。
荧光分析法的突出优点是灵敏度高，其测定下限比一般分光光度法低二至四数量级。
级。
选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，因为只有有限数量因为只有有限数量的化合物才能产生荧光。
的化合物才能产生荧光。
一、基本原理一、基本原理（一）（一） 荧光光谱的产生荧光光谱的产生荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态（或更（或更高激发态）高激发态）的任一振动能级，的任一振动能级，的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。
然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。
便产生荧光。
由于无辐射跃迁的几率大，因此分子荧光波长常常比激发光长。
因此分子荧光波长常常比激发光长。
激发光源的波长通常是激发光源的波长通常是在紫外区，在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，但更多是在可见区。
荧光光度法
荧光的定量分析
F =φf ∙ Ia ，Ia = I0 - I
I / I0 = 10-εbc
I = I0·10-εbc
Ia = I0 - I0·10-εbc = I0（1- 10-εbc ）
荧光的定量分析
Ia = I0（1 - e - 2.303εbc ） e - 2.303εbc = 1 - 2.303εbc，（εb c≤0.05）
无机化合物的分析
• 无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定 的为数不多，但与有机化合物反应生成具荧光 的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多 种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、 Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。
有机化合物的分析
• 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身 能发射荧光的很少，一般需要与某些试剂反应 后才能进行荧光分析。
以荧光强度为纵坐标，标准溶液 浓度为横坐标绘制标准曲线。
定量分析方法
▪ 标准对照法 ： 若标准曲线通过零点，就可以选择其线性 范围，用标准对照法进行测定。 Fs –F0 = 2.303 ∙φf ∙ I0 ∙εbcs （1） Fx –F0= 2.303 ∙φf ∙ I0 ∙εb cx （2）
cx = cs ∙（ Fx – F0 ）/ （Fs – F0）
OH
O
OH
OH
OH
CO CO
CO CO
荧光素
酚酞
▪ 取代基：在芳香化合物的芳香环上，进 行不同基团的取代，对该化合 物的荧光强度和荧光光谱都会 产生影响。
环境对荧光的影响
▪ 温度
温度升高 分子间碰撞次数增加 分子内能转化加速 荧光强度降低
环境对荧光的影响
溶剂及其极性 溶剂粘度下降 含有重原子的溶剂 溶剂分子与溶质形成稳定氢键
分子荧光光谱原理
分子荧光光谱的特点
信息量大 灵敏度高
荧光不受来 自激发光的本底 的干扰，灵敏度 大大高于紫外可见吸收光谱， 测量用量很，方 法简便。 荧光光谱能提供较 多的参数，如激发 谱、发射谱、峰位、 峰强度、荧光寿命、 荧光偏振度等；还 可以检测一些紫外可见吸收光谱检测 不到的时间过程。
多元素测定
原子荧光 是向各个方向 发射的，便于 制作多道仪。
分子荧光光谱新技术
前表面荧光技术
荧光物质激发后，向四面八方发射荧光。为了消除入 射光与散射光的影响，一般取与激发光成直角的方向测量 荧光。这种方法有其自身的局限性，当样品的吸光度大于 0.1 或是大浊度样品时，发射光透出会遇到很大阻碍，普 通荧光方法就已不再适用。前表面荧光方法是将入射光与 样品成 30° 56° 或 ，只对比色杯表面一层的待测物质进行 检测，样品的光照面较大，可减少样品位置的敏感性，适 用于不透明的样品，省去了很多对样品前处理的步骤，适 用于快速检测。
脂质氧化导致过 热味的产生，并 且其二级产物具 有毒害作用。 荧光强度和 氧化程度高 度相关 蛋白质氧化反 应产生一些具 有荧光特性的 物质。
荧光光谱在食品中的应用
辨别食品真伪
采用前表面技术获得饮料的总荧光光谱和同步荧光光谱，结合 主成分分析和聚类分析技术对饮料分类。这些饮料的发射光谱 和同步荧光光谱波长差为90nm，有很好的区分度。
L/O/G/O
分子荧光光谱应用原理
荧光是受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动 能级回到基态所发出的辐射，通常发生于具有刚性结构和 平面结构π 电子共轭体系的分子中。随着 π 电子共轭度和 分子平面度的增加，荧光强度随之增大，光谱相应红移， 其荧光光谱的形状和强度也相应发生变化，因此荧光光谱 是提供具有共轭结构的分子的组分分布与浓度大小的有效 测试手段之一。
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测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线Ⅰ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光
强度最大；
2.荧光光谱(或磷光)光谱 固定激发光波长(选最大激发波长),凝聚态物质发射的荧
光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线(图中曲线Ⅱ 或 Ⅲ)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
荧光量子产率（ϕ）：
ϕ
=
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关， 如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧与发射光谱之间的波长差值。发射光谱
的波长比激发光谱的长，因为振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能
量(如能级图中的λ1 ，λ2)，产生不同吸收带，但均回
到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，
产生波长一定的荧光(如λ2/ )。
基于化合物的荧光测量分析方法称为分子荧光光谱法。
