赵百慧 - 上海交通大学生命科学技术学院

国家自然科学基金委员会生命科学部2014年度青年基金项目第26卷第12期2014年12月生命科学Chinese Bulletin of Life SciencesV ol. 26, No. 12Dec., 2014文章编号：1004-0374(2014)12-1342-62国家自然科学基金委员会生命科学部2014年度青年基金项目项目名称申请人依托单位1微生物学植物乳杆菌激活NHE8信号通路并在炎症性肠病中发挥保护作用可能的机制探究刘畅上海交通大学南极乔治王岛土壤中产蛋白酶细菌和胞外蛋白酶的多样性以及细菌新种属和新型适冷蛋白酶资源周明扬齐鲁工业大学II类NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶的功能与进化机制研究王鹏安徽师范大学黄河三角洲盐生植物内生菌多样性差异及功能基因分析夏志洁山东师范大学活性污泥中稀有微生物类群BFB的多样性及其环境响应研究郗丽君中国石油大学(华东)北冰洋产多糖细菌多样性及多糖特性张炳照广州中国科学院先进技术研究所青海油田原油与采出液水相微生物差异机制及原油来源菌种资源多样性研究蔡曼中国科学院微生物研究所一个特殊新疆鹰嘴豆根瘤菌种群自然进化规律及其进化机制的研究张俊杰郑州轻工业学院新疆藜科5种盐生植物内生细菌多样性及耐盐促生菌株评价王宏飞中国科学院新疆生态与地理研究所红树林生态系统中弗兰克氏菌的多样性及其数量分布研究刘敏中国热带农业科学院中国发网菌科黏菌分类及分子系统学研究张波吉林农业大学中国座坚壳属真菌的分类与分子系统学研究马海霞中国热带农业科学院基于转录组测序的腹黏菌亚纲和发网菌亚纲黏菌核糖体序列测定及分子系统学研究亓宝吉林农业大学中国链格孢菌大孢子种的形态学与分子系统学研究邓建新长江大学中国假网衣科地衣系统分类学研究张璐璐山东师范大学松乳菇多糖(LDG-A)调控巨噬细胞免疫应答活性的分子机制侯怡铃西华师范大学茶树病原真菌和内生真菌的多样性及其分布规律刘芳中国科学院微生物研究所丝状子囊菌ITS分子进化研究李熠福建农林大学武夷山国家自然保护区凋落枯枝暗色丝孢真菌分类研究马立国山东省农业科学院中国菌寄生属资源、分类及该属的分子系统学研究曾昭清中国科学院微生物研究所不同生境条件下齿瓣石斛不同生长时期菌根真菌多样性研究邵士成中国科学院西双版纳热带植物园中国担子地衣的分类及分子系统研究王欣宇中国科学院昆明植物研究所中国珀扎若拉属和偏脚菇属分类及分子系统学研究何晓兰四川省农业科学院裂丝盖伞复合群的隐存多样性及生物地理学研究范宇光长白山科学研究院疫霉属(Phytophthora)DNA条形码的选择与评价兰成忠福建省农业科学院毛醌素生物合成途径解析及其调控殷华中国科学院天津工业生物技术研究所阴沟肠杆菌SDM中2,3-丁二醇手性形成及代谢调控机制研究李理想上海交通大学产碱假单胞菌中龙胆酸代谢直接水解途径的研究刘琨上海交通大学沙门氏菌DNA磷硫酰化修饰蛋白复合物的功能研究成秋香上海交通大学聚醚类盐霉素的生物合成机理解析姜春艳上海交通大学寡糖转运在嗜碱芽孢杆菌 N16-5 半纤维素利用中的作用研究宋亚囝天津科技大学SpTrz2调控粟酒裂殖酵母线粒体介导的细胞凋亡机制的研究商巾杰南京师范大学DOI: 10.13376/j.cbls/2014186第12期1343国家自然科学基金委员会生命科学部2014年度资助项目铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂对环境胁迫条件的响应机制研究姜天翼山东建筑大学开发适用于链霉菌的新型诱导表达系统王为善中国科学院微生物研究所激活蛋白AP1参与茉莉酸甲酯诱导灵芝酸合成的调控机理任昂南京农业大学代谢产物调控碳降解物阻遏作用和蛋白质组资源分配尤从慧深圳大学温度对法夫酵母MK19虾青素合成调控机制的研究苗莉莉中国科学院微生物研究所高山被孢霉脂质合成与苯丙氨酸代谢相关性及调控机制研究王鸿超江南大学蛋白乙酰化修饰对天蓝色链霉菌发育分化的调控机制研究赵维中国科学院上海生命科学研究院枯草芽孢杆菌解聚酶YwtD调节γ-聚谷氨酸链长的结构基础研究曾菊梅中国科学院成都生物研究所大肠杆菌表达异源蛋白质时的多态性研究赵云中国科学院生物物理研究所全局性调控子GacA对假单胞菌L-肉碱生物合成的调控机制研究黄娇芳中国科学院上海高等研究院hmsT 3'非翻译区介导的mRNA稳定性研究朱慧中国医学科学院病原生物学研究所微生物细胞外还原制备纳米粒子过程中的电子传递机制研究王敏聊城大学基于次级代谢产物活性和结构的重楼内生菌多样性及与宿主方晓梅中国医学科学院医药生物技术研究所植物相关性研究肠出血性大肠杆菌效应分子NleF通过抑制caspase-4参与其致病宋婷中国人民解放军军事医学科学院的分子机制研究微生物菊粉酶C末端结构域的功能研究刘光磊中国海洋大学谷氨酰胺蓝靛素合成酶的催化机制研究秦华中国科学院微生物研究所槐糖脂的结构修饰及其联合依托泊苷对食管癌细胞增殖马晓静合肥工业大学的影响和机制研究氨基糖苷类抗生素核糖开关翻译调控机制的深入研究张静复旦大学多烯聚酮细胞色素P450的区域及立体特异性研究季俊杰中国科学院过程工程研究所Thienodolin中噻唑并吲哚环的生物合成机制研究马宏敏武汉大学维生素K2合成关键酶的结构解析与基于结构的抑制剂设计徐铮南京工业大学集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的功能研究李志敏中国科学院青岛生物能源与过程研究所沙雷氏菌灵菌红素的前体MBC合成途径中相关蛋白结构解析冉婷婷南京农业大学及反应机制的研究粘细菌新型β-1,3-葡聚糖酶的催化机制研究黄彦南京农业大学恶臭假单胞菌YL19产2种环脂肽的结构鉴定及合成机制研究孙燕陕西师范大学Bacillus subtilis双精氨酸转运系统中信号肽定向识别的分子机制崔文璟江南大学电子歧化转氢酶NfnAB的分子进化及结构与功能关系的研究黄海燕山东省医学科学院极端嗜热细菌Caldicellulosiruptor中双功能纤维素水解酶吕明中国科学院青岛生物能源与过程研究所作用机制的研究里氏木霉内切葡聚糖酶EGI催化纤维素水解的机理研究宋乡飞中国科学院青岛生物能源与过程研究所毕赤酵母转录因子Fhl1p功能鉴定及其促进外源蛋白表达的机理梁书利华南理工大学莱茵衣藻膜蛋白Cr-FAX在脂肪酸跨叶绿体膜运输过程中的作用研究李楠楠西南大学镉胁迫下MAPKs对通道蛋白的调控机理张丽琳天津大学构巢曲霉Calcineurin和CchA参与菌丝极性生长的分子调控机制王莎湖州师范学院blaOKP β-内酰胺酶耐药基因进化研究邹立扣四川农业大学多基因协同调控里氏木霉高效分泌表达蛋白的研究苏小运中国农业科学院饲料研究所潘多拉菌中氯苯代谢的两个基因簇的转录调控研究晁红军中国科学院武汉病毒研究所ClpX ATPase在蜡样芽孢杆菌生物防治小麦土传病害中的作用张颖河南大学酿酒酵母耐受玉米秸秆水解液抑制物基因的功能鉴定刁刘洋中国科学院上海生命科学研究院病原细菌受体激酶PcrK特异识别寄主植物激素分子信号的机制王芳芳中国科学院微生物研究所深海链霉菌SCSIO ZJ46来源的抗菌环肽desotamides的生物合成研究李青连中国科学院南海海洋研究所稻瘟菌可长距离移动的效应蛋白MoSDT1在与水稻互作中杨静云南农业大学的分子鉴定寒地根瘤菌III型效应因子对大豆宿主特异性的影响辛大伟东北农业大学1344生命科学第26卷RAS-2调控粗糙脉孢菌生物钟的分子机制研究胡启文中国人民解放军第三军医大学固氮施氏假单胞菌非编码RNA crcZ和crcY在碳代谢抑制中战嵛华中国农业科学院生物技术研究所的协同作用机制利用CRISPR/Cas系统建立新型乳酸菌基因组编辑技术郭婷婷山东大学纳豆激酶高效分泌表达系统的构建与最适pH偏酸性改造刘中美江南大学普鲁兰酶的理性设计及其在枯草芽孢杆菌中的分泌表达研究谢能中广西科学院建立土曲霉高效基因打靶平台的研究黄雪年中国科学院青岛生物能源与过程研究所大肠杆菌人工合成功能寡糖2-岩藻化乳糖的系统研究黄笛南开大学组合调控解淀粉芽孢杆菌胞内辅因子NADH/NAD+强化2,3-丁二醇杨套伟江南大学生物合成的分子机制磷霉素生物合成中Fom3催化的sp3碳原子甲基化机制研究陈允亮中国科学院上海生命科学研究院肠杆菌中以葡萄糖为原料利用苯丙酮酸途径合成苯乙醇张海波中国科学院青岛生物能源与过程研究所的代谢调控研究基于微流控液滴的放线菌高通量筛选培养和分离何湘伟北京林业大学基于双底物平行标记实验的13C代谢通量分析的新方法姚瑞莲上海交通大学微流控芯片上微生物培养的溶氧梯度控制方法与基因表达研究甘明哲中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所基于单细胞拉曼分选的新型酵母突变株筛选方法研究王婷婷中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞拉曼技术在微生物群落动态监测中的方法学研究黄适中国科学院青岛生物能源与过程研究所新型宿主免疫调节抗菌化合物的作用机制研究崔金辉中国科学院微生物研究所根际微生物在壶瓶碎米荠超积累硒过程中的作用及其机制袁林喜中国科学技术大学Aquamicrobium sp. hun6降解皮考啉酸及其衍生物的机理研究吴志国天津科技大学喜温嗜酸硫杆菌中sigma因子对硫代谢和环境压力适应性的调控陈林旭山东大学铜绿假单胞菌胞外多糖和鼠李糖脂交互调控的分子机理王世伟中国科学院微生物研究所一株鞘脂菌多环芳烃降解代谢网络的转录组学研究丁国春中国农业大学天然来源腐殖质作为电子媒介体促进多氯联苯生物降解的研究章春芳浙江大学双启动子级联调控荧光蛋白基因表达载体的构建及环境监测应用李琴中国环境科学研究院Sphingobium sp.MEA3-1降解烷基取代苯胺类化合物2-甲基-6-乙基侯颖河南科技大学苯胺分子机理研究芽孢杆菌B1菌株降解4-羟基苯甲酸途径中NIH重排反应研究冯昭中江苏师范大学磷酸激酶slt2调控黄曲霉毒素产生的分子机制张峰福建农林大学中国桦木属植物外生菌根真菌多样性及分布格局研究王琴辽宁省林业科学研究院海洋枯草芽孢杆菌C01抗菌物质合成调控的信号通路研究穆大帅山东大学沉水植物与磷细菌的联合对水-沉积物间磷循环的作用规律研究李海峰河南工业大学生物阴极加速氯代烃污染物还原脱氯及作用机制李智灵哈尔滨工业大学菌株Pigmentiphaga sp.H8对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解陈凯南京农业大学及脱溴机制大兴安岭地区火山口湖好氧不产氧光合菌群落多样性及系统分类李爱华中国科学院微生物研究所海洋弧菌菌群感应信号分子N-acyl homoserine lactones对NK 细胞付凯飞中国人民解放军海军总医院的调控作用研究基于噬菌体随机肽库研制新型酿酒酵母表面吸附剂张海燕河南大肠道微生物组在转基因鲤糖代谢中的作用及调控机制研究颜庆云中国科学院水生生物研究所特殊生境中地衣内生菌次生代谢产物及其抗辐射作用研究元超中国医学科学院药用植物研究所基于“质粒宏基因组”研究饲料中铜、锌、砷对猪粪细菌耐药邓祖军广东药学院质粒的选择与转移微生物协同利用石油烃作用的机理研究胡冰北京大学氧调控奥奈达希瓦氏菌降解偶氮染料的机理研究杨玉义中国科学院武汉植物园假诺卡氏菌CB1190降解四氢呋喃的代谢机理及关键酶研究方倜中国科学院武汉病毒研究所Cupriavidus basilensis B-8对木质素降解机制的研究石岩河南师范大学第12期1345国家自然科学基金委员会生命科学部2014年度资助项目嗜酸微生物协同作用浸出黄铁矿的分子机制韩一凡中国科学院天津工业生物技术研究所c-di-GMP受体Filp与PXO_02715蛋白互作及其对水稻白叶枯杨凤环中国农业科学院植物保护研究所病菌毒性的共调控作用结核分枝杆菌LrpA蛋白调控基因转录的机制研究宋宁宁中国农业科学院哈尔滨兽医研究所控制致病性大肠杆菌DegP表达的调控蛋白及其调控机制研究李兆利中国农业科学院哈尔滨兽医研究所水貂铜绿假单胞菌强弱毒菌株差异表达基因的鉴定及其与毒力齐静山东省农业科学院的相关性研究一株糖霉菌属放线菌抑菌活性成分及作用机理研究张越锋塔里木鱼类病原菌迟钝爱德华氏菌功能RNA组研究杨敏俊上海人类基因组研究中心福氏志贺菌2a新毒力蛋白Pic细胞毒性的分子机理研究张俊琪复旦大学巴尔通体效应蛋白BepC与宿主p53蛋白互作诱导细胞凋亡机制研究袁聪俐上海交通大学malS-5'UTR调节伤寒沙门菌耐酸力和侵袭力的作用机制研究张盈江苏大学噬菌体裂解酶细胞壁结合域抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成杨航中国科学院武汉病毒研究所的机理与应用结核分枝杆菌耐药相关非编码基因区的系统发现和耐药新机制研究张泓泰中国科学院生物物理研究所血红素氧化酶独特的ND9/14位点促进空肠弯曲菌感染定植张睿中国人民解放军第三军医大学及机制研究头束霉及其近似属的分子系统学分析耿月华河南农业大学水稻纹枯病菌诱导水稻程序化死亡的作用机制郑爱萍四川农业大学SreE介导的铁调节对皮炎外瓶霉形态发生、药物敏感性高露娟复旦大学及致病性的影响钙信号系统介导白念珠菌形态发生分子机制的研究喻其林南开大学隐球菌转录因子Frt1功能和调控机理研究刘同宝山东大学烟曲霉Rho1蛋白对其细胞壁生物学特性、致病力及诱发宿主田曙光中国人民解放军军事医学科学院天然免疫应答的调控机制研究白念珠菌开关蛋白S?1和S?2在菌丝发育和致病过程中的调控戴宝娣中国科学院上海生命科学研究院机制研究昆虫RNAi抗病毒免疫途径调控南方水稻黑条矮缩病毒与不同贾东升福建农林大学介体间存在亲和性差异的机制研究细胞自噬在伪狂犬病毒复制感染中的作用孙明霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所口蹄疫病毒基因组3'非编码区通过DDX21诱导I型干扰素产生杨德成中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的分子机制GCRV内衣壳的自组装及与细胞相互作用机制研究张付贤中国科学院武汉病毒研究所杆状病毒核心基因gp41在BV和ODV形成过程中的作用机制研究沈姝中国科学院武汉病毒研究所质型多角体病毒衣壳蛋白VP5参与病毒RNA复制机制的研究杨洁武汉大学杆状病毒ODV表面刺突的组分鉴定和功能研究侯典海中国科学院武汉病毒研究所蝙蝠正呼肠孤病毒对实验动物的致病性研究杨兴娄中国科学院武汉病毒研究所应激颗粒对新城疫病毒复制与先天性免疫的调控机制研究孙英杰中国农业科学院上海兽医研究所日本乙型脑炎病毒逃逸神经系统CD8+ T细胞免疫清除的机制刘珂中国农业科学院上海兽医研究所猪瘟兔化弱毒疫苗株适应家兔的关键基因定位李永锋中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基于HIV-1病毒感染必需因子Vif和其相互作用宿主蛋白的高通量周小红吉林大学小分子药物筛选体系Hedgehog信号通路在人呼吸道合胞病毒感染过程中作用机制研究邹罡中国科学院上海巴斯德研究所纤毛杆影响嵌合型腺病毒感染T淋巴细胞效率的机制研究张文峰广东药学院I型单纯疱疹病毒UL2蛋白核质转运信号的鉴定及其在病毒蔡铭升广州医科大学感染中功能的研究流感NS1蛋白通过改变细胞骨架帮助病毒释放姜威中国科学院微生物研究所内质网蛋白SEC62调控登革病毒感染的新机制研究柳恒中国科学院上海生命科学研究院1346生命科学第26卷PI3K/Akt信号通路在DHEA衍生物抗EV71中的作用研究魏艳红湖北工业大学中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白N-端结构域及S1亚基的结构逯光文中国科学院微生物研究所与功能研究麻疹病毒N蛋白诱导细胞自噬及其分子机理研究刘鑫武汉大学人腺病毒E1B55K与E4orf6蛋白相互作用的型特异性研究及应用邹小辉中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所乙型脑炎病毒入侵环节中包膜糖蛋白关键氨基酸残基和肽段刘海滨中国科学院武汉病毒研究所的识别与功能分析受MicroRNA调控的重组EV71在恶性神经胶质瘤模型上的溶瘤研究张晓玮中国科学院武汉病毒研究所肠道病毒71型(EV71)诱导线粒体自噬的分子机制研究王蓓中国医学科学院病原生物学研究所来自丙型肝炎亚基因组复制子的外体活化炎症小体的机制研究徐咏芬中国科学院上海巴斯德研究所霍乱弧菌分型噬菌体VP2吸附和注入分子机制的研究徐嘉良北京工商大学同一原噬菌体在两株希瓦氏菌中的作用及H-NS对其切离调控的研究刘晓晓中国科学院南海海洋研究所ORF48催化铜绿假单胞菌噬菌体PaP1甲基化的作用与机制卢曙光中国人民解放军第三军医大学猪肺炎支原体果糖二磷酸醛缩酶的致病机制研究华利忠江苏省农业科学院靶向单基因模型构建与新型小分子化合物CB抗衣原体分子包小峰南通大学作用机制研究2植物学龙胆属植物中雌雄异位和雌雄异熟的功能分异和进化式样研究李肖夏中国林业科学研究院百合属的花进化和传粉生态学刘长秋中国科学院昆明植物研究所拟南芥RSU3调控花粉管顶端生长的分子机理周利明河北联合大学水稻CRC2蛋白在减数分裂联会复合体形成中的分子机理研究纪剑辉淮阴师范学院玉米胚胎发生相关基因EMB4的功能研究李翠玲山东大学双靶向半胱氨酸蛋白酶抑制剂NtCYS调控胚柄细胞程序性死亡赵鹏武汉大学的分子机理研究野生大豆/栽培大豆胚胎发生的比较研究及其重要经济性状刘媛中国科学院东北地理与农业生态研究所的分子调控机制探讨暖温带不同功能型植物的水分利用策略及对降水变化的响应杜宁山东大学TBL在植物细胞壁多糖乙酰化修饰中的功能研究刘香玲中国科学院遗传与发育生物学研究所一个新的水稻每穗粒数主效QTL Gn2的图位克隆和功能分析朱金燕江苏省农业科学院拟南芥MUP24.5基因维持种子黏液质结构的功能研究于丽中国科学院青岛生物能源与过程研究所拟南芥AtFH14与微丝及微管骨架的相互作用机制王姣姣北京师范大学中国紫珠属(唇形科)的分类修订马仲辉广西大学中国千金藤属(防己科)的分类学研究张紫刚南京农业大学虾脊兰属及其近缘类群(兰科)的系统分类学研究翟俊文福建农林大学广义九里香属的分类修订及系统学研究牟凤娟西南林业大学中国山矾属(山矾科)的分类学修订刘博中央民族大学中国蛛毛苣苔属的分类学研究许为斌广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所爵床科恋岩花属的系统位置及其物种分化研究高春明滨州学院中国淡水隐藻类的分类学研究夏爽中南民族大学中国海洋绿藻门刚毛藻目的分子系统发育学及其DNA条形码库构建黄冰心汕头大学木腐菌对粗木质残体附生苔藓植物多样性的影响及其机制闫晓丽中国科学院成都生物研究所木灵藓属(Orthotrichum hedw.)的形态演化、系统发育和分类王庆华中国科学院植物研究所拟蕨藓属的分类修订及其与近缘属的关系于宁宁中国科学院植物研究所中国细鳞苔属(Lejeunea)植物的分类修订韦玉梅广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所耐旱复苏植物旋蒴苣苔的分子谱系地理学研究李晶首都师范大学小叶栒子复合体谱系地理及物种界定研究李飞飞中央民族大学卫矛科南蛇藤属(Celastrus L.)分子系统学与生物地理学研究沐先运北京林业大学国家自然科学基金委员会生命科学部2014年度资助项目第12期1347基于RAD-Tag技术：特提斯孑遗洲际间断分布植物穗菝葜祁哲晨浙江理工大学(菝葜科)的亲缘地理学研究伞形科山芹属的系统发育与生物地理学研究廖晨阳四川大学世界凤尾蕨属及凤尾蕨亚科的系统学研究张良中国科学院成都生物研究所中国—喜马拉雅特有属蓝钟花属的系统进化与生物地理研究周卓中国科学院昆明植物研究所花柱二型性水生植物莕菜的适应性遗传进化研究岳晓丽湖北工业大学番荔枝科独子木属的分子系统发育研究：探索高分化速率薛彬娥中国科学院华南植物园与性状演化及生物地理的相关性东亚特有药用植物玄参复合种系统发育和物种形成机制研究陈川杭州植物园植物RPW8-NBS-LRR类抗病信号传导基因的起源、演化邵珠卿南京大学及功能化机制水稻亚种间新合成四倍体早期世代基因组变异徐春明东北师范大学特异响应冷胁迫的DREB1/CBF基因亚家族在陆生植物中的演化康菊清陕西师范大学黑种草属植物中AP3-3基因表达量的调控进化及其对花瓣形态张睿中国科学院植物研究所多样性的贡献栽培大豆茎杆直立驯化性状的分子机制研究董阳中国科学院植物研究所南果梨花发育分子机制研究张吉斯鞍山师范学院蕨类植物叶绿体RNA编辑及其适应性进化研究高磊中国科学院。

