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第九章吸光光度法知识点吸光光度法是基于分子对光的选择性吸收而建立的一种分析方法，包括比色法、紫外一可见吸光光度法、红外光谱法等。
1．吸光光度法的基本原理①物质对光的选择性吸收：当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的物质为溶液，光的散射可以忽略。
当一束白光照射某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。
吸收光与透射光互为补色光(它们混合在一起可组成白光)。
分子与原子、离子一样，都具有不连续的量子化能级，在一般情况下分子处于最低能态(基态)。
当入射光照射物质时，分子会选择性地吸收某些频率的光子的能量，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E激发态一E基态与选择性吸收的光子能量hv的关系为Hv=E激发态一E基态分子运动包括分子的转动、分子的振动和电子的运动。
分子转动、振动能级间隔一般小于1 eV，其光谱处于红外和远红外区。
电子能级间的能量差一般为1～20 eV，由电子能级跃迁而产生的吸收光谱位于紫外及可见光区，其实验方法为比色法和可见-紫外吸光光度法。
②吸收曲线：以波长为横坐标，以吸收光的强度为纵坐标绘制的曲线，称为吸收光谱图，也称吸收曲线。
它能清楚地描述物质对不同波长的光的吸收情况。
③光的吸收定律——朗伯一比尔定律：当一束平行单色光垂直通过一厚度为b、非散射的均匀吸光物质溶液时，吸光物质吸收光能，致使透射光强度减弱。
若用I。
表示入射光强度，I t表示透射光强度，I。
与I t之比称为透光率或透光度T，T=I。
/I t，吸光物质对光的吸收程度，还常用吸光度A表示，A=lgT=log I。
/I t。
实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比，此即朗伯一比尔定律，其数学表达式为A=lgT=log I。
/I t =abc式中，a为吸收系数。
溶液浓度以g·L-1为单位、液层厚度以cm 为单位时，a的单位为L·g-1·cm-1。
第九章吸光光度法§9—1 填充题1．朗伯－比尔定律只有在（）光下才能成立。
2．吸光度Ａ与透光度Ｔ的关系为（）。
3．光度分析中,要求入射光的颜色与被测溶液的颜色的关系为（）。
4．某种溶液在254nm处的透过百分率T％=10％，则其吸光度为（）。
5．某化合物的ε＝14500，若比色杯厚度为1.0cm，c＝1.0×10-4mol·L-1时则透过百分率T%＝（）% 。
6．吸光光度法对显色反应的要求是( )、( )、（）。
7．吸光光度法是基于（）而建立起来的分析方法。
8．吸光度A＝abc, 其中符号c代表（）,b代表（）, a称为（)。
当c等于（）, b等于（）时，则a以符号（）表示，并称为（)。
9．在吸光光度法中，透光率(T)和溶液浓度的函数关系式为( ) 。
10．在分光光度法中，吸光度Ａ在（）范围内浓度测量的相对误差较小，与其相对应的透光率范围为（）。
11．蓝色和黄色按一定强度和比例组合成（）光。
因此，这两种单色光互相称为（）光。
12．用分光光度法测定Ni2+，在470nm 处用2cm 比色皿测得c(Ni2+) ＝1.0×10-5 mol·L-1，溶液的透光率为55%，吸光度A =（）；摩尔吸光系数ε= （）；其单位是（）。
13．光度计的种类和型号繁多，但都是由下列基本部件组成的：（）→( ) →( ) →( )14．分光光度法的原理与光电比色法相同，只是分光的方法不同。
前者用（）或（）作分光器，后者则用（）。
15．同一种有色溶液，其浓度越大, 液层越厚, 吸收的光越（），颜色也越（）。
16．目视比色法是借助比较未知液与标准溶液颜色（）来判断待测物质浓度的一种方法。
而光电比色计和分光光度计则用辐射光被显色溶液所（）来判断待测物质的（）。
18．光电比色法和目视比色法的原理相同，只是测量透过光强度的方法不同，前者用（）来判断，而后者却用（）来判断。
答案1．单色；2．－lgＴ；3．互补色；4．1.0 ；5．3.5；6．选择性要好；灵敏度要高；有色物质组成要恒定。
