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溶菌酶的分离纯化综合设计性实验要求请根据你所学的酶分离纯化方法或生化手段，设计一套从鸡蛋中分离纯化溶菌酶的综合性实验方案并写出具体实施内容。
实验内容包括：1. 溶菌酶分离纯化，包括粗提和精提；2. 不同纯度溶菌酶活力测定；3.测定蛋白质浓度；4.测定溶菌酶分子量。
实验方案形式（参考）：实验项目一（如酶的提取）溶菌酶又称胞壁质酶或N－乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种国内外很紧俏的生化物质，广泛应用于医学临床。
具有多种药理作用，能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等，有抗菌的作用，常用于治疗五官科多种粘膜炎症、皮肤科带状疱疹等疾病。
是优良的天然防腐剂，可用于食品的防腐保鲜。
尤其重要的是近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。
随着生物工程的发展，提取溶菌酶具有重要的战略意义。
一、实验目的和内容掌握从鸡蛋清中提取溶菌酶的基本方法了解溶菌酶的基本行知二、实验仪器与试剂玻璃或陶瓷容器、pH计、细纱布、玻璃搅棒、胶头滴管、布氏漏斗等氯化钠、醋酸、氢氧化钠。
以上原料均选用化学纯试剂。
三、实验步骤(1)收集鸡蛋清：将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出(最好是新生的鸡蛋、pH值不得低于8，否则不能使用)，按其体积的两倍量加入水，轻轻搅拌5分钟，使蛋清溶液的稠度均匀，注意在搅拌过程中不能起泡，搅拌不宜过快，搅拌棒应光滑等，以防蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量，最后用双层细纱布滤除蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等。
(2)加入氯化钠：按每100毫升蛋清溶液加入2克氯化钠的比例，向蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。
(3)粗制溶菌酶：加完氯化钠细粉后，再用1摩尔／升的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的pH值调节到10.8，在用氢氧化钠溶液调节蛋清溶液的pH值，用胶头滴管将其逐滴滴入并不断搅拌，以免局部过碱而导致蛋白质的变性，从而影响溶菌酶的得率和质量。
作为一种糖苷水解酶的溶菌酶,又称 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液 (如淋巴液、组织 (如肝、肾细胞内等 [1]。
主要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸 (NAM和 N-乙酰氨基葡糖 (NAG之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽,导致细胞壁破裂而使细菌溶解。
溶菌酶对人体无毒副作用,是一种安全的天然防腐剂,具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤之功效。
可用作为药物制剂、防腐剂、基因与细胞工程中细胞融合剂等 [2]。
作为碱性酶的溶菌酶,其来源不同,水解细胞壁的性能也表现为较大差异 [3]。
溶菌酶水解微生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽聚糖, 作用位点是NAM 与 NAG 碳原子间的β-1.4糖苷键 [4]。
肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份(骨架 ,是 NAG 与 NAM 通过β-1,4 糖苷键交替排列形成的多层网状结构的共聚物[5]。
肽聚糖结构中的任何化学键断裂,都能促使细胞壁中的肽聚糖分解,导致细菌细胞壁被破坏,从而体现溶菌酶的溶菌特性 [6]。
近年来,根据不同原料及溶菌酶的特性,提取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、离子交换法、色谱法、亲和层析法等。
结晶法这一传统的方法,是由Mayer Abraham 等提出并获得结晶状溶菌酶 [7]。
本文利用湖光岩地区的鹌鹑蛋为提取原料,采用结晶法提取分离溶菌酶,进而利用重结晶的方法反复精制,可提取到所需纯度的溶菌酶晶体 [8]。
1实验1.1主要仪器、试剂与材料1.1.1 主要仪器UV-29200 紫外可见分光光度计 ; JJ-a 数控恒温磁力搅拌器 ; M304781 离心机 ; DSX-280B 蒸气压力灭菌锅 ; KYC-111 摇床 ; SW-CJ-2F 超净工作台 ; FD-1B-50 冷冻干燥机 ; 2X-15D 旋片式真空泵 ; R201 旋转蒸发仪 ; Sorvalls Upert-21 高速离心机 ; YP-5002 电子天平。
一、实验目的1. 了解溶菌酶的性质和特性；2. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法；3. 学习溶菌酶的结晶技术；4. 鉴定溶菌酶的纯度和分子量。
二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是一种广泛存在于生物体中的碱性蛋白质，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
溶菌酶能水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，导致细胞壁破裂，从而杀灭细菌。