第43 卷第 1 期2024 年1 月Vol.43 No.119~31分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）生物光学成像技术在组织穿透性方面的研究进展张玉敏，王富，林俐*，叶坚*（上海交通大学生物医学工程学院，上海200030）摘要：光学成像因灵敏度高、特异性强、无电离辐射、低成本、丰富的候选探针、可获取细胞/分子水平信息和可实时检测等优势，在临床前的基础研究和临床诊断与治疗领域具有巨大的应用价值。

但由于生物组织对光子的高散射与高吸收特性，光学成像的组织穿透深度通常非常有限，很大程度上限制了其在深部病变活体生物医学检测方面的应用，研究者们对此做了大量的努力。

随着科学技术的发展，光学技术的组织检测深度已覆盖微米到厘米甚至分米以上的范围，在生物检测、成像、诊断、术中导航等领域展现出了广阔的应用前景。

该文从常见的光学成像技术入手，对荧光成像、生物/化学发光成像、光声成像以及拉曼成像在组织穿透性方面的研究进展进行了总结与讨论，并对这些光学成像技术未来在组织穿透方面的主要研究方向进行了展望。

关键词：生物光学成像；组织穿透性；深穿透拉曼光谱中图分类号：O657.3；R318文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2024）01-0019-13Advances in Tissue Penetration by Optical Imaging TechniquesZHANG Yu-min，WANG Fu，LIN Li*，YE Jian*（School of Biomedical Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai　200030，China）Abstract：Optical imaging has great potential for application in the field of preclinical basic research and clinical diagnostics and therapeutics，due to its advantages of high sensitivity and specificity，non-ionizing radiation，simplicity of equipment，low cost，rich nanoprobe candidates，ability to ob⁃tain cellular/molecular level information and real-time acquisition capability.However，due to the nature of high scattering and absorption of photons in biological tissues，optical imaging is usually limited by the shallow tissue penetration depth，which largely limits its usage for in vivo biomedical detection of deep-seated lesions. A lot of efforts have been done by researchers to overcome this is⁃sue.This paper summarizes and discusses the progress of various common optical imaging tech⁃niques，such as fluorescence imaging，bioluminescence/chemiluminescence imaging，photoacous⁃tic imaging，and Raman imaging，in terms of their research progress in tissue penetration. With the development of science and technology，the tissue detection depths of optical modalities have cov⁃ered a range from microns to centimeters or even to decimeters，and have shown broad application prospects in the fields of biological detection，imaging，diagnosis，intraoperative navigation，and so on. Finally，the main directions of future research of these optical imaging techniques in tissue penetration are prospected.Key words：optical imaging；tissue penetration；deep Raman spectroscopy近一个世纪以来，光在生物组织中的传播与分布，以及光与生物组织的相互作用引起了科学家们的广泛关注，引发了光学方法在生物医学检测与成像领域的研究热潮。

专利名称：黑灵芝真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用专利类型：发明专利
发明人：周选围,孔应予,丛蔚然
申请号：CN201410009107.2
申请日：20140109
公开号：CN103739684A
公开日：
20140423
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种生物基因工程技术领域的黑灵芝真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用，该黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

本发明对该重组真菌免疫调节蛋白基因表达于大肠杆菌获得高表达量目的蛋白，并且证明其对乳腺癌细胞具有很好的凝集作用。

这对于利用基因工程的方法大量生产重组真菌免疫调节蛋白与利用该蛋白开发成一种新型的抗肿瘤制剂的应用提供了一种新的方向，可广泛用于保健食品及生物医药领域。

申请人：上海交通大学
地址：200240 上海市闵行区东川路800号
国籍：CN
代理机构：上海交达专利事务所
更多信息请下载全文后查看。

上海交通大学通识教育核心课程选课手册（2018-2019-1,2018级）教务处2018年9月目录目录............................. 错误!未定义书签。