第九章紫外可见吸收光谱法§9-1 概述利用紫外可见分光光度计测量物质对紫外可见光的吸收程度〔吸光度〕和紫外可见吸收光谱来确定物质的组成、含量，推测物质结构的分析方法，称为紫外可见吸收光谱法或紫外可见分光光度法〔ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-VIS〕。
它具有如下特点：〔1〕灵敏度高适于微量组分的测定，一般可测定10-6g级的物质，其摩尔吸收系数可以到达104~105数量级。
(2) 准确度较高其相对误差一般在1%~5%之。
(3) 方法简便操作容易、分析速度快。
(4) 应用广泛不仅用于无机化合物的分析，更重要的是用于有机化合物的鉴定与结构分析〔鉴定有机化合物中的官能团〕。
可对同分异构体进展鉴别。
此外，还可用于配合物的组成和稳定常数的测定。
紫外可见吸收光谱法也有一定的局限性，有些有机化合物在紫外可见光区没有吸收谱带，有的仅有较简单而宽阔的吸收光谱，更有个别的紫外可见吸收光谱大体相似。
例如，甲苯和乙苯的紫外吸收光谱根本一样。
因此，单根据紫外可见吸收光谱不能完全决定这些物质的分子结构，只有与红外吸收光谱、核磁共振波谱和质谱等方法配合起来，得出的结论才会更可靠。
§9-2 紫外可见吸收光谱法的根本原理当一束紫外可见光〔波长围200~760nm〕通过一透明的物质时，具有某种能量的光子被吸收，而另一些能量的光子那么不被吸收，光子是否被物质所吸收既决定于物质的部结构，也决定于光子的能量。
当光子的能量等于电子能级的能量差时〔即ΔE电 = h f〕，那么此能量的光子被吸收，并使电子由基态跃迁到激发态。
物质对光的吸收特征，可用吸收曲线来描述。
以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得到的A-λ曲线即为紫外可见吸收光谱〔或紫外可见吸收曲线〕。
它能更清楚地描述物质对光的吸收情况〔图9-1〕。
从图9-1中可以看出：物质在某一波长处对光的吸收最强，称为最大吸收峰，对应的波长称为最大吸收波长〔λmax〕；低于高吸收峰的峰称为次峰；吸收峰旁边的一个小的曲折称为肩峰；曲线中的低谷称为波谷其所对应的波长称为最小吸〕；在吸收曲线波长最短的一端，吸收强度相当大，但不成峰形的收波长〔λmin局部，称为末端吸收。
第九章吸光光度法本章介绍的吸光光度法是一种仪器分析方法(其中目视比色法不必用仪器)。
一种方法能用来进行物质的定量分析，测量的物理量与被测组分的浓度之间必须存在确定的定量的关系。
这是定量测量方法的理论基础。
另一方面，还需要考虑仪器设备的设计和测试条件的选择，以保证方法符合定量基本关系式，并保证有较高的准确度和可操作性。
利用光信号测定物质含量的方法很多，基于物质对光具有选择吸收的特性而建立起来的分析方法，称为吸光光度法。
根据产生光吸收的质点不同，又可分为分子吸收光谱法和原子吸收光谱法。
本章中讨论的紫外-可见吸光光度法是分子吸收光谱法的一种。
9.1 概述9.1.1 光的基本性质光是一种电磁波，按照波长(或频率)排列，可得到电磁波谱图：光具有波粒二象性，一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。
具有相同能量(相同波长)的光为单色光，由不同能量(不同波长)的光组合在一起的称为复合光。
若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补光，这种现象称为光的互补。
白光是复合光，让一束白光通过分光元件，它将分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光。
即可见光谱。
9.1.2 光与物质的作用当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸收或透射现象，若被照射的物质为溶液，光的散射可以忽略。
当一束白光照射某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。
吸收光与透射光互为补色光。
如硫酸铜溶液吸收白光中的黄色光而呈现蓝色；高锰酸钾溶液吸收黄绿色的光而呈紫红色。
分子、原子和离子，都具有不连续的量子化能级，在一般情况下分子处于最低能态(基态)。
当入射光照射物质时，分子会选择性地吸收了某些波长的光，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E 激发态－E 基态与选择性吸收的光子能量h ν 的关系为：h ν = E 激发态－E 基态 分子运动包括分子的转动、分子的振动和电子的运动。