一、荧光光谱法基本原理
分子的激发与失活
1. 分子的多重态
单重态 一个所有电子自旋都配对 的分子的电子状态。大多数有机 物分子的基态是单重态。当基态 一对电子中的一个被激发到较高 能级，其自旋方向不会立刻改 变，分子仍处于单重态。
三重态 有两个电子的自旋不配对 而平行的状态。激发三重态能量 较激发单重态低。
c. 镜像规则（位型） 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反的 跃迁亦然。
三、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1为禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光速度很慢： 10-4～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光) 激发的光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),凝聚态物质发射的荧光
减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。
辐射跃迁:
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度 大，速率常数kf为106~109 s-1。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态(多
为 S1→ S0跃迁)，发射波长为λ2/的荧光；10-7～10-9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长更
长： λ2/ > λ2 > λ1 ；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 （ T1 → S0跃迁）；
第四章§4 荧光光谱
Molecular fluorescence spectroscopy
光致发光和分子荧光光谱法 荧光光谱法基本原理 荧光分析仪器和荧光法的应用
光致发光（Photoluminescence）:
荧光和磷光是分子吸收光成为激发态分子，在返回基态 时的发光现象，称为光致发光。 特点： ★灵敏度高，检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★线性范围宽； ★选择性比吸收光谱法好，因为能产生紫外可见吸收的分子 不一定发射荧光或磷光； ★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线Ⅰ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光
强度最大；
2.荧光光谱(或磷光)光谱 固定激发光波长(选最大激发波长),凝聚态物质发射的荧
光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线(图中曲线Ⅱ 或 Ⅲ)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
荧光量子产率（ϕ）：
ϕ
=
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关， 如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧与发射光谱之间的波长差值。发射光谱
的波长比激发光谱的长，因为振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能
量(如能级图中的λ1 ，λ2)，产生不同吸收带，但均回
到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，
产生波长一定的荧光(如λ2/ )。
基于化合物的荧光测量分析方法称为分子荧光光谱法。
一、荧光光谱法基本原理
分子的激发与失活
1. 分子的多重态
单重态 一个所有电子自旋都配对 的分子的电子状态。大多数有机 物分子的基态是单重态。当基态 一对电子中的一个被激发到较高 能级，其自旋方向不会立刻改 变，分子仍处于单重态。
三重态 有两个电子的自旋不配对 而平行的状态。激发三重态能量 较激发单重态低。
c. 镜像规则（位型） 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反的 跃迁亦然。
三、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1为禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光速度很慢： 10-4～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光) 激发的光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),凝聚态物质发射的荧光
减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。
辐射跃迁:
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度 大，速率常数kf为106~109 s-1。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态(多
为 S1→ S0跃迁)，发射波长为λ2/的荧光；10-7～10-9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长更
长： λ2/ > λ2 > λ1 ；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 （ T1 → S0跃迁）；
第四章§4 荧光光谱
Molecular fluorescence spectroscopy
光致发光和分子荧光光谱法 荧光光谱法基本原理 荧光分析仪器和荧光法的应用
光致发光（Photoluminescence）:
荧光和磷光是分子吸收光成为激发态分子，在返回基态 时的发光现象，称为光致发光。 特点： ★灵敏度高，检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★线性范围宽； ★选择性比吸收光谱法好，因为能产生紫外可见吸收的分子 不一定发射荧光或磷光； ★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。