说明........................... 错误!未定义书签。

一．通识教育与通识教育核心课程.... 错误!未定义书签。

二．通识教育核心课程的分类........ 错误!未定义书签。

三．通识教育核心课程学分分布...... 错误!未定义书签。

四．通识教育核心课程的选课........ 错误!未定义书签。

课程介绍..................... 错误!未定义书签。

交响音乐鉴赏......................................错误!未定义书签。

中西乐理及其应用..............................错误!未定义书签。

美国的文化与历史..............................错误!未定义书签。

世界文化史..........................................错误!未定义书签。

大学语文..............................................错误!未定义书签。

历史视野下的美国文化......................错误!未定义书签。

马克思哲学经典著作导读 ..................错误!未定义书签。

唐诗宋词人文解读..............................错误!未定义书签。

艺术、媒介与创造性思维 ..................错误!未定义书签。

环境与可持续发展..............................错误!未定义书签。

民族主义与族群政治..........................错误!未定义书签。

职业生涯发展与规划..........................错误!未定义书签。

生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第２期㊀２１４~２２２ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２１￣０１￣１４ꎻ接受日期:２０２１￣０１￣２７㊀基金项目:上海市浦东新区科技发展基金(ＰＫＸ２０１９￣Ｓ０９)ꎮ㊀联系方式:张博慧Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｏｙａｏｚｈｄ＠１６３.ｃｏｍꎻ∗通信作者许俊彦Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｕｎｙａｎ.ｘｕ＠ｄｒａｇｏｎｂｏａｔｂｉｏ.ｃｏｍ利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化张博慧ꎬ㊀贾戴辉ꎬ㊀程倩ꎬ㊀许俊彦∗ꎬ㊀邵喆ꎬ㊀黄应峰宝船生物医药科技(上海)有限公司药物分析部门ꎬ上海２０１２０３摘㊀要:为了优化利用Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)酶解单克隆抗体中Ｎ糖的方法ꎬ应用本公司生产的单抗对ＰＮＧａｓｅＦ酶的酶解条件进行优化ꎬ包括缓冲液ｐＨ㊁酶种类㊁仪器㊁酶解程度㊁变性缓冲液及酶加入量等ꎬ总结酶解条件对Ｎ糖谱结果的影响ꎮ结果显示ꎬ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中可以避免某些单抗在低ｐＨ酶解时Ｇ０Ｆ转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ并可改善峰型ꎻ快速ＰＮＧａｓｅＦ和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率ꎻＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径色谱柱能提高分离度ꎻ不完全酶解影响Ｎ糖含量结果ꎮ研究结果表明ꎬ采用优化的酶解条件可快速㊁有效的酶解单抗上的Ｎ糖ꎬ使Ｎ糖谱结果准确可靠ꎬ为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段ꎮ关键词:单克隆抗体ꎻＮ糖ꎻＰＮＧａｓｅＦ酶ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２１.０００５中图分类号:Ｑ８１９ꎬＲ９７㊀㊀㊀文献标识码:ＡＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙＰＮＧａｓｅＦ㊀ＺＨＡＮＧＢｏｈｕｉꎬＪＩＡＤａｉｈｕｉꎬＣＨＥＮＧＱｉａｎꎬＸＵＪｕｎｙａｎ∗ꎬＳＨＡＯＺｈｅꎬＨＵＡＮＧＹｉｎｇｆｅｎｇＤｒｕｇＡｎａｌｙｓｉｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔꎬＤｒａｇｏｎｂｏａｔＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ.ꎬＬｔｄꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１２０３ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅａｍｅｔｈｏｄｏｆｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｕｓｉｎｇＰＮＧａｓｅＦꎬａｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒｐＨꎬｅｎｚｙｍｅｔｙｐｅꎬｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓꎬｄｅｇｒｅｅｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓꎬｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｓｅｖｅｒａｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｉｎｇｉｎｔｏ１ˑＰＢＳｃｏｕｌｄａｖｏｉｄｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅｍＡｂｓｆｒｏｍＧ０ＦｔｏＧ０Ｆ￣ＧＮａｔｌｏｗｐＨａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｅａｋｓｈａｐｅ.ＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｂｕｆｆｅｒｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ.ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＵＰＬＣａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈ１.７μｍｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ.ＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔ.ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＰＮＧａｓｅＦｃａｎｑｕｉｃｋｌｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｈｙｄｒｏｌｙｚｅｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬｗｈｉｃｈｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｄｒｕｇｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎻＮ￣ｇｌｙｃａｎꎻｐｅｐｔｉｄｅＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊀㊀Ｎ糖基化修饰是单克隆抗体药物普遍存在的翻译后修饰现象ꎮ目前研究表明ꎬ糖基化修饰与单克隆抗体药物的功能㊁药物代谢㊁免疫原性等关系密切[１￣３]ꎬ如核心岩藻糖缺失能显著增强ＡＤＣＣ效应[４]ꎬ半乳糖能够增强ＣＤＣ活性[５]ꎻ末端Ｎ￣乙酰葡萄糖影响抗体药物半衰期[６￣７]ꎻ唾液酸化糖型具有抗炎症功能[８]ꎻα(１￣３)半乳糖和ＮＧＮＡ型唾液酸易引起免疫原性[９]等ꎮＮ糖对抗体结构也具有重要作用ꎬ能稳定ＣＨ２结构域ꎬ去糖抗体稳定性会变差ꎬ更易发生去折叠和聚集[１０]ꎮＮ糖类型和含量受细胞株㊁培养条件㊁纯化和储存[１１￣１３]等过程的影响ꎬ因此在单抗药物细胞筛选㊁工艺优化㊁纯化㊁产品放行和稳定性考察中控制和监测Ｎ糖含量ꎬ保证单抗药物安全性㊁有效性等尤为重要ꎮ目前检测Ｎ糖的方法主要有亲水色谱－荧光法[１４]㊁ＣＥ￣ＬＩＦ法[１５￣１６]和质谱法[１７￣１８]. All Rights Reserved.等ꎮ其中亲水色谱－荧光法是目前应用最为广泛的方法ꎬ该方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的Ｎ糖链ꎬ再用标记试剂进行衍生化ꎬ采用亲水色谱柱分离ꎬ荧光检测器检测ꎮ由于ＰＮＧａｓｅＦ几乎能水解所有哺乳动物细胞产生的Ｎ糖ꎬ因此得到广泛应用[１９]ꎮ传统的Ｎ糖谱检测方法一般耗时较长ꎬ目前快速Ｎ糖样品制备的试剂盒已经商品化ꎬ大幅提高了Ｎ糖的检测效率ꎬ但是通常价格昂贵ꎮ而应用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶与传统制备过程相组合成为提高检测效率和降低检测成本的一种选择ꎮ本研究基于亲水色谱－荧光法ꎬ针对ＰＮＧａｓｅＦ水解条件进行了优化ꎬ发现和解决了酶解过程中易对结果产生影响的一些因素ꎬ建立了高效准确的Ｎ糖检测方法ꎬ以期为Ｎ糖的检测研究提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀供试品㊀本研究所用ｍＡｂ１㊁ｍＡｂ２和ｍＡｂ２￣Ｆ均为宝船生物医药科技(上海)有限公司生产的ＩｇＧ１型单克隆抗体ꎮ１.１.２㊀试剂和耗材㊀Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊁快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)及变性缓冲液(５ˑ)均购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ公司ꎻ无水乙醇㊁甲酸铵㊁乙酸㊁二甲基亚砜(ＤＭＳＯ)㊁２￣氨基苯甲酰胺(２￣ＡＢ)㊁氰基硼氢化钠㊁β￣巯基乙醇等均购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ甲酸和乙腈购自Ｆｉｓｈｅｒ公司ꎻＰＢＳＢｕｆｆｅｒ(１ˑ)购自上海生工ꎻ１０ｋＤ超滤离心管购自Ｍｅｒｃｋ公司ꎻ１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液和非涂层－熔融石英毛细管购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ纯化柱(ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎＴＭＳＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ)购自Ｐｒｏｚｙｍｅ公司ꎻ色谱柱ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ(１.７μｍꎬ２.１ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ色谱柱ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎ(２.７μｍꎬ４.６ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎮ１.１.３㊀主要仪器设备㊀高效液相系统(ＨＰＬＣꎬ１２６０)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎻ超高效液相系统(ＵＰＬＣꎬＨ￣ＣｌａｓｓＰｌｕｓ)购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)和数据处理软件(ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒ)均购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎻ毛细管电泳仪(ＣＥꎬＰＡ８００Ｐｌｕｓ)购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ真空离心浓缩干燥仪(ＲＶＣ２￣２５)购自德国Ｃｈｒｉｓｔ公司ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀蛋白沉淀和Ｎ糖衍生化㊀向酶解后的样品中加入３倍体积的冰乙醇ꎬ－１５~－２５ħ放置约１ｈꎬ高速离心１０ｍｉｎꎬ取上清干燥ꎮ加入１０μＬ２￣ＡＢ衍生化试剂ꎬ６５ħ避光孵育３ｈꎮ用纯化柱纯化后干燥ꎬ５０％乙腈复溶ꎬ准备上机分析ꎮ１.２.２㊀ＨＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用高效液相系统(Ａｇｉｌｅｎｔꎬ１２６０)ꎻ色谱柱采用ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎꎻ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎻ进样量２μＬꎻ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ荧光检测器激发波长２６０ｎｍꎬ发射波长４３０ｎｍꎻ色谱柱温度５５ħꎻ梯度洗脱ꎮ１.２.３㊀ＵＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用超高效液相系统(ＷａｔｅｒｓꎬＨ￣ｃｌａｓｓｐｌｕｓ)ꎬ色谱柱采用ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎꎮ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎬ进样量２μＬꎬ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ荧光检测器激发波长３３０ｎｍꎬ发射波长４２０ｎｍꎬ色谱柱温度６０ħꎬ梯度洗脱ꎮ１.２.４㊀质谱参数㊀应用液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)的ＨＥＳＩ正离子模式(ＨＥＳＩ＋)ꎬ离子源的温度和电压分别为３２０ħ和３.８ｋＶꎬ离子传输管温度为２００ħꎬ其他仪器参数设置均经过优化以获得最佳信号响应ꎻ母离子扫描范围７００~３０００ｍ ｚ－１ꎬ分离度１５０００ꎬ分析时长６０ｍｉｎꎻ数据处理软件采用ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒꎮ１.２.５㊀还原毛细管凝胶电泳(ＲＣＥ￣ＳＤＳ)㊀将蛋白沉淀用１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液复溶ꎬ加入β￣巯基乙醇还原ꎮ仪器采用毛细管电泳仪(ＢｅｃｋｍａｎꎬＰＡ８００ｐｌｕｓ)ꎬ毛细管采用非涂层－熔融石英毛细管ꎬＰＤＡ检测器ꎬ波长２２０ｎｍꎬ电动进样(－５ｋＶ)２０ｓꎬ电压分离(－１５ｋＶ)４０ｍｉｎꎮ２㊀结果与分析２.１㊀缓冲液ｐＨ对结果的影响分别将ｍＡｂ１和ｍＡｂ２样品调ｐＨ至４㊁５㊁６和７ꎬ取２００μｇ进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ检测Ｎ糖含量ꎮ实验结果如表１和图１所示ꎬｍＡｂ２在不５１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.同ｐＨ缓冲液酶解的Ｎ糖含量高度一致ꎬ说明ｐＨ对该样品Ｎ糖水解无影响ꎻ而ｍＡｂ１中Ｎ糖含量随ｐＨ的变化出现明显差异ꎬ其中缓冲液ｐＨ为４时ꎬ峰２(ｐ２)含量出现大幅度升高ꎬ相应的峰３(ｐ３)含量明显下降ꎬｐＨ６和７条件下Ｎ糖含量基本一致ꎮ表１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ样品名称ｐＨＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４ｍＡｂ２４/７.４４６.０５.３２４.１８.２４.８５/７.６４５.８５.４２３.９８.２４.８６/７.６４５.７５.４２４.０８.２４.９７/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９图１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ６１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.㊀㊀将ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解后的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ结果(图２)显示含Ｎ糖重链(ＨＣ)基本已被酶解成非糖基化重链(ＮＧＨＣ)ꎬ说明不同ｐＨ缓冲液下ＰＮＧａｓｅＦ酶解Ｎ糖２４ｈ后均酶解完全ꎬＮ糖含量的变化并非不完全酶解造成ꎮ利用液质联用鉴定各Ｎ糖的种类ꎬｐ２和ｐ３分别为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ(Ａ１Ｆ)和Ｇ０Ｆ(Ａ２Ｆ)ꎮ通过比较不同时间(１㊁８和２４ｈ)酶解结果(表２)ꎬ发现缓冲液ｐＨ为４和５时ꎬｐ２和ｐ３含量的变化随着酶解时间的增加而呈梯度变化ꎬｐＨ４时尤为明显ꎻｐＨ为６和７时ꎬ变化不明显ꎮ因此推测在某些单抗分子上ꎬＧ０Ｆ上的Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖在低ｐＨ条件下易从Ｎ糖链上脱落ꎬ使Ｇ０Ｆ形成Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ从而引起Ｇ０Ｆ￣ＧＮ和Ｇ０Ｆ含量的变化ꎮ因此在进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解时ꎬ应避免酶解体系中ｐＨ过低ꎮ图２㊀ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解蛋白ＲＣＥ￣ＳＤＳ电泳图Ｆｉｇ.２㊀ＲｅｄｕｃｅｄＣＥ￣ＳＤＳｏｆｄｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ表２㊀ｍＡｂ１在不同ｐＨ缓冲液中酶解不同时间的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ２㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｐＨ时间/ｈＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７Ｍａｎ４Ｇ０Ｆ￣ＧＮＧ０ＦＭａｎ５Ｇ１ＦａＧ１ＦｂＧ２Ｆ４１９.３１.０７０.７８.０４.５１.９０.８８３.４７.３７３.０５.８４.３２.００.４２４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５１４.５０.８７８.６６.０４.６２.２０.４８３.８２.３７８.５５.２４.４２.３０.４２４３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６１４.