分子转动、振动能级间隔一般小于1ev ，其光谱处于红外和远红外区。
电子能级间的能量差一般为1～20ev ，由电子能级跃迁而产生的吸收光谱位于紫外及可见光区，其实验方法为比色法和可见、紫外吸光光度法。
9.1.3 定性分析及定量分析的基础1. 定性分析基础吸收光谱取决于分子的结构，以及分子轨道上电子的性质，不同的物质具有不同的吸收光谱，因此，吸收光谱可提供定性分析的信息。
2. 定量分析基础对同一物质而言，浓度不同，对特定波长光的吸收强度不同，因此，吸收强度可提供定量分析的信息。
从不同浓度的高锰酸钾溶液的吸收光谱图可知，在波长535nm 处的吸光强度与浓度间存在定量的关系，可由此进行定量分析。
9.1.4 吸收定律1. 朗伯—比尔定律一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一部分被器皿的表面反射。
设入射光强度为I 0'，吸收光强度为I a ，透过光强度为I t ，反射光强度为I r 。
则r t a '0I I I I ++=在吸光光度法中，通常将试液和空白溶液分别置于同样材质及同样厚度的吸收皿中，因此反射光的强度基本相同，其影响可以相互抵消，故可以忽略反射光的影响，可得到下式：t a o I I I +=。
即光强为I 0的入射光通过试液皿后，一部分光被吸收，一部分光被透射。
I t 与I 0之比称为透光率或透光度T ， T = I t /I 0吸光物质对光的吸收程度，还常用吸光度A 表示：A = - lg T =lg (I 0/I t )实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A 与溶液浓度c和液层厚度b 的乘积成正比，此即朗伯—比尔（Lambert —Beer ）定律，其数学表达式为：KbcI I A t==0lg 2. 摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度当溶液浓度以mol/L 为单位时，液层厚度以cm 为单位时，K 常用ε 代替，ε 称为摩尔吸收系数，其单位为L .mol -1.cm -1。
此时朗伯-比尔定律可写为：A =εbc摩尔吸收系数ε是吸光物质在给定波长和溶剂下的特征常数，数值上等于1mol/L 吸光物质溶液和液层厚度为1cm 时溶液的吸光度，它表示吸光物质对指定频率的光子的吸收本领。
ε 越大，表示该物质对某波长光的吸收能力越强，该测定方法的灵敏度也就越高。
一般认为，ε<104，则方法的灵敏度较低； ε在104~5⨯104时，方法的灵敏度为中等；ε在5⨯104~105时，灵敏度高；ε>105，属超高灵敏度。
还可用桑德尔灵敏度（灵敏度指数）S 表示方法的灵敏度，Sandell 对S 的定义是：在一定的波长下，测得的吸光度A=0.001时，1 cm 2截面积内所含的吸光物质的量，其单位为μg/cm 2。
S 与ε的关系的推导： A ＝0.001＝εbc ，bc ＝0.001/εb 为吸收池的厚度，单位为cm ，c 的单位为mol/L ， bc 乘以待测物的摩尔质量M (g/mol)，就是单位截面积内待测物的质量，即S =b (cm)⨯c(mol/dm 3)⨯M (g/mol)⨯106μg/g ＝30.00110M Mεε⨯⨯=(μg/cm 2)。
例1. 某试液用2cm 比色皿测量时，T =60%，若改用1cm 或3cm 比色皿，T 及A 分别等于多少？解：设某试液用2cm 比色皿测量时的吸光度为A o ,用1cm 和3cm 比色皿测得的吸光度为A 1和A 2。
因为A 与T 之间的关系是A = -lg T ，所以A o =0.22。
根据朗伯-比尔定律可知：A =εb 1c ，所以A 1=A 0b 1/b o =0.11,T 1=110A -=0.78.A 2=A 0b 2/b o =0.33, T 3=310A -=0.47.例2. 已知含Fe 2+浓度为500g/L 的溶液，用邻二氮菲比色测定铁，比色皿厚度为2cm ，在波长508nm 处测得吸光度A =0.19，计算摩尔吸收系数。
解：L/mol 109.885.551050066Fe--⨯=⨯=c)cm mol (L 101.1109.8219.01146---⋅⋅⨯=⨯⨯==bc A ε例3. 双硫腙显色法测定铅的ε＝6.8⨯10411cm mol L --⋅⋅，求桑德尔灵敏度 S 。
解：S ＝M /ε＝207/6.8⨯104=0.0030(μg/cm 2)9.2 目视比色法与分光光度法朗伯—比尔定律是光度法定量分析的基础。