本实验通过从鸡蛋清中提取溶菌酶，经过分离纯化后，采用硫酸铵盐析法进行结晶，并鉴定溶菌酶的纯度和分子量。
三、实验材料1. 实验仪器：高速离心机、冰箱、紫外可见分光光度计、显微镜等；2. 实验试剂：鸡蛋清、硫酸铵、NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、pH 7.0 Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE电泳试剂等；3. 实验耗材：离心管、玻璃棒、滤纸、试管、移液器、培养皿等。
四、实验步骤1. 溶菌酶提取（1）取鸡蛋清2g，加入20ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液，搅拌溶解；（2）加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（3）加入1mol/L CaCl2溶液，使CaCl2浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（4）加入1mol/L MgSO4溶液，使MgSO4浓度达到0.1mol/L，搅拌30分钟；（5）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于10ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液。
3. 溶菌酶结晶（1）取上清液5ml，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80%，搅拌30分钟；（2）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取沉淀；（3）将沉淀溶解于5ml pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，加入0.1mol/L NaCl溶液，使NaCl浓度达到0.5mol/L，搅拌30分钟；（4）用高速离心机以5000r/min离心15分钟，取上清液；（5）将上清液置于冰箱中过夜，观察结晶现象。
![基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/44d790f459eef8c75ebfb398.png)
专利名称：基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法
专利类型：发明专利
发明人：王占忠,党乐平,肖华志,王倩,方文质
申请号：CN201210464023.9
申请日：20121115
公开号：CN103387967A
公开日：
20131113
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步骤：（1）将水溶性咪唑基离子液体加入到溶液A中，A溶液为pH值为4-6.5的、质量浓度为3-6%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；（2）将鸡蛋清溶菌酶加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在20-30℃下过饱和比为1-3；（3）在搅拌下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶，降温得结晶液，过滤，晶体干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。
本发明过程控制容易实现，操作方便。
制备的溶菌酶晶体产品粒度均一，变异系数小，主粒度达到100μm以上，质量收率90%以上，晶体外观形貌完整，溶菌酶晶体相对活性明显提高。
申请人：天津大学
地址：300072 天津市南开区卫津路92号
国籍：CN
代理机构：天津市北洋有限责任专利代理事务所
代理人：陆艺
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实验讲义溶菌酶的提取和活性测定南方医科大学药学院I 溶菌酶的提取和部分纯化【试验目的】掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。
【试验原理】溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。
下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。
从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。
在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。
【仪器、材料和试剂】(一)、仪器分光光度计（二）、材料1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）3、新鲜鸡蛋4、Amberlite阳离子交换树脂5、氯化钠（三）试剂1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。
2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。
3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。
【实验步骤】（一）树脂的再生Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。
在PBS缓冲液平衡12小时以上。
（二）蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