５０.７７９.１５.７４.５２.２０.４８３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３２４３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７１４.４０.７７９.７５.４４.５２.２０.４８３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３２４３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４７１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.２.２㊀置换缓冲液的选择为避免样品缓冲液ｐＨ及成分对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响ꎬ用超滤离心管将样品换液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎮ本研究选择了１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)和超纯水分别置换ｍＡｂ１和ｍＡｂ２的样品缓冲液ꎬ以未置换缓冲液(ｐＨ７)为对照ꎬＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ进行Ｎ糖谱检测ꎮＮ糖色谱图和含量分别见表３和图３ꎬ结果表明１ˑＰＢＳ溶液㊁超纯水和样品缓冲液(ｐＨ７)的Ｎ糖谱结果一致ꎮ因为蛋白在超纯水中稳定性较差ꎬ所以本研究选用１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)置换样品的缓冲液ꎮ表３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ样品名称缓冲液Ｎ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１样品缓冲液(ｐＨ７)３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４１ˑＰＢＳ３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３超纯水３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３ｍＡｂ２样品缓冲液(ｐＨ７)/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９１ˑＰＢＳ/７.６４５.９５.４２４.０８.２４.８超纯水/７.７４５.８５.４２４.０８.２４.８图３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ２.３㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ酶对Ｎ糖结果的影响直接取２００μｇ样品ꎬ分别加入快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)和ＰＮＧａｓｅＦ进行酶解ꎬＮ糖谱如图４所示ꎮ结果显示用ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ进行酶解时ꎬ若选择用ＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径的ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ则由于分离度的提高ꎬｍＡｂ２的Ｎ糖色谱图(图４Ｂ)中Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ出现肩峰ꎬ而ＨＰＬＣ结果８１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＨＰＬＣ检测ꎻＢ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎻＣ:ｍＡｂ２置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎮ图４㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ的Ｎ糖谱结果Ｆｉｇ.４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰＮＧａｓｅＦ(图４Ａ)由于分离度较差ꎬ此峰未得到有效分离ꎮ当将ｍＡｂ２样品缓冲液置换至１ˑＰＢＳ中时(图４Ｃ)ꎬ该肩峰消失ꎮ综合２.１~２.３部分的研究结果可知ꎬ将样品置换缓冲液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ对改善Ｎ糖谱峰形和结果准确度至关重要ꎬ本研究采用了１ˑＰＢＳ溶液ꎬ效果良好ꎮ另外ꎬ在置换缓冲液的基础上使用快速ＰＮＧａｓｅＦ能将酶解时间缩短为数十分钟ꎬ有效提高了检测效率ꎮ选择ＵＰＬＣ能有效提高分辨率ꎮ２.４㊀蛋白变性对酶解效率的影响本研究发现ꎬ在非变性条件下利用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶解不同单抗所需酶解时间差异明显ꎬ从数分钟至数小时不等ꎮ为了有效提高酶解效率ꎬ选择所需酶解时间最长的ｍＡｂ２￣Ｆ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中ꎬ加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎ后进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以未加变性缓冲液(５ˑ)样品为对照ꎮ由图５还原ＣＥ￣ＳＤＳ结果可知ꎬ相同的酶解时间条件下ꎬ蛋白变性后由于高级结构被破坏ꎬＮ糖充分暴露与酶接触ꎬ所以其酶解效果更好ꎮ２.５㊀酶解程度对Ｎ糖结果的影响在非变性条件下加入不同体积的ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶对ｍＡｂ２￣Ｆ进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶的样品为对照ꎬ酶解条件均选择５０ħ㊁１０ｍｉｎꎮ由图６(左)９１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.可知ꎬ在非变性条件下酶解相同时间ꎬ酶量的增加使非糖基化组分增多ꎬ但酶量增加至２μＬ时酶解效果仍较差ꎬ而变性条件下用１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ糖基化组分基本被转换成非糖基化组分ꎮＮ糖水解的程度不同ꎬＮ糖含量(表４)明显成梯度变化ꎬ说明ＰＮＧａｓｅＦ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ图５㊀ｍＡｂ２￣Ｆ在变性和非变性条件下切糖后还原ＣＥ￣ＳＤＳ图谱Ｆｉｇ.５㊀ＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣Ｆｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｉｎｎａｔｕｒｅａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ表４㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ/μＬＮ糖含量/％Ｇ０Ｍａｎ５Ｇ１ａＧ１ｂＧ２０.５４３.４１８.４１８.４５.５２.６１.０４８.０１２.９２０.１６.４２.９２.０５４.５７.９２１.２７.３３.１１＋变性５５.２７.５２０.０８.０３.１３㊀讨论Ｎ糖检测结果的准确性受多种因素的影响ꎮ在缓冲液ｐＨ对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响研究中发现ꎬ低ｐＨ能使某些单抗在酶解过程中Ｇ０Ｆ逐渐转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ造成检测结果的严重偏差ꎬ这种情况通常出现在ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和纯化后的样本ꎬ在低ｐＨ洗脱后直接进行酶解ꎬ若先将样品缓冲液ｐＨ调至中性或进行换液处理ꎬ能够避免ｐＨ的影响ꎮ对照ｍＡｂ２置换和未置换样品缓冲液酶解结果ꎬ置换缓冲液能有效消除Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ的肩峰ꎬ消除样品缓冲液成分对检测结果的影响ꎮ另外ꎬ本研究对多种单抗的研究发现ꎬ酶解程度不同的Ｎ糖检测结果存在明显差异ꎬ说明Ｎ糖苷酶Ｆ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ这与已有文献报道[２０]一致ꎮ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ酶解程度可采用将蛋白沉淀进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ观察非糖基化组分含量的变化情况ꎮ在细胞株筛选和工艺优化阶段ꎬ快速㊁准确的Ｎ糖检测结果能够有效推进开发进度ꎬ而该阶段０２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图６㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的ＲＣＥ￣ＳＤＳ和Ｎ糖谱图Ｆｉｇ.６㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎａｎｄＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔ巨大的样本量又对成本控制提出更高的要求ꎬ因此建立一种高效㊁准确且低成本的Ｎ糖检测方法尤为重要ꎮ本研究确定了较为通用的ＰＮＧａｓｅＦ酶对单克隆抗体的酶解条件ꎬ即为将样品置换缓冲液至１ˑＰＢＳꎬ取适量样品加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎꎬ进行后续除蛋白㊁干燥等处理ꎬ快速ＰＮＧａｓｅＦ酶和变性处理的应用ꎬ将酶解时间大幅缩短ꎬ提高了检测效率ꎻ同时采用传统的ＵＰＬＣ和ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ有效提高了分离度ꎬ并控制了检测成本ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＦＲＩＥＳＳＷꎬＳＥＩＤＬＡꎬＳＯＥＲＧＥＬＦꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｒ￣ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２０１６ꎬ１００:９４－１００. [２]㊀刘晓宇.单克隆抗体糖基化修饰的研究现状和进展[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０２０ꎬ３３(２):２１６－２２１. [３]㊀ＬＩＵＬ.Ａｎｔｉｂｏｄｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏ￣ｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１５ꎬ１０４(６):１８６６－１８８４.[４]㊀ＳＨＩＥＬＤＳＲＬꎬＬＡＩＪꎬＫＥＣＫＲꎬｅｔａｌ..Ｌａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕ￣ｍａｎＩｇＧ１Ｎ￣ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００２ꎬ２７７:２６７３３－２６７４０.[５]㊀ＢＯＹＤＰＮꎬＬＩＮＥＳＡＣꎬＰＡＴＥＬＡＫ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒｅ￣ｍｏｖａｌｏｆｓｉａｌｉｃａｃｉｄꎬｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｍｐａｔｈ￣１Ｈ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ１９９５ꎬ３２:１３１１－１３１８.[６]㊀ＪＯＮＥＳＡＪꎬＰＡＰＡＣＤＩꎬＣＨＩＮＥＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｌｅａｒ￣１２２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.ａｎｃｅｏｆｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃａｕｓｅｄｂｙｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙｓ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ１７:５２９－５４０.[７]㊀ＫＥＣＫＲꎬＮＡＹＡＫＮꎬＬＥＲＮＥＲＬꎬｅｔａｌ..ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｗｈｏｓｅｖａｒｉａｂｌｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｌｅａｒａｎｃｅｉｎｈｕｍａｎｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔ[Ｊ].Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬ２００８ꎬ３６:４９－６０.[８]㊀ＮＩＭＭＥＲＪＡＨＮＦꎬＲＡＶＥＴＣＨＪＶ.Ｔｈｅａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃ￣ｔｉｖｉｔｙｏｆＩｇＧ:ｔｈｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓＩｇＧｐａｒａｄｏｘ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.ꎬ２００７ꎬ２０４:１１－１５.[９]㊀王冲ꎬ郭怀祖.不同细胞系表达的抗ＥＧＦＲ单抗糖基化结构对比分析[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１７ꎬ３３(６):１０１８－１０２７. [１０]㊀ＺＨＥＮＧＫꎬＢＡＮＴＯＧＣꎬＢＡＹＥＲＲ.Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａ￣ｔｉｏｎｏｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ[Ｊ].ＭＡｂｓꎬ２０１１ꎬ３:５６８－５７６.[１１]㊀ＫＩＬＤＥＧＡＡＲＤＨＦꎬＦＡＮＹＺꎬＳＥＮＪＷꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌ￣ｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｄｉａａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎＩｇＧｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＣＨＯｃｅｌｌｓｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇｉｎ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(２):３５９－３６６.[１２]㊀ＢＥＮＪＡＭＩＮＤꎬＮＥＨＡＭꎬＭＩＣＨＡＥＬＢ.Ａｌｏｗｒｅｄｏｘｐｏｔｅｎｔｉａｌａｆｆｅｃｔｓｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ２４６:７１－８０.[１３]㊀ＳＴＥＦＡＮＦꎬＪＯＥＲＧＨꎬＨＡＮＮＳ￣ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＭ.Ｇｌｙｃａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅａｎｄａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｍｕ￣ｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２００８ꎬ７０:４２－５０. [１４]㊀丛宇婷ꎬ胡良海.单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展[Ｊ].色谱ꎬ２０１６ꎬ３４(１２):１１８６－１１９１.[１５]㊀ＭＥＬＩＳＳＡＨꎬＹＡＮＧＷꎬＲＩＣＨＡＲＤＲ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎＮＳ０ｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｌａｓｅｒ￣ｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓꎬ２０１３ꎬ６:３９３－４０６. [１６]㊀ＧＥＮＮＡＲＯＬＡꎬＳＡＬＡＳ￣ＳＯＬＡＮＯＯ.Ｏｎ￣ｌｉｎｅＣＥ￣ＬＩＦ￣ＭＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｄｉｒｅｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ８０:３８３８－３８４５.[１７]㊀李媛ꎬ邱建华ꎬ陈家琪ꎬ等.液相色谱－质谱技术对利妥昔单抗及其类似药结构表征和相似性的研究[Ｊ].国际生物制品学杂志ꎬ２０１６ꎬ３９(３):１１６－１２１.[１８]㊀ＣＨＥＮＸꎬＦＬＹＮＮＧＣ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｂｙｏｎ￣ｌｉｎｅｒｅｖｅｒｓｅｄ￣ｐｈａｓｅｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ/ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｎ￣ａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２００７ꎬ３７０:１４７－１６１.[１９]㊀ＴＡＲＥＮＴＩＮＯＡＬꎬＧÓＭＥＺＣＭꎬＰＬＵＭＭＥＲＴＨＪ.Ｄｅｇｌｙｃｏ￣ｓｙｌａｔｉｏｎｏｆａｓｐａｒａｇｉｎｅ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｂｙｐｅｐｔｉｄｅ:Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９８５ꎬ２４:４６６５－４６７１.[２０]㊀ＨＵＡＮＧＹＮꎬＲＯＮＯ.ＫｉｎｅｔｉｃｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ(ＩｇＧ)ｂｙＰＮＧａｓｅＦ:ａｌｌｇｌｙｃａｎｓａｒｅｎｏｔｃｒｅａｔｅｄｅｑｕａｌ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｍｏｌ.Ｔｅｃｈｎ.ꎬ２０１７ꎬ２８:１５０－１５７.２２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。