可以通过仪器测吸光度，然后通过与标准的比较法或标准曲线法得到被测组分的浓度。
也可通过肉眼直接观测颜色的深浅判断组分含量。
9.2.1 目视比色法目视比色法是用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。
一般采用标准系列法。
即在一套等体积的比色管中配置一系列浓度不同的标准溶液，并按同样的方法配置待测溶液，待显色反应达平衡后，从管口垂直向下观察(对于高含量的试样，也可从管侧面观察) ，比较待测溶液与标准系列中哪一个标准溶液颜色相同，便表明二者浓度相等。
如果待测试液的颜色介于某相邻两标准溶液之间，则待测试样的含量可取两标准溶液含量的中间值。
优点是操作简便，适宜于野外或现场快速测定，可在复合光-白光下进行测定，某些不符合朗伯-比尔定律的显色反应，仍可用该法进行测定。
主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。
9.2.2 分光光度法1. 分光光度计分光光度计按工作波长范围分类，可分为紫外-可见分光光度计和可见光分光光度计。
按照光路的设计方式可分为单光束、双光束和单波长、双波长分光光度计等。
尽管分光光度计的种类和型号繁多，但它们都是以下基本部件组成的。
(1) 分光光度计的主要组成部件：光源、单色器、吸收池、检测器和显示装置。
光源：(Light source)：光源的作用是提供所需波长范围内的连续光谱，光源要有足够的光强度，能量分布均匀，稳定。
电源电压的微小波动会引起灯光强度的很大变化，因此需要用稳压电源。
可见分光光度计的光源多属热光源，如钨灯、碘钨灯等，钨灯发射光谱波长范围为400～1000nm，在可见和近红外区。
碘钨灯发射光谱波长范围320 ～2500 nm。
紫外区使用氢灯或氘灯(180 ～375 nm)。
单色器：(monochromator)：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
比色计的单色器一般是滤光片，分光光度计的单色器通常由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成。
可见分光光度计常用玻璃棱镜，玻璃棱镜适合的波长为350 ～3200 nm；紫外-可见分光光度计常用石英棱镜，这是由于玻璃对紫外光有较强吸收的缘故，石英棱镜适合的波长为185 ～4000 nm。
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的色散元件，它具有适用波长范围宽、分辨性能好和色散均匀等优点。
吸收池也称比色皿(coloritrough) ：吸收池用来盛放试液。
按制作材料可分为石英和玻璃吸收池，前者用于紫外和可见区，后者仅用于可见区。
检测器(detector)：利用光电效应，将光能转成电流讯号。
常用的有光电池，光电管，光电倍增管、光电二极管、光导摄象管等。
显示装置 ：检流计、微安表、数字显示记录仪等。
(2) 几种不同类型分光光度计单光束分光光度计(single beam spectrophotometer)，如721型分光光度计为可见光单光束分光光度计的类型。
仪器光路示意图如下。
双波长分光光度计(double wavelength spectrophotometer)、双光束分光光度计(double beam spectrophotometer)或双波长—双光束分光光度计：双光束分光光度计是将单色光分成两束，一束通过参比池，另一束通过样品池，经一次测量，检测器直接得到的是样品池与参比池吸光度的差，即空白样A A A -=∆。
双波长分光光度计是将同一光源发出的光分成两束，以一定的频率交替照射同一吸收池，经光电倍增管和电子控制系统，由指示器显示出两个波长处的吸光度之差，即。
利用双波长光度计可消除干扰组分或混浊试样背景对测定的影响，往往可提高方法的灵敏度和选择性。
该类型仪器与单光束仪器的比较如下图。
光学多通道分光光度计(optical multichannel spectrophotometer )是20世纪80 年代问世的产品，是一种具有全新光路系统的仪器。
由钨灯或氘灯发射的复合光先通过样品池后再经全息光栅色散，色散后的单色光由光二极管阵列中的光二极管接收，一个光二极管阵列一般能容纳数百个光二极管，可覆盖190~900nm 波长范围。
全部波长同时被检测，所以响应非常快。
