光化学衍生器-黄曲霉毒素检测-柱后衍生15版药典专用

附录IⅩ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法（附录VI D）测定药材及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，■流速每分钟0.8ml■【删除】；采用柱后衍生法检测，（1）碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；■（2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；■【增订】以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm(或365nm)，发射波长λem =450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1. 0µg/ml、0.3µg/ml、1.0µg/ml、0.3µg/ml、）0.5ml，置10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11，000转/分），离心5分钟（离心速度2500转/分），精密量取上清液15ml，置50ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱■（AflaTest@P）■【删除】，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去,使空气进入柱子,将水挤出柱子,再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5µl、10µl、15µl、20µl、25µl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。

普瑞邦PriboFast® KRC 光化学柱后衍生反应器PriboFast®KRC光化学柱后衍生反应器广泛应用于液相色谱检测分析, 使用时置于色谱柱和检测器之间，进行柱后连续光化学衍生反应提高荧光、紫外、电化学检测和化学发光检测器的灵敏度和响应的选择性。

采取液相色谱-荧光法检测黄曲霉毒素时，使用光化学衍生器进行柱后衍生,不需要任何化学试剂, 能有效增强黄曲霉毒素B1和G1的荧光强度，黄曲霉毒素B1和G1灵敏度能够达到0.1ppb以上；1、运行环境：温度5℃～40℃；相对湿度≤85%；适用电压220V（±10%），50Hz(±2%)2、技术参数2.1与HPLC-荧光检测器配套使用在线对黄曲霉毒素B1、G1进行衍生，不需要任何化学试剂2.2黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限低于0.1ppb.2.3符合15版中国药典，AOAC 2005.08, AOCS Aa 11-05和欧盟药典 2.8.18标准分析方法。

3、配置要求3.1 KRC柱后衍生光化学反应池(还包括10米透明质化线圈，254 纳米灯管，抛光反应池架，电源控制器）1套3.2塑料漏斗(10 个/包)1包3.3玻璃微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）1盒3.4一次性测试管（250个/包）1包3.4 Peek 两通(客户自备)4、技术资料3.1提供仪器设备的中文安装操作说明书。