基于微流控的植物根部-微生物相互作用研究进展陈登博1,付玉明1,2∗,冯佳界1,2(1.北京航空航天大学生物与医学工程学院,北京100191;2.北京航空航天大学空天生物技术与医学工程国际联合研究中心,北京100191)摘要:基于微流控技术研究空间环境下植物的根-菌互作,有利于揭示植物-微生物稳态对空间环境效应的响应与适应机制㊂介绍了微流控技术中关于根-菌互作的成像技术,重点阐述了微流控技术针对不同栽培基质的成像以及对根际化学环境的操控/采样功能的优势,分析了芯片技术针对不同根系形态需求的研究,并对微流控技术在空间环境根-菌互作研究中的应用进行展望㊂关键词:微流控芯片;植物-微生物相互作用;根部生理学;空间生命保障中图分类号:Q948.12㊀文献标识码:A㊀文章编号:1674-5825(2022)06-0845-08收稿日期:2022-04-24;修回日期:2022-09-19基金项目:国家自然科学基金(31870852)第一作者:陈登博,男,硕士研究生,研究方向为空间生命保障技术与纳米生物技术㊂E-mail:chendengbo@∗通讯作者:付玉明,男,博士,副教授,研究方向为航天居室环境-微生物组-人体健康轴研究㊂E-mail:fuyuming@Research Progress of Microfluidics-based Plant-Microbe InteractionCHEN Dengbo 1,FU Yuming1,2∗,FENG Jiajie 1,2(1.School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China;2.International Joint Research Center of Aerospace Biotechnology &Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China)Abstract :The study of plant-microbe interactions in space environment based on microfluidic tech-nology is conducive to revealing the response and adaptation mechanism of plant-microbe homeostasis to the space environment.In this paper,the imaging technology of root-bacteria interaction in mi-crofluidic technology was introduced,the advantages of microfluidic technology for imaging different cultivation substrates and manipulating /sampling the rhizosphere chemical environment were dis-cussed,and the researches of microfluidic technology for different root morphological requirements were analyzed.In addition,the application of microfluidic technology in the study of root-bacteria interaction in space environment was prospected.Key words :microfluidic chip;plant-microbe interaction;root physiology;space life support1㊀引言㊀㊀植物栽培是地面和受控生态生命保障系统的重要组成部分㊂植物的根系有固定植株㊁吸收水分和养分等重要功能,根际微生物在植物根表或近根部位生长繁殖,是植物微生物组的重要组成部分㊂植物脱落物或分泌物可到达根际微区,在根系周围形成丰富而复杂的化学环境[1],是植物在长期进化过程中形成的一种适应外界环境变化的重要机制[2]㊂这些植物脱落物或分泌物为微生物提供营养,以此构建和调节根际微生物菌群[3];另一方面,根际微生物也会深度参与调解植物生理活动[4-5]㊂因此,植物与微生物的根际相互作用(简称根-菌互作)是植物学和微生物学第28卷㊀第6期2022年㊀12月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀载㊀人㊀航㊀天Manned Spaceflight㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Vol.28㊀No.6Dec.2022研究的热点问题㊂传统的根-菌互作研究所用的栽培方式难以实时营造对根际研究所需化学环境,且由于需要将植物根部取出进行采样和成像观察,使得采样和成像不具有实时性(时间分辨率较低),难以复现动态的互作过程㊂并且根毛可增加根表面积,为根部探索更大空间,在根生理学研究中具有重要地位,但却因为尺度过小而难以采样和成像等㊂因此,根-菌相互作用的实时化㊁可视化和操控性研究是一项新的挑战㊂近年来,控制小体积流体的微流控芯片技术(或称为芯片实验室)为生物学研究的实时化和可视化提供了新方法,在根-菌互作研究中展现出巨大潜力㊂微流控技术在根-菌互作研究中具有三大优势:①透明的芯片可实现根-菌互作的实时成像;②可实现对根际环境的多次采样;③可对根际化学环境实现准确操控,以研究化学环境对互作的影响㊂目前最广泛采用的芯片构建流程及材料为:按照所需的芯片设计图纸,以光刻机制作与其互补的光刻胶材质或3D打印制作塑料材质的模板(Template/mold),以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)浇注到模板上成型后剥离,再以等离子体氧化PDMS的需封装面(即有芯片通道的面)以活化其表面基团,最后放置玻璃片至封装面上键合以完成封装[6]㊂相对于二氧化硅㊁热固性塑料㊁热塑性塑料等其他可选的芯片材质,PDMS的价格低廉㊁偏软质㊁制作模板后可快速批量浇注制取等优势,使其成为主流芯片制作流程中常用材料[6]㊂等离子体氧化封装方式是不可逆的,即封装后很难将PDMS从玻璃片上拆卸;若实验有拆卸需求,可考虑可逆的封装方式,直接在室温下依赖PDMS和玻璃片间的范德华力封装,但这样封装不严密,在外力和内压下容易因意外拆卸开[7]㊂高等植物可以再生氧气㊁食物和水,是生物再生生命保障系统(Bioregenerative Life Support Sys-tem,BLSS)的功能核心[8]㊂而空间特殊环境(微重力㊁辐射㊁磁场㊁密闭㊁微生物多样性受限等)对根-菌互作的影响尚不明晰,前期搭载实验表明植物对微生物病害的敏感性可能增加[9]㊂而微流控技术体积小㊁性价比高,对于空间研究也独具优势㊂本文综述了基于微流控的植物根部发育和根-菌互作的研究,阐述微流控芯片针对不同栽培基质的成像及对根际化学环境的操控/采样功能的优势,分析了芯片针对不同根系形态需求的研究,并对微流控技术在空间环境根-菌互作研究中的重要作用进行展望㊂2㊀根-菌互作芯片的成像技术㊀㊀主流微流控芯片的材质(PDMS㊁玻璃片等)透光性好,对根-菌互作的成像观察独具优势㊂若能结合荧光等生物发光技术和一些高级成像技术,将可以更全面地还原根-菌互作过程㊂图1㊀针对根-菌互作的芯片Fig.1㊀Chip for root bacteria interaction Massalha等[10-11]构建的微流控系统TRIS (Tracking Root Interactions System)是一个研究根-菌互作的典型装置,如图1(a)所示,体现了生物荧光技术在芯片根-菌互作成像中的出色效果㊂TRIS系统采用PDMS-玻璃片材质,在灌有固体植物培养基的移液器吸头中令拟南芥发苗,在根长出吸头前移栽至芯片通道入口令其向芯片中生长,并使用注射泵将液体培养基和所感兴趣的根际菌(枯草芽孢杆菌作为植物有益菌,大肠杆菌作为有害菌)注射进芯片通道内,这些方法在根-菌互作的芯片研究中被普遍使用㊂为了实时显微观察,该装置直接安装在显微镜上㊂在无菌芯片中接种了表达红色荧光蛋白的枯草芽孢杆菌和表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌,使用激光扫描共焦显微镜分别荧光成像并叠加图像,发现在接种后12h当中,枯草芽孢杆菌向根伸长区聚集并定殖,大肠杆菌却被排除在根表面之外,通过图像观察菌群行为动态,可推测出有益菌对植物针对病648载人航天第28卷原体的保护机制㊂除使用荧光标记的细菌之外,该研究还使用了仅在6个特定根区(皮层㊁脉管系统㊁根毛等)表达绿色荧光蛋白的6种荧光拟南芥株系,并与红色荧光蛋白的枯草芽孢杆菌图像叠加,观察到了杆菌接种后6h内向根伸长区的明显趋化行为,实现荧光标记的植物和细菌共同成像㊂在可见光(包括荧光)手段之外,电子显微镜和原子力显微镜等先进成像技术的分辨率更高,可在根-菌互作研究中作为更高级的㊁细胞器水平的成像手段㊂比如根毛就是一种微米级的根部结构,可以应用这两种高级成像手段㊂与光学显微镜不同,这两者都要求观察面暴露在外,而根却被封装在芯片中㊂由于等离子体氧化法的封装是不可逆的,很难打开封装以将根和根际区暴露在外㊂针对这一需求,Aufrecht等[12]设计了一种可拆卸的㊁针对根毛研究的芯片,PDMS并未化学键合到玻璃片上,而只是在高压灭菌时形成了较弱的物理键,且用琼脂固化围住PDMS以进一步固定及保湿,如图1(b)所示㊂其可在光学成像完成后拆卸开以供电镜等成像㊂针对根毛研究的目的,芯片被设计成了两层(Two-layer)式的阶梯状腔室,较高的腔室(200μm)容纳主根㊁两侧较低的腔室(20μm)容纳根毛,实测证明根毛生长时可自然粘附在PDMS面上,在拆卸过程中可保持在原位,利于后续的电子显微镜/原子力显微镜对根毛的成像研究㊂研究人员进一步使用该芯片跟踪了2种植物益生菌在拟南芥发育早期根部定殖情况[13],结果发现,无论细菌种类和接种浓度如何, 4天后细菌细胞在根表面的覆盖面积均为1%~ 2%,且根的发育情况很大程度上取决于细菌接种的种类和浓度㊂3㊀芯片技术对不透明栽培基质的成像优势㊀㊀芯片通道中装载液体基质时,其在光学上透明的性质有助于成像,但液体并不是自然界或人工栽培的主流基质,自然环境中的根-菌互作大多发生在土壤等固体基质中㊂若将土壤引入芯片,以解决土壤颗粒不透明导致的可见光成像困难等问题,生物荧光和某些显微光谱成像技术或可成为其研究手段㊂Mafla-Endara等[14]设计了土壤芯片,将土壤置于芯片通道入口处,以可见光观察土壤及微生物扩散进入通道的过程,以揭示土壤生态系统的形成过程㊂研究发现,土壤液体和真菌菌丝是土壤物质扩散的主要驱动力,土壤颗粒和微生物在充满液体的通道中扩散比在空气中快得多,且真菌菌丝可携带细菌穿过气体障碍而扩散定殖㊂芯片成像还可用于量化土壤颗粒的运动模式,对所得显微视频中2~6μm土壤颗粒使用自动追踪算法制作速度-位置热图,发现土壤颗粒被芯片内部的流水拖拽形成蜿蜒的运动模式,也使细菌很快地移动㊂虽未引入植物,该研究使用的土壤芯片已展现了对根-菌互作的可见光成像研究潜力㊂图2㊀EcoFAbs的应用[15]Fig.2㊀The applications of EcoFABs[15]也有研究尝试让植物根进入装载有固体基质的芯片,以研究基质中的根-菌互作㊂Gao等[15]描述了EcoFAB(Ecosystem Fabrication)芯片制作方法,可向通道内装载沙子或土壤作为基质,以期在更接近自然条件的微环境中研究根-菌互作,如图2所示㊂观察发现,虽然在亮场(可见光)下,沙子和土壤的不透明性质让埋在其中的根系和微生物不可见,但在荧光显微镜下,荧光标记的根际益生菌Pseudomonas simea在土中清晰可见,展现了荧748第6期㊀㊀㊀㊀陈登博,等.基于微流控的植物根部-微生物相互作用研究进展光技术克服土壤不透明性成像的潜力㊂这种益生菌在沙子中集中于植物根尖,而在土壤中集中于芯片开口处㊂研究表明沙子的贫营养迫使益生菌定殖于根尖以摄取分泌物,而土壤的富营养使芯片开口处的氧气成为益生菌的首要需求㊂值得注意的是,EcoFAB的实验流程认为可使用镊子将裸露的植物幼苗直接从发苗的固体培养基上移栽至芯片的孔道内[15];而几乎所有其他芯片-植物的结合研究都选择使用内有固体培养基的移液器吸头作为发苗载体,并模块化地整体移栽至芯片孔道内[10,13,16],以防止移栽过程对根的伤害㊂使用移液器的成活率明显高于使用镊子的移栽,虽然使用镊子的做法更接近自然条件,但对实验操作要求较高,很难不伤害根系㊂至于直接在灌注培养基的芯片中发苗的方法[17],由于植物的发芽率并非100%等原因,失败率相对更高㊂针对土壤颗粒对可见光的不透明性,Puce-taite等[18]推荐对土壤芯片使用可见光光谱之外的㊁先进的显微光谱成像技术,以克服土壤的不透明性,利于在微观尺度监测土壤微生物和相关的生物地球化学过程㊂这些非可见光的显微光谱成像技术包括红外吸收㊁拉曼散射和基于同步辐射的X射线显微光谱技术等,有时需要在土壤中加入稳定同位素或纳米贵金属粒子等辅助成像定位,在微生物鉴定㊁代谢物/污染物的定量/定位等方面各有优势,也可运用于基于固体基质芯片的根-菌互作研究中㊂4㊀芯片技术对根际化学环境的操控/采样功能优势㊀㊀利用微流控亦可在时空上快速操控/监测根周围的化学环境,研究根部对生物或非生物因素的动态响应,例如一系列以RootChip命名的芯片设计[19],如图3所示㊂最初Grossmann等[19]开发的RootChip被用于根对化学环境的响应研究,并以根内的葡萄糖荧光传感器开展荧光成像,成功发现细胞内糖水平的改变主要发生在灌注了葡萄糖的根尖㊂对于使用拟南芥的研究,RootChip可在几厘米内(<10cm)部署多个平行通道,以一次性开展多个植株的重复性实验㊂Fendrych等[20]采用竖直放置的vRootChip(v意为vertical,竖直以不影响根向地性)研究根部生长的基因通路,观察拟南芥根生长情况数天,发现无生长素存在时拟南芥的根生长速度会在30s内迅速下降;补充少量生长素后,根生长速度又会在2min内恢复;并通过向芯片中根际环境注入cvxIAA㊁ccvTIR1等人工配体,最终确认了以TIR1/AF-BAux/IAA共受体复合物为基础的一个调节根生长的非转录分支[20]㊂Guichard等[21]开发了根生长通道更长的RootChip-8S微流控装置,Denninger 等[22]用其跟踪观察了与根毛形成相关的细胞极化过程机理,发现基因GEF3在细胞极化过程中有作为细胞膜标志物的作用㊂图3㊀安装8个植物的RootChip[19]Fig.3㊀Image of a RootChip with eight mounted live plants[19]一些芯片设计甚至可令同一植株的根部的不同部位分别处于不同化学环境中,以在完全排除个体差异因素的前提下,直观对比不同化学环境对根双侧的影响或对特定根段的影响㊂面向根生理学或环境异质性研究,研究人员通常使用双流或多流汇总的方式,即多种液体从多个入口汇总到同一条芯片通道中,来营造分界式共存的液体化学环境㊂对于分根段施加不同的化学环境,Meier 等[23]在2010年开发了可对拟南芥施加多层流化学刺激的芯片,实际使用生长素类似物2,4-D和生长素抑制剂NPA,层流的方向与根垂直,以验证生长素和抑制剂对指定根段的影响㊂研究设置了3个进液口以达成3层的层流,以控制流量的手段成功制造了厚度10μm(约1个根细胞长度)的2,4-D层,这一厚度是被掺杂在2,4-D中的荧光微球所显示㊂因为使用了生长素调节剂偶联荧光蛋白的拟南芥株系,采用荧光显微镜观察到了2,4-D在短短几分钟后令10μm长的根段长出了848载人航天第28卷根毛,表明了生长素影响可在单个根细胞尺度上发生,也证明了微流控研究在很小尺度(~10μm)上的化学刺激对根影响的能力㊂值得一提的是,由于层流的方向与根垂直,验证了大/小的流量中根的生长没有显著区别,从而排除了剪切力(~10dyne/cm2)可能造成的额外影响㊂对于双侧施加不同的化学环境,Stanley等[16]设计了双流RootChip(Dual-flow-RootChip),令2种液体平行于根轴同时进入通道,形成不对称的化学环境,也描述了详细的芯片实验步骤[24]㊂研究分别采用NaCl㊁磷酸盐和聚乙二醇在双流Ro-otChip中模拟干旱等胁迫形式,在根双侧不对称处理,研究根毛生长情况,证明根在生理和转录水平上具有局部适应环境中异质条件的能力,也证明双流芯片方法有助于还原根与环境相互作用的决策过程[16]㊂研究表明,每个根毛细胞可以自主地对环境做出响应[16,23]㊂微流控芯片的采样功能有较大潜力㊂芯片的流出液是其内部环境的重要样品,通过收集芯片的流出液,即可完成植物根际微生物和根系分泌物的采集,从而进行根际微生物组与代谢组分析㊂但实际开展了采样并使用组学手段分析的研究并不多㊂其原因是关注复杂微生物群落研究较少,而对有限个菌株的行为,使用荧光标记等技术即可揭示,如Massalha等[10]和Aufrecht等[13]的研究;另外对于根际研究,很多根际菌定殖在根部表面甚至内部,难以随流出液流出㊂5㊀芯片技术对根系形态等特殊需求的优势㊀㊀植物根系具有多种形状和尺寸,可为之相应设计适合的微流控通道和腔体,以让植株正常生长或方便成像㊂为研究根系较粗的植物,Khan 