实验三溶菌酶的提取和结晶一、实验目的学习从鸡蛋清中提取和纯化溶菌酶的方法。
二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[ ]为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
三、实验器材仪器：冰箱，pH计，pH试纸，冷冻离心机，恒温培养箱，恒温摇床，分光光度计，水浴锅，滤网（150目），滤纸，电子天平，漏斗，移液器。
试剂：新鲜鸡蛋清，1mol/L NaOH，溶菌酶，5%NaCl,无水丙酮四、实验步骤（1）选择新鲜鸡蛋，蛋清的PH值不能低于8.0。
（2）清洗：用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。
（3）破壳分离蛋清。
（4）鸡蛋清均质：搅拌10 分钟，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性。
（5）过滤：用3 层纱布将稠度均匀的蛋清液过滤，滤去残存的蛋壳及卵带。
（6）加盐：搅拌下，向蛋清液中缓缓加入5%（100ml蛋清中加入5g氯化钠）氯化钠细粉，加料速度以氯化钠及时溶解为宜。
（7）结晶：用1M 氢氧化钠溶液调PH 至9.5-10.0，边加边搅拌均匀，避免过碱引起蛋白质变性。
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪绿药1501班 201530360127 同组者：连学帆韩家鑫实验地点：东配302 实验日期：2017年5月26日-5月27日报告完成日期：2017年5月28日指导老师：易喻【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得到，在医学及食品商具有广泛应用。
本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取，然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白，提纯所得的溶菌酶粗品，并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定，确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引言】对溶菌酶的研究始于20 世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
作为一种糖苷水解酶的溶菌酶，又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液(如淋巴液)、组织(如肝)、肾细胞内等[1]。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡糖(NAG)之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽，导致细胞壁破裂而使细菌溶解。
溶菌酶对人体无毒副作用，是一种安全的天然防腐剂，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤之功效。
可用作为药物制剂、防腐剂、基因与细胞工程中细胞融合剂等[2]。
作为碱性酶的溶菌酶，其来源不同，水解细胞壁的性能也表现为较大差异[3]。
溶菌酶水解微生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽聚糖，作用位点是NAM与NAG碳原子间的β-1.4糖苷键[4]。
肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份(骨架)，是NAG 与NAM 通过 β-1，4 糖苷键交替排列形成的多层网状结构的共聚物[5]。
肽聚糖结构中的任何化学键断裂，都能促使细胞壁中的肽聚糖分解，导致细菌细胞壁被破坏，从而体现溶菌酶的溶菌特性[6]。
近年来，根据不同原料及溶菌酶的特性，提取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、离子交换法、色谱法、亲和层析法等。
结晶法这一传统的方法，是由 Mayer Abraham 等提出并获得结晶状溶菌酶[7]。
本文利用湖光岩地区的鹌鹑蛋为提取原料，采用结晶法提取分离溶菌酶，进而利用重结晶的方法反复精制，可提取到所需纯度的溶菌酶晶体[8]。
1 实验1.1 主要仪器、试剂与材料1.1.1 主要仪器UV-29200 紫外可见分光光度计；JJ-a 数控恒温磁力搅拌器；M304781 离心机；DSX-280B蒸气压力灭菌锅；KYC-111 摇床；SW-CJ-2F 超净工作台；FD-1B-50 冷冻干燥机；2X-15D 旋片式真空泵；R201 旋转蒸发仪；Sorvalls Upert-21 高速离心机；YP-5002 电子天平。
1.1.2 主要试剂R-250、G-250考马斯亮蓝；NaH2PO4；Na2HPO4；1mol/L NaOH；20000 u/mg溶菌酶标准液；3g/L牛肉膏；营养肉汤；10g/L胰蛋白陈；微球菌；5.1%的 NaCl溶液；HCl；CH3COOH；琼脂。
1.1.3 主要材料新鲜湖光岩鹌鹑蛋，购置于湖光岩农贸市场。
1.2 实验方法溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨黄赞良，谈海玉，邓彩思，张兆霞*，李 泳*（广东海洋大学，广东 湛江 524088）摘 要：以湖光岩鹌鹑蛋为原料，采用结晶法从蛋清中分离提取溶菌酶。
探讨不同条件对溶菌酶收率及活性的影响，确定溶菌酶最佳的分离提取条件：盐析NaCl质量分数为5.1%，pH=10.7，盐析时间为120h，收率达到 0.378%，酶活力达到 13700 U/mg。
关键词：盐析法；溶菌酶；酶活力中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2017）05-083-04_________________________收稿日期：2017-04-25基金项目：广东海洋大学团队项目（项目编号：C13435）, 大学生创新创业项目（项目编号：CXXL2016152）。
作者简介：黄赞良，广东海洋大学，制药工程专业，大学生。
*通讯作者：张兆霞，李泳，广东海洋大学教师，从事生物酶相关方面的科研工作。
云南化工2017年第5期·84·1.2.1 溶菌酶的提取1）将新鲜鹌鹑蛋洗净晾干、用无菌注射器收集鹌鹑蛋清液并搅拌均匀后，用纱布过滤去除蛋清中的卵带备用。
2）取一定量蛋清液，加入适量NaCl后搅拌均匀，用1M的NaOH溶液调节蛋清液，使pH=10.7左右，投入适量溶菌酶晶种后，放置于4℃环境大约5d，待析出溶菌酶晶体后，冷冻干燥得干粉溶菌酶。
1.2.2 溶菌酶底物的制备1）培养基的配制取5g NaCl，3.0g牛肉浸取物，10.0g蛋白胨，放置于1 L 蒸馏水中溶解，加入2%的琼脂液，用酸碱液调节pH为7.0，用三角瓶分装成斜面，在120℃的水蒸气条件下灭菌20min后备用。
2）底物的制备用0.5mL的无菌水振荡溶解冻干溶壁微球菌，并将菌体接种于培养基斜面中，于25℃培养 2 d，备用（如果需要，可再次接种扩培）。
用无菌水洗涤菌体，5000r/min 离心15min，收集沉淀菌体，反复洗涤至无蛋白(以考马斯亮蓝R250蛋白质显色法[9]检测)，冷冻干燥得干粉菌体。
用0.5g干粉菌体和适量的0.1mol/L、pH=6.2的磷酸缓冲溶液，于玛瑙研钵中研磨 5min后，稀释至 30~40mL 备用。
1.2.3 溶菌酶活力的测定1）酶液的制备：以0.1% 的氯化钠溶液作为激活剂，称5mg干粉溶菌酶与0.1mol/L、pH=6.2 的磷酸缓冲液溶配制成5.0×10-2mg/mL的溶菌酶溶液。
2）1个酶活力单位：在1min、pH= 6.2的条件下，使溶菌酶溶液OD450值降低1×10-3个单位定义为1个酶活力单位。
以标准溶菌酶的检测条件为固定的标准测定条件。
酶活力单位计算公式：在光密度OD450为 0.5~0.6 的范围内，酶活力单位(U/mg) = (OD t=0-OD t=60)/样品的质量(mg)×10003）酶活力的测定。
将底物液与溶菌酶溶液分别于常温水浴中保温10min，测量底物液的OD450值作为空白值，接着加入0.2mL溶菌酶溶液迅速摇匀，并开始记时，每隔1min 测1 次OD450值。
2 结果与讨论2.1 盐析时间对溶菌酶活性的影响由于溶菌酶处于盐析条件下，其活性随时间而减退，所以确定适当的盐析时间是十分重要的。
在盐析实验过程中，每隔20h取样一次，并测定鹌鹑蛋清的比酶活，结果见图1。
图1 盐析时间对溶菌酶收率的影响由图1知，在盐析20h时，酶活力测定最高为16100 U/mg，随着盐析时间的增加，酶活力逐步下降，在盐析120h时，酶活力为13700 U/mg，此后，酶活力迅速下降。
说明随盐析时间增加，酶活力逐渐下降。
2.2 pH 值对溶菌酶活性的影响每隔0.5个pH 值单位取一次溶菌酶溶液，并测定比酶活，结果见图2。
图2 pH 值对溶菌酶活性的影响由图2知，溶菌酶在pH=6.5时酶活力最高，为13700U/mg，升高或降低溶菌酶溶液的pH值，酶活力都将迅速下降。
2017年第5期·85·黄赞良等：溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨2.3 温度对溶菌酶活性的影响改变溶菌酶溶液的温度，每隔10℃ 取样一次，并测定其溶液的比酶活，结果见图3。
图3 温度对溶菌酶活性的影响由图3可见，在20~90℃的范围内，溶菌酶活性于50℃ 时最高，为13700 U/mg。
2.4 盐析时间对溶菌酶收率的影响在盐析过程中，每隔20h，测定一次溶菌酶的收率，结果见图4。
图4 盐析时间对溶菌酶收率的影响由图4 可见，溶菌酶的收率在0~120h的盐析时间内是逐渐增加的，且盐析达到120h时，酶的收率最高。
当盐析超过120h后，酶的收率则有些下降。
所以，鹌鹑蛋溶菌酶的盐析时间应不小于120h。
2.5 pH 值对溶菌酶收率的影响选用不同PH值条件下，提取分离溶菌酶，每隔0.5个pH 值单位，测定一次溶菌酶的收率，结果见图5。
图5 pH 值对溶菌酶收率的影响由图5可知，pH 值介于9.0~10.7范围内，溶菌酶的收率随pH的升高而逐步增大，当pH = 10.7 时，溶菌酶的收率达到最高。
当pH值超过10.7时，随着pH 值的增加，溶菌酶的收率又迅速降低，所以，溶菌酶的盐析pH 值应在10.7左右。
2.6 NaCl的质量分数对溶菌酶收率的影响选用不同NaCl的质量分数，盐析分离溶菌酶，每隔0.5个质量分数单位，测定一次溶菌酶的收率，结果见图6。
图6 NaCl的质量分数对溶菌酶收率的影响由图6可知，NaCl质量分数介于3.0%~5.1%范围内，随质量分数的升高溶菌酶的收率逐步提高，当NaCl质量分数达到5.1%时，溶菌酶的收率最高。
随着NaCl质量分数继续增大，溶菌酶的收率反而逐步下降，所以，溶菌酶的盐析NaCl质量分数应在5.1左右。
3 结论采用NaCl作为盐析剂，于等电点分离并结晶云南化工2017年第5期·86·溶菌酶。
得出提取分离鹌鹑蛋溶菌酶最佳条件：盐析用5.1% 的NaCl溶液的质量分数、10.7的pH、120h的盐析时间。
获得溶菌酶活力最高达13700 U/mg，溶菌酶的收率为0.378%。
溶菌酶在工农业生产中应用广泛，溶菌酶因来源不同，所得分子量、结构及性质等会有所不同，因而，应根据具体提取物质，来制定不同的分离工艺路线。
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