等[25]使用3D打印的模具制备了腔体高度10mm 的PDMS材质芯片,如图4(a)所示,用于研究二穗短柄草(Brachypodium distachyon,根系直径1~ 3mm)的根细胞和分析渗透胁迫下的基因表达,发现了基因BdDi19在幼苗短期渗透胁迫期间有表达㊂此外,针对须根系统研究,相对于传统的单条直道的芯片设计,Chai等[26]采用多室设计的微流控芯片,如图4(b)所示,令水稻的分枝根生长到一组径向的花瓣形室中,用以研究渗透胁迫图4㊀应用于不同植物的芯片Fig.4㊀Chips for different plants (模拟干旱环境)对根系发育的影响,发现随着聚乙二醇(PEG6000,用于营造渗透胁迫)浓度的增加,根的生长变慢,根毛的数量和长度增加,根尖边缘细胞的发育和聚集增多㊂为了方便显微观察,微流控芯片的尺寸普遍设计得较小,并且使用拟南芥等小型草本物种,这让根-菌互作的长期化观察以及对个体较大的木本植物的研究成为挑战㊂Noirot-Gros等[27]设计的根系-微生物相互作用芯片(RMI-chip),如图4(c)所示,通道长达36mm,可以培养山杨(木本植物)幼苗的根超过1个月,并且可以连续使用显微镜观察根-菌互作㊂研究发现细菌需要在山杨根部表面形成生物膜才能持久定殖㊂RMI芯片加以修改或优化,可以用于长期观察生长缓慢的植物,或者短期研究生长较快的植物㊂此外,设计功能导向性很强的特殊结构芯片,如Massalha等[10]的TRIS系统还有一个双根通道版本,在同一腔室里生长2株拟南芥的根,并设计了分隔结构避免双根的物理接触,却允许微生物948第6期㊀㊀㊀㊀陈登博,等.基于微流控的植物根部-微生物相互作用研究进展细胞和信号分子的自由流动,以直观地显示细菌对不同基因型株系根部的定殖偏好㊂根据具体需求而设计开发出来的微流控芯片更能满足各种植物生长的特殊需求,也是微流控芯片的优势之一㊂图5㊀空间环境下微流控技术在根-菌互作研究中的运用Fig.5㊀Application of microfluidic technique in the study of root-bacteria interaction in spatial environment6㊀根-菌互作空间研究现状及展望㊀㊀高等植物是BLSS 的功能核心,但空间环境因素导致植物生长处于逆境,对植物的生长发育具有显著影响㊂在太空飞行等空间环境下发现在微重力下生长的植物表现出对植物病菌的敏感性增加[28],地面3D 回转模拟微重力效应下的实验也证明了在模拟微重力效应下病菌更易侵染植物[29-31]㊂一方面可能是因为微重力对细胞壁的重生和木质素的合成起到了抑制作用[32],从而利于病原真菌的侵染;另一方面推测是微重力影响了植物宿主与自身微生物的相互作用㊂虽然植物遗传适应相对较慢,但植物共生的微生物却能够很快地适应环境变化[33]㊂而植物根际微生物组是植物的第2套基因组的组成部分,在植物生长发育过程当中起着至关重要的作用㊂植物益生菌对植物具有保护机制,可以形成生物膜以及生产植物激素从而提高植物个体抵御非外来的微生物环境胁迫的免疫能力㊁诱导免疫抗性等多种手段,从而来增强其对宿主的免疫抗逆㊁抗病能力[34],且微生物是BLSS 中必然存在的一个链环,因此有必要研究空间环境下植物的根-菌互作㊂但是受控条件下植物根际微生物的结构变化以及潜在威胁微生物研究甚少㊂由于空间实验的空间有限,即使对于探空火箭等所拥有的超过10cm ˑ10cm ˑ10cm 体积的实验空间[35-36],对于使用传统栽培方式的根-菌互作研究也明显不够㊂而且,由于空间搭载机会的稀缺和昂贵,很多实验必须先期在地面开展,在回转仪等模拟的微重力环境下进行[37-38]㊂与真正的空间实验相似,回转仪可供实验的区域非常狭小,同样难以容纳传统栽培方式的植株㊂微流控技术可以成为空间生物学研究中很有前途的工具,已经运用在国际空间站或卫星搭载的太空实验上㊂如应用于国际空间站的一种新的不依赖培养物的微生物监测系统(the Lab-On-a-Chip Application Development Portable Test Sys-tem,LOCAD-PTS)[39],在15min 内定量分析了舱室表面的内毒素(革兰氏阴性细菌和真菌的标志)㊂在目前第一个长时间的活体生物立方体卫星实验中,Nicholson 等[40]开展生命有机体轨道空间环境生存性(Space Environment Survivability ofLiving Organisms,SESLO)实验6个月,测定了枯草芽孢杆菌孢子在空间环境中长期静止(14㊁91和181天)后的萌发㊁生长和代谢情况㊂但目前空间生物学研究中,未将微流控技术应用在植物根-菌互作研究上㊂而微流控芯片体积小,且目前已有一些微流控根-菌互作研究没有采用注射泵,同样可实现根际营养液的更新[15]㊂微流控芯片作为载体更能满足研究需求㊂因此,如图5所示,对于长期进化适应1G 重力的地球环境的植物而言,空间微重力环境属于典型的逆境环境,可能导58载人航天第28卷致植物菌群失调,但目前对其机理并不清楚㊂基于微流控技术能更直观地研究植物-微生物在空间极端环境下相互作用机理,并可以通过其机理精准调控植物根部菌群,使植物拥有更大的固碳能力和更强的抗逆特性㊂微流控技术在根-菌互作研究中的显著优势能进一步帮助研究者理解植物学和微生物学研究的热点问题㊂但在空间环境下基于微流控技术开展植物根-菌互作研究依然存在着许多问题:①空间环境下,植物根生长会改变方向,对基于微流控技术的根菌互作观察有一定影响;②在芯片设计的过程中还需要考虑表面张力会成为界面的主要力;③目前的微流控技术主要针对在透明基底上成像,这将偏离自然土壤系统中根际的群落结构㊂这些问题需要利用更有效的方法来解决㊂7㊀结语㊀㊀目前,已有研究将微流控技术运用于根-菌互作中,显著提高了实验效率与根菌研究结果的分辨率㊂然而迄今为止,国际上在空间环境下应用微流控技术研究植物-微生物相互作用仍是空白㊂微流控技术具有便于对根菌互作实时成像以及对根际化学环境的操控/采样等优势,能够精细刻画反映出空间环境下植物-微生物互作规律,有益于揭示植物-微生物稳态对空间环境效应的响应与适应机制,从而助力空间环境下植物健康稳定生产,为BLSS空间实际构建应用奠定基础㊂参考文献(References)[1]㊀Sasse J,Martinoia E,Northen T.Feed your friends:Do plantexudates shape the root microbiome?[J].Trends in PlantScience,2018,23(1):25-41.[2]㊀李月明,杨帆,韩沛霖,等.植物根系分泌物响应非生物胁迫机理研究进展[J].应用与环境生物学报,2022,28(4):1-10.Li Y M,Yang F,Han P L,et al.Research progress on themechanism of root exudates in response to abiotic stresses[J].Chinese Journal of Applied&Environmental Biology,2022,28(4):1-10.(in Chinese)[3]㊀Ahmad R A,Michael D J,Segun G.Synergistic plant-mi-crobes interactions in the rhizosphere:A potential headway forthe remediation of hydrocarbon polluted soils[J].Internation-al Journal of Phytoremediation,2019,21(1/7):71-83.[4]㊀Berendsen R L,Vismans G,Yu K,et al.Disease-inducedassemblage of a plant-beneficial bacterial consortium[J].Isme Journal,2018,12(6):1496-1507.[5]㊀Jacoby R,Peukert M,Succurro A,et al.The role of soil mi-croorganisms in plant mineral nutrition-current knowledge andfuture directions[J].Frontiers in Plant Science,2017,(9):1-8.[6]㊀Ren K,Zhou J,Wu H.Materials for microfluidic chip fabri-cation[J].Accounts of Chemical Research,2013,46(11):2396-2406.[7]㊀Mcdonald J C,Duffy D C,Anderson J R,et al.Fabricationof microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)[J].Elec-trophoresis:An International Journal,2000,21(1):27-40.[8]㊀Fu Y,Liu H,Shao L,et al.A high-performance ground-based prototype of horn-type sequential vegetable productionfacility for life support system in space[J].Advances inSpace Research,2013,52(1):97-104.[9]㊀Foster J S,Wheeler R M,Pamphile R.Host-microbe interac-tions in microgravity:Assessment and implications[J].Life,2014,4(2):250-266.[10]㊀Massalha H,Korenblum E,Malitsky S,et al.Live imagingof root-bacteria interactions in a microfluidics setup[J].Pro-ceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2017,114(17):4549-4554. [11]㊀Massalha H,Korenblum E,Shapiro O H,et al.TrackingRoot Interactions System(TRIS)experiment and quality con-trol[J].Bio-protocol,2019,9(8):e3211. [12]㊀Aufrecht J A,Ryan J M,Hasim S,et al.Imaging the roothair morphology of arabidopsis seedlings in a two-layer mi-crofluidic platform[J].Jove-Journal of Visualized Experi-ments,2017,(8):1-6.[13]㊀Aufrecht J A,Timm C M,Bible A,et al.Quantifying thespatiotemporal dynamics of plant root colonization by benefi-cial bacteria in a microfluidic habitat[J].Advanced Biosys-tems,2018,2(6):1-6.[14]㊀Mafla-Endara P M,Arellano-Caicedo C,Aleklett K,et al.Microfluidic chips provide visual access to in situ soilecology[J].Communications Biology,2021,4(1):1-12.[15]㊀Gao J,Sasse J,Lewald K M,et al.Ecosystem fabrication(EcoFAB)protocols for the construction of laboratory ecosys-tems designed to study plant-microbe interactions[J].Jove-Journal of Visualized Experiments,2018,134(4):1-26.[16]㊀Stanley C E,Shrivastava J,Brugman R,et al.Dual-flow-ro-otchip reveals local adaptations of roots towards environmentalasymmetry at the physiological and genetic levels[J].NewPhytologist,2018,217(3):1357-1369.[17]㊀Sun L,Liu L,Lin X,et al.Microfluidic devices for monito-ring the root morphology of Arabidopsis thaliana in situ[J].Analytical Sciences,2021,37(4):605-611. [18]㊀Pucetaite M,Ohlsson P,Persson P,et al.Shining new lightinto soil systems:Spectroscopy in microfluidic soil chips re-veals microbial biogeochemistry[J].Soil Biology and Bio-chemistry,2021,153(2):1-9.[19]㊀Grossmann G,Guo W J,Ehrhardt D W,et al.The RootCh-ip:An integrated microfluidic chip for plant science[J].Plant Cell,2011,23(12):4234-4240.[20]㊀Fendrych M,Akhmanova M,Merrin J,et al.Rapid and re-versible root growth inhibition by TIR1auxin signalling[J].Nature Plants,2018,4(7):453-459.[21]㊀Guichard M,Olalla E,Stanley C E,et al.Microfluidic sys-tems for plant root imaging[J].Methods in Cell Biology,2020,160(1):381-404.[22]㊀Denninger P,Reichelt A,Schmidt V A F,et al.DistinctRopGEFs successively drive polarization and outgrowth of roothairs[J].Current Biology,2019,29(11):1854-1865.[23]㊀Meier M,Lucchetta E M,Ismagilov R F.Chemical stimula-158第6期㊀㊀㊀㊀陈登博,等.基于微流控的植物根部-微生物相互作用研究进展。

交联聚乙烯醇膜制备优化及在电吸附中的应用作者：陈玲毛疏笛张奕李哲朴贤卿孙卓赵然来源：《华东师范大学学报（自然科学版）》2020年第02期摘要：采用化学交联法制备聚乙烯醇（PVA）复合膜，研究磺基琥珀酸（SSA）交联聚乙烯醇薄膜的电容去离子行为.磺基琥珀酸作为一种交联剂和亲水基团的给体，可以很好地应用于聚乙烯醇膜的改性.详细研究了制备工艺（交联剂含量，交联温度）对复合膜电容去离子性能的影响，并进行对比实验，将电容去离子系统（cDI）（仅使用活性炭电极）和采用了PVA 与SSA交联的膜电容去离子系统（MCDI）（电极表面覆盖离子交换膜）分别进行吸脱附运行操作.结果表明：当交联剂SSA的质量分数为5%，交联温度为100℃时，交联聚乙烯醇复合膜在电容去离子中的应用使电极的吸附量增强了15%左右，电荷效率平均提高了25%.关键词：离子交换膜;磺基琥珀酸;聚乙烯醇复合膜;电容去离子中图分类号：P747+.99文献标志码：ADOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2019310030 引言水资源与社会的发展、人民的生活水平息息相关，尤其是淡水资源，但是地球上能饮用的淡水只占地球总水量的十万分之三.与此同时，浪费水和水污染的现象使得淡水资源极度匮乏，专家估计，地球上有10至15亿人无法获得饮用水，更多地区或国家将面临因水资源短缺而放慢发展速度和降低生活质量的问题.我国人均水资源只为世界平均水平的四分之一，属于严重缺水型国家[1]，解决这一问题已成为一项紧迫的任务[2-3].电容去离子（CDI）是一种新兴的海水淡化技术，具有操作简便，成本低廉，节能环保等的优势[4-7].其中每个CDI单元由一对面对面放置的多孔电极组成，之间用隔板间隔开.通常在一个CDI模块中，可以布置一对或多对电极，用来适应所需要处理的水量.通过直流电源给电容去离子系统施加一个恒定电压，泵人的水溶液中的带电粒子受到电极两端形成的电场力的作用，逐渐迁移到两极，并吸附在电极表面与溶液形成的双电层上（EDLs），经过一段时间的操作后，使溶液脱盐或完成净化[8-10].通过短接或施加一个反向电压，就能去除电极两端的电场力或得到一个方向的电场，电极表面吸附的离子失去了作用力，逐渐脱附到本体溶液中，溶液中的浓度也会因此增加.这就是一个完整的电容去离子过程中的吸附和解吸过程.由于碳材料（如活性炭或碳纳米管等）的使用，可以使电极具有良好的导电性，同时比表面积也大大增加，一般可以达到1 000 m2/g的量级[11-17].因此，CDI操作中，在所需要的时间内完成完全的吸附和脱附过程，电极性能起到了重要作用.然而，在脱附过程（也称作再生步骤）中，CDI 存在一些内生的问题[18].如果向电极两端施加的是一个反向电压进行脱附，此時电场正负极相反，原先吸附在电极上的带电离子固然会发生脱附，并移动到本体溶液中，但是，与此同时，带相反电荷的离子又会从溶液中被吸附到电极表面.这种现象将导致电极再生不完全，电极吸附的盐量减少，导致吸附能力下降，最终导致能耗降低，运行效率降低[19-20].所以CDI模块的再生阶段一般只能采用效率较低的短路模式.为了克服这个弱点，Lee等人在CDI技术的基础上进行了改进，并首次科学地证明了膜电容去离子（MCDI）的功效[21]，MCDI模块可以根据具体实验需求，在每个阳极和阴极的表面都覆盖相应的阳离子和阴离子交换膜.这种设计只允许反离子自由地进入和离开离子交换膜和多孔电极，而共离子的进出则被阻挡，这将导致电极脱盐效率和吸附容量的增加，提高运行效率[22-23].尤其是在再生步骤期间，相对于只能使用短接的CDI模块，MCDI模块完全可以使用反接模式.由于离子交换膜的限制阻挡作用，反离子可以从电极区域完全释放，使再生完全.因此，在MCDI中离子交换膜的应用是提高运行效率最关键的因素.近年来，聚乙烯醇（PVA）由于其具有成膜能力强，亲水性好的优势，常常作为离子交换膜的聚合物基质，可通过冷冻、热处理、辐射和化学交联改善其机械性能和热稳定性[24-25].然而，PVA本身没有固定电荷并且亲水性差，通常需要使用有机官能团如羟基、胺、羧酸盐、磺酸盐和季铵提供亲水或离子基团.通常所有能够与羟基反应的多官能化合物都可以与PVA交联以获得空间网络结构[26-27].Kim等人研究了聚乙烯醇和磺基琥珀酸的交联阳离子交换聚合物膜，并运用在了膜电容去离子领域，得到了复合膜的使用使电容去离子系统脱盐能力增强的结论[19]，然而作者只研究了涂层碳电极对脱盐性能的影响，并没有具体给出PVA与SSA复合最优化的制备工艺和参数条件比例.所以这项工作的目的是找寻到制备交联的磺基琥珀酸聚乙烯醇复合膜最佳反应条件与参数，以降低膜成本并获得高脱盐效率.为了实现该目的，将磺基琥珀酸（SSA）添加到聚乙烯醇基质中.在该研究中，在各种交联温度下制备具有不同磺基琥珀酸组成的交联SSA/PVA复合膜.在这里，预期交联的SSA/PVA复合膜由于添加磺酸基和未参加交联反应的羧基而导致高的脱盐效率，并且成本低廉，每平米约为104元（见表1）.l 实验材料和方法1.1 试剂分子量为75 000 ，80 000的完全水解的聚乙烯醇（PVA）作为基质原样使用，纯度为化学纯.作为亲水性基团fS03H和 COOH）的供体以及交联剂的质量分数为70%的磺基琥珀酸水溶液（SSA）购自Aldrich Co.（Milwaukee，WI，USA），纯度为分析纯.药品NaCl、KCl、NH4Cl、CaCb和MgS04均采用分析纯.溶液的配制以及实验过程中的用水都为二次蒸馏水.1.2 仪器集热式搅拌器（DF-10IS，江苏科析仪器有限公司）、强力电动搅拌机（JB90-D型，上海标本模型厂）、真空干燥箱（DZF型，上海坤天实验仪器有限公司）、四面制备器（SZQ 型，天津科信试验机厂）、真空储存/干燥器（PC-3，上海仪翀科技发展有限公司）、恒流泵（BTlOO-100M，保定普赛思恒流泵有限公司）、电导率仪（SIN-TDS310，杭州联测自动化技术有限公司）、电化学测试工作站（ZF-100，上海正方电子电器有限公司）.1.3 实验方法1.3.1 交联聚乙烯醇阳离子交换膜的制备将干燥的聚乙烯醇固体（PVA）溶解在水中，然后在90℃下加热6h以制备质量分数为10%的PVA水溶液.待冷却至室温后，向PVA水溶液中滴加质量分数分别为5%、10%、15%的磺基琥珀酸水溶液，配制不同交联剂含量的聚合物溶液，并将混合物在室温下剧烈搅拌24 h，过夜.最后进行真空脱泡处理，将得到的均相聚合物溶液浇铸到制备的碳电极（PVDF：AC=1：9，NMP作为溶剂）上，成膜用量约为0.025 g左右，用四面制备器控制成膜厚度（四面制备器选择厚度250μm的一面），在60℃的真空干燥箱中，将过量的溶剂完全蒸发，得到独立稳定的固体聚合物膜，并在不同温度下（60、70、80、90、100、130℃）进行真空干燥1h，使聚合物之间进一步发生交联反应形成离子交换复合膜，最终用测厚规测量制得的成品厚度为100 μm.聚乙烯醇和磺基琥珀酸的反应机理如图1所示.1.3.2 电容去离子装置与电吸附实验为了比较涂覆碳电极与未涂覆的电极的电容去离子性能，构建了两个单元电池.第一个单元电池仅由未涂覆的碳电极构成（表示为CDI电池），另一个由一个未涂覆的碳电极和一个涂覆的碳电极构成（表示为MCDI电池）.如图2中MCDI单元结构示意图所示，在MCDI电池中，涂层碳电极充当的是阴极（负极），因为实验制备的薄膜涂层为阳离子交换层，其自身带有负电荷，理论上仅允许阳离子自由进出.每个单元电池都是由两个相对放置的平行的电极片组成的，同时用柔性石墨片作为电极背面上的惰性集电极，相邻电极片之间用多孔隔板隔开，形成液流通道，同时也可以防止电路短路.每个活性炭电极的平面尺寸大小为60 mm×60 mm.为使液体能自由流动，在每个电极的中心位置都留有一个直径为1.3 cm的小孔，形成液流通道.最后，将所有电极单元都组装在有机玻璃装置中，用螺丝紧固，留有进水口和出水口.装置实物图正面与侧面如图3所示.兩个单元电池（CDI，MCDI）的电吸附实验以直通式模式进行，系统示意图如图2所示.该系统由储液器，蠕动泵，单元电池和电导率仪组成.预先配置好浓度为10 mmol/L的NaCl水溶液（现配现用），进料溶液经由软橡皮管，通过蠕动泵流人单元电池中.施加预先设定的电位300 s后，首先进行1h的吸附试验，而后将电池电位改为0V，再进行1h的解吸试验.实验过程中，储液器内溶液电导率的变化用电导率仪检测并记录.2 结果与讨论2.1 离子迁移数交联聚乙烯醇阳离子交换膜的离子选择透过性与膜中离子交换基团的浓度（固定离子浓度）与外部溶液的浓度之比有关，在本研究中，用离子迁移数来衡量离子交换膜选择性的大小.一般来说，迁移数的测量有两种方法：膜电势法和电渗析法.该实验采用膜电势法计算的离子迁移数值为静态迁移数，用NaCl溶液（Na+和Cl-的迁移率几乎相等）来进行膜电势的检测[28].迁移数的测试在两室式测试池中进行.将膜样品在1 mol/L NaCl溶液中浸泡2h以上，取出夹在两室之间.两池中注入相同体积不同浓度的NaCl溶液（实验过程中，固定稀释室溶液的浓度为5 mmol/L，浓缩室溶液的浓度发生改变（5～500 mmol/L），恒温25℃静置5 min.通过一对Ag/AgCl参比电极（用水充分洗涤并静置一夜）测量开路电位.一般来说，当浓缩溶液的浓度与稀释溶液的浓度的比率相对较高时，测量的膜电位也更高.当使用具有1：1化合价的电解质溶液并且忽略参比电极与其周围溶液之间的电位差时，可以根据式（1）[29]计算静态迁移数：其中a士1和a士2分别是稀溶液和浓溶液的平均离子活度;F是法拉第常数;VM是膜电位;R是气体常数;T是绝对温度;t+是膜中阳离子的迁移数.图4af显示了在不同交联温度下（60、70、80、90、100和130℃）交联聚乙烯醇膜的电位与理论模拟结果，以下每组实验数据均为后3次循环实验结果求平均值所得（第一/二个循环时实验仍不稳定，故不予采用）.不同交联温度下，聚乙烯醇膜的离子迁移数计算结果如图5所示，可以看出，当交联温度为100℃时，膜的迁移数最大，离子选择性最佳.聚合物电解质膜的离子选择性主要受交联剂的含量和温度的影响，如图6所示.随着温度的升高，聚乙烯醇与磺基琥珀酸的交联程度逐渐增大，一方面为聚合物基质引入作为运输离子载体的基团-S03H，增强离子选择性，另一方面随着交联度增大，聚合物结构的密集，使得聚合物中容纳和转移水合离子的空间降低，离子选择性降低.当交联温度为100℃时，膜处于部分交联状态，温度太低，交联度不够，离子基团不足;温度太高，交联度太大，使用于交换离子的基团减少，聚合物空间减少，同时太高的温度也会破坏磺酸基团和酯键的结构.图7a-c显示了在100℃的交联温度下不同SSA含量（质量分数分别为5%、15%、30%）的膜电位测试与理论拟合结果，同样地，每组实验数据均为后3次循环实验结果求平均值所得.图8中表示的是不同含量SSA，聚乙烯醇膜的迁移数计算结果.可以看出，当SSA质量分数为5%时，离子选择性最佳.PVA/SSA膜的交联度显著影响它的离子选择性，要综合考虑聚合物电解质中能容纳和转移水合离子的空间以及离子基团数量，当交联剂质量分数为5%时，获得最佳交联度，聚合物空间和离子基团数位于最佳水平，使其选择性达到最佳.2.2 交联聚乙烯醇阳离子交换膜的电容去离子行为2.2.1 典型的吸附脱附曲线图9表示交联聚乙烯醇阳离子交换膜的一次完整的电容吸附脱附曲线.在电容去离子实验运行过程中，施加在电极两端的固定吸附电压为1.2 V，蠕动泵的固定流速为30 mL/min，.由图可知，NaCl水溶液（进料液）的初始电导率为620 μS/cm，利用转换公式得初始浓度即为5 mmol/L.在吸附阶段，本体溶液中的能自由移动的离子（Na+和Cl-）由于静电作用，离开溶液而被吸附至电极表面，溶液中离子浓度减小，电导率呈下降趋势，充电电流直线衰减趋近于零（由于漏电流的存在，充电电流不会下降为零），直到电极达到吸附容量最大值，满足双电层吸附特征，符合典型的双电层电容充电行为;而在脱附阶段，电极表面吸附的带电粒子回到本体溶液中，溶液自由移动离子浓度增加，电导率得以回升，放电电流同样直线减小并趋近于零，满足双电层脱附特征，符合典型的双电层电容放电行为.电极在这样一次完整的充放电过程后得以再生，得到典型的吸附脱附曲线.1.3 实验方法1.3.1 交联聚乙烯醇阳离子交换膜的制备将干燥的聚乙烯醇固体（PVA）溶解在水中，然后在90℃下加热6h以制备质量分数为10%的PVA水溶液.待冷却至室温后，向PVA水溶液中滴加质量分数分别为5%、10%、15%的磺基琥珀酸水溶液，配制不同交联剂含量的聚合物溶液，并将混合物在室温下剧烈搅拌24h，过夜.最后进行真空脱泡处理，将得到的均相聚合物溶液浇铸到制备的碳电极（PVDF：AC=1：9，NMP作为溶剂）上，成膜用量约为0.025 g左右，用四面制备器控制成膜厚度（四面制备器选择厚度250μm的一面），在60℃的真空干燥箱中，将过量的溶剂完全蒸发，得到独立稳定的固体聚合物膜，并在不同温度下（60、70、80、90、100、130℃）进行真空干燥1h，使聚合物之间进一步发生交联反应形成离子交换复合膜，最终用测厚规测量制得的成品厚度为100 μm.聚乙烯醇和磺基琥珀酸的反应机理如图1所示.1.3.2 电容去离子装置与电吸附实验为了比较涂覆碳电极与未涂覆的电极的电容去离子性能，构建了两个单元电池.第一个单元电池仅由未涂覆的碳电极构成（表示为CDI电池），另一个由一个未涂覆的碳电极和一个涂覆的碳电极构成（表示为MCDI电池）.如图2中MCDI单元结构示意图所示，在MCDI电池中，涂层碳电极充当的是阴极（负极），因为实验制备的薄膜涂层为阳离子交換层，其自身带有负电荷，理论上仅允许阳离子自由进出.每个单元电池都是由两个相对放置的平行的电极片组成的，同时用柔性石墨片作为电极背面上的惰性集电极，相邻电极片之间用多孔隔板隔开，形成液流通道，同时也可以防止电路短路.每个活性炭电极的平面尺寸大小为60 mm×60 mm.为使液体能自由流动，在每个电极的中心位置都留有一个直径为1.3 cm的小孔，形成液流通道.最后，将所有电极单元都组装在有机玻璃装置中，用螺丝紧固，留有进水口和出水口.装置实物图正面与侧面如图3所示.两个单元电池（CDI，MCDI）的电吸附实验以直通式模式进行，系统示意图如图2所示.该系统由储液器，蠕动泵，单元电池和电导率仪组成.预先配置好浓度为10 mmol/L的NaCl水溶液（现配现用），进料溶液经由软橡皮管，通过蠕动泵流人单元电池中.施加预先设定的电位300 s后，首先进行1h的吸附试验，而后将电池电位改为0V，再进行1h的解吸试验.实验过程中，储液器内溶液电导率的变化用电导率仪检测并记录.2 结果与讨论2.1 离子迁移数交联聚乙烯醇阳离子交换膜的离子选择透过性与膜中离子交换基团的浓度（固定离子浓度）与外部溶液的浓度之比有关，在本研究中，用离子迁移数来衡量离子交换膜选择性的大小.一般来说，迁移数的测量有两种方法：膜电势法和电渗析法.该实验采用膜电势法计算的离子迁移数值为静态迁移数，用NaCl溶液（Na+和Cl-的迁移率几乎相等）来进行膜电势的检测[28].迁移数的测试在两室式测试池中进行.将膜样品在1 mol/L NaCl溶液中浸泡2h以上，取出夹在两室之间.两池中注入相同体积不同浓度的NaCl溶液（实验过程中，固定稀释室溶液的浓度为5 mmol/L，浓缩室溶液的浓度发生改变（5～500 mmol/L），恒温25℃静置5 min.通过一对Ag/AgCl参比电极（用水充分洗涤并静置一夜）测量开路电位.一般来说，当浓缩溶液的浓度与稀释溶液的浓度的比率相对较高时，测量的膜电位也更高.当使用具有1：1化合价的电解质溶液并且忽略参比电极与其周围溶液之间的电位差时，可以根据式（1）[29]计算静态迁移数：其中a士1和a士2分别是稀溶液和浓溶液的平均离子活度;F是法拉第常数;VM是膜电位;R是气体常数;T是绝对温度;t+是膜中阳离子的迁移数.图4af显示了在不同交联温度下（60、70、80、90、100和130℃）交联聚乙烯醇膜的电位与理论模拟结果，以下每组实验数据均为后3次循环实验结果求平均值所得（第一/二个循环时实验仍不稳定，故不予采用）.不同交联温度下，聚乙烯醇膜的离子迁移数计算结果如图5所示，可以看出，当交联温度为100℃时，膜的迁移数最大，离子选择性最佳.聚合物电解质膜的离子选择性主要受交联剂的含量和温度的影响，如图6所示.随着温度的升高，聚乙烯醇与磺基琥珀酸的交联程度逐渐增大，一方面为聚合物基质引入作为运输离子载体的基团-S03H，增强离子选择性，另一方面随着交联度增大，聚合物结构的密集，使得聚合物中容纳和转移水合离子的空间降低，离子选择性降低.当交联温度为100℃时，膜处于部分交联状态，温度太低，交联度不够，离子基团不足;温度太高，交联度太大，使用于交换离子的基团减少，聚合物空间减少，同时太高的温度也会破坏磺酸基团和酯键的结构.图7a-c显示了在100℃的交联温度下不同SSA含量（质量分数分别为5%、15%、30%）的膜电位测试与理论拟合结果，同样地，每组实验数据均为后3次循环实验结果求平均值所得.图8中表示的是不同含量SSA，聚乙烯醇膜的迁移数计算结果.可以看出，当SSA质量分数为5%时，离子选择性最佳.PVA/SSA膜的交联度显著影响它的离子选择性，要综合考虑聚合物电解质中能容纳和转移水合离子的空间以及离子基团数量，当交联剂质量分数为5%时，获得最佳交联度，聚合物空间和离子基团数位于最佳水平，使其选择性达到最佳.2.2 交联聚乙烯醇阳离子交换膜的电容去离子行为2.2.1 典型的吸附脱附曲线图9表示交联聚乙烯醇阳离子交换膜的一次完整的电容吸附脱附曲线.在电容去离子实验运行过程中，施加在电极两端的固定吸附电压为1.2 V，蠕动泵的固定流速为30 mL/min，.由图可知，NaCl水溶液（进料液）的初始电导率为620 μS/cm，利用转换公式得初始浓度即为5 mmol/L.在吸附阶段，本体溶液中的能自由移动的离子（Na+和Cl-）由于静电作用，离开溶液而被吸附至电极表面，溶液中离子浓度减小，电导率呈下降趋势，充电电流直线衰减趋近于零（由于漏电流的存在，充电电流不会下降为零），直到电极达到吸附容量最大值，满足双电层吸附特征，符合典型的双电层电容充电行为;而在脱附阶段，电极表面吸附的带电粒子回到本体溶液中，溶液自由移动离子浓度增加，电导率得以回升，放电电流同样直线减小并趋近于零，满足双电层脱附特征，符合典型的双电层电容放电行为.电极在这样一次完整的充放电过程后得以再生，得到典型的吸附脱附曲线.1.3 实验方法1.3.1 交联聚乙烯醇阳离子交换膜的制备将干燥的聚乙烯醇固体（PVA）溶解在水中，然后在90℃下加热6h以制备质量分数为10%的PVA水溶液.待冷却至室温后，向PVA水溶液中滴加质量分数分别为5%、10%、15%的磺基琥珀酸水溶液，配制不同交联剂含量的聚合物溶液，并将混合物在室温下剧烈搅拌24 h，过夜.最后进行真空脱泡处理，将得到的均相聚合物溶液浇铸到制备的碳电极（PVDF：AC=1：9，NMP作为溶剂）上，成膜用量约为0.025 g左右，用四面制备器控制成膜厚度（四面制备器选择厚度250μm的一面），在60℃的真空干燥箱中，将过量的溶剂完全蒸发，得到独立稳定的固体聚合物膜，并在不同温度下（60、70、80、90、100、130℃）进行真空干燥1h，使聚合物之间进一步发生交联反应形成离子交换复合膜，最终用测厚规测量制得的成品厚度为100 μm.聚乙烯醇和磺基琥珀酸的反应机理如图1所示.1.3.2 电容去离子装置与电吸附实验为了比较涂覆碳电极与未涂覆的电极的电容去离子性能，构建了两个单元电池.第一个单元电池仅由未涂覆的碳电极构成（表示为CDI电池），另一个由一个未涂覆的碳电极和一个涂覆的碳电极构成（表示为MCDI电池）.如图2中MCDI单元结构示意图所示，在MCDI电池中，涂层碳电极充当的是阴极（负极），因为实验制备的薄膜涂层为阳离子交换层，其自身带有负电荷，理论上仅允许阳离子自由进出.每个单元电池都是由两个相对放置的平行的电极片组成的，同时用柔性石墨片作为电极背面上的惰性集电极，相邻电极片之间用多孔隔板隔开，形成液流通道，同时也可以防止电路短路.每个活性炭电极的平面尺寸大小为60 mm×60 mm.为使液体能自由流动，在每个电极的中心位置都留有一个直径为1.3 cm的小孔，形成液流通道.最后，将所有电极单元都组装在有机玻璃装置中，用螺丝紧固，留有进水口和出水口.装置实物图正面与侧面如图3所示.两个单元电池（CDI，MCDI）的电吸附实验以直通式模式进行，系统示意图如图2所示.该系统由储液器，蠕动泵，单元电池和电导率仪组成.预先配置好浓度为10 mmol/L的NaCl水溶液（现配现用），进料溶液经由软橡皮管，通过蠕动泵流人单元电池中.施加预先设定的电位300 s后，首先进行1h的吸附试验，而后将电池电位改为0V，再进行1h的解吸试验.实验过程中，储液器内溶液电导率的变化用电导率仪检测并记录.2 结果与讨论2.1 离子迁移数交联聚乙烯醇阳离子交换膜的离子选择透过性与膜中离子交换基团的浓度（固定离子浓度）与外部溶液的浓度之比有关，在本研究中，用离子迁移数来衡量离子交换膜选择性的大小.一般来说，迁移数的测量有两种方法：膜电势法和电渗析法.该实验采用膜电势法计算的离子迁移数值为静态迁移数，用NaCl溶液（Na+和Cl-的迁移率几乎相等）来进行膜电势的检测[28].迁移数的测试在两室式测试池中进行.将膜样品在1 mol/L NaCl溶液中浸泡2h以上，取出夹在两室之间.两池中注入相同体积不同浓度的NaCl溶液（实验过程中，固定稀释室溶液的浓度为5 mmol/L，浓缩室溶液的浓度发生改变（5～500 mmol/L），恒温25℃静置5 min.通过一对Ag/AgCl参比电极（用水充分洗涤并静置一夜）测量开路电位.一般来说，当浓缩溶液的浓度与稀释溶液的浓度的比率相对较高时，测量的膜电位也更高.当使用具有1：1化合价的电解质溶液并且忽略参比电极与其周围溶液之间的电位差时，可以根据式（1）[29]计算静态迁移数：其中a士1和a士2分别是稀溶液和浓溶液的平均离子活度;F是法拉第常数;VM是膜电位;R是气体常数;T是绝对温度;t+是膜中阳离子的迁移数.图4af显示了在不同交联温度下（60、70、80、90、100和130℃）交联聚乙烯醇膜的电位与理论模拟结果，以下每组实验数据均为后3次循环实验结果求平均值所得（第一/二个循环时实验仍不稳定，故不予采用）.不同交联温度下，聚乙烯醇膜的离子迁移数计算结果如图5所示，可以看出，当交联温度为100℃时，膜的迁移数最大，离子选择性最佳.聚合物电解质膜的离子选择性主要受交联剂的含量和温度的影响，如图6所示.随着温度的升高，聚乙烯醇与磺基琥珀酸的交联程度逐渐增大，一方面为聚合物基质引入作为运输离子载体的基团-S03H，增强离子选择性，另一方面随着交联度增大，聚合物结构的密集，使得聚合物中容纳和转移水合离子的空间降低，离子选择性降低.当交联温度为100℃时，膜处于部分交联状态，温度太低，交联度不够，离子基团不足;温度太高，交联度太大，使用于交换离子的基团减少，聚合物空间减少，同时太高的温度也会破坏磺酸基团和酯键的结构.图7a-c显示了在100℃的交联温度下不同SSA含量（质量分数分别为5%、15%、30%）的膜电位测试与理论拟合结果，同样地，每组实验数据均为后3次循环实验结果求平均值所得.图8中表示的是不同含量SSA，聚乙烯醇膜的迁移数计算结果.可以看出，当SSA质量分数为5%时，离子选择性最佳.PVA/SSA膜的交联度显著影响它的离子选择性，要综合考虑聚合物电解质中能容纳和转移水合离子的空间以及离子基团数量，当交联剂质量分数为5%时，获得最佳交联度，聚合物空间和离子基团数位于最佳水平，使其选择性达到最佳.2.2 交联聚乙烯醇阳离子交换膜的电容去离子行为。