3.2提供仪器设备的英文说明书。

3.3 仪器设备须经中国政府批准在中国境内销售，适合中国国家标准，或通用国际标准。

3.4 仪器设备的保修期为一年。

在保修期内，供货厂商在接到用户要求对所购仪器设备进行维修时，应在24小时之内给予答复以及后续维修服务。

5、技术特点:1. 在线对黄曲霉毒素B1、G1进行衍生，重现性好；不需要任何化学衍生试剂，减少了液相系统的清洗工作，延长了其使用寿命。

2．黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限在0.1ppb以下。

光化学柱后衍生
光化学柱后衍生是一种分析化学方法，它结合了光化学反应和化学分离技术，可用于有机化合物的检测和分析。

该方法能够对样品中的化合物进行选择性检测和分离，而且具有高灵敏度和分辨率。

光化学柱后衍生的基本原理是，在紫外辐射下，荧光染料和有机化合物发生光化学反应，形成新的化合物。

通过进样和色谱技术，可将反应产物从样品中分离出来，经过检测器的检测后，就能够得到化合物的结构和含量信息。

光化学柱后衍生有许多优点，例如可检测多种化合物、低浓度下也能检测、具有高选择性和灵敏度等等。

另外，该方法可在短时间内完成分析，是一种比较快速的分析方法。

当然，光化学柱后衍生也存在一些问题。

例如，样品的情况会影响反应效果，因此对样品的处理是十分重要的，而且反应后的产物也需要注意保存，以免失去灵敏度。

总之，光化学柱后衍生是一种健康环保、快速分析并获取信息的方法，特别适用于有机化合物的检测和分析。

同时，也需要注意样品的处理和反应产物的保存等问题。

柱后衍生—HPLC测定与分析沉香中黄曲霉毒素目的：对沉香中黄曲霉毒素进行测定。

方法：采用柱后衍生-HPLC联用技术，测定沉香中黄曲霉毒素的含量，了解所获沉香中黄曲霉毒素污染情况。

结果：按照《中国药典》2015版的要求与指导原则，69批次沉香样品均未检出黄曲霉毒素。

结论：柱后衍生-HPLC联用技术测定沉香中黄曲霉毒素方法可行，我国沉香黄曲霉毒素未受到黄曲霉毒素污染。

标签：沉香；黄曲霉；柱后衍生-HPLC黄曲霉毒素是真菌毒素中毒性最强的一种真菌毒素，具有极强的毒性和致癌性。

在自然界中，无论是土壤、腐烂有机质物品与植物纤维、农产品或者其他食品上都有黄曲霉毒素存在。

黄曲霉最适宜生存在相对湿度85%左右的热带、亚热带地区并产生黄曲霉毒素。

我国地域十分辽阔以及气候的多样性和复杂性导致我国中药材和中药饮片在加工、贮藏、运输的过程中，很容易发生霉变而导致被黄曲霉毒素污染。

因此，检测中药材中黄曲霉毒素具有极其重要的意义[1-4]。

目前2015版《中国药典》仅仅对少数几种中药材规定有关黄曲霉毒素含量的限度标准，如陈皮，胖大海等。

沉香是我国的名贵中药材之一，2016年广东省通过立法保护广东八种道地中药材，沉香为其中之一。

由于沉香主产越南、海南和广东等热带和亚热带地区，该地区的环境条件极易被黄曲霉等真菌类污染而产生黄曲霉毒素。

因此，笔者拟采用柱后衍生与高效液相色谱联用技术[5-8]，通过对沉香进行黄曲霉毒素测定，建立沉香中黄曲霉毒素含量测定的方法，为监管部门提供技术支持。

1仪器与材料11仪器Waters 2695/2475高效液相色谱仪及柱后衍生系统；色谱柱：Shim-pack CLC-ODS C18（150mm×6mm，5μm）、phenomenex gemini C18（250mm×46mm，5μm）、Thermo ODS-2 HYERSIL（200mm×46mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×46mm，5μm）；离心机：Thermo Scientific Multifuge X1R 12材料黄曲霉素混合对照品（批号：46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2纯度分别为990%、990%、997%、995% ，Supelco Analitical）。

940 引言何首乌始载于《开宝本草》，为我国较为常用的中草药材之一，在全国各地均有分布，广东、湖南、河南和广西是其栽培品的主要几大产区。

何首乌中包含有二苯乙烯类、蒽醌类、黄酮类、磷酯类、酚类及鞣质类等131种化合物[1]。

最近的研究表明，二苯乙烯类化合物可以作为抗衰老和抗动脉粥样硬化因子，减少脑病理萎缩，促进学习和记忆[2]；含蒽醌的组分对心肌提供了剂量依赖性的保护缺血-再灌注损伤，并减少脑缺血引起的梗死体积[3]。

早在2010年，何首乌及其制作方法被中国药典收录，何首乌也被广泛用作补药和泻药，以治疗失忆症、高脂血症和便秘[4]。

何首乌经炮制后，极其容易发霉而变质，不仅其药效受到影响，发霉后会产生黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，均是致癌物质，严重影响身体健康。

世界卫生组织已将黄曲霉毒素（Aflatoxin）释质谱（HPLC-IDMS）[15]、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）[16]、高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HMRS）[17]和免疫亲和柱-高效液相色谱法（HPLC-IAC）等[18]。

使用酶联免疫吸附法和免疫亲和柱-荧光分光光度法对其进行检测时，样品中的某些结构类似物也会被抗体吸附而产生荧光，造成假阳性[19]。

Arroyo-Manzanares等[20]提出了一种HPLC-MS/MS方法测定黄曲霉毒素，以水/丙酮/乙腈（30：35：35，v/v/v）为萃取溶剂，萃取后测定干血斑或干血清斑中的黄曲霉毒素，取得了很好的结果，检测限为0.05至0.1 ng/mL。

免疫亲和色谱法（Immunoaffinity Chromatography，IAC）基于抗体-抗原的特异性吸附原理进行选择性分离，方法的准确性和灵敏度都很高[22]，是检测黄曲霉毒素的最佳方法之一。

发展何首乌中的致癌物质黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的高效、准确检测方法至关重要。

由于Afla Bl和Afla Gl荧光强度相对较弱，通常需96公司、吐温-20采购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（货号T0543）；超纯水（自制）。

样品萃取：o25 g 研磨后的均质样品o加入 100 mL 84/16 乙腈/水o震摇 1 小时或高速均质3 分钟o过滤标准曲线：o第二个标准品的配制: 取5 µL 黄曲霉毒素混标 (2 µg/mL黄曲霉毒素 B1&G1 和 0.5 µg/mL 黄曲霉毒素 B2&G2)至2mL HPLC进样管中,加入995µL 21/114乙腈/水，漩涡震荡30秒混匀（10 ppb黄曲霉毒素 B1&G1 和 2.5 ppb 黄曲霉毒素 B2&G2于21/114乙腈/水中），密封。

o各个标准品的配制：o分别取10µL,20µL,50µL,100µL,200µL,500µL第二个标准品至2mL HPLC进样管中，再加入 990µL, 980µL, 950µL, 900µL, 800µL 和500µL 21/114乙腈/水，旋涡震荡30秒混匀，密封。

表1 标准曲线中各浓度标准品配制一览表（ppb）单点校正 & 加标：o标准品: (1ppb B1, G1) (0.25ppb B2, G2)加入 50 µL 黄曲霉毒素混标 (10 ppb 黄曲霉毒素 B1&G1 和 2.5 ppb 黄曲霉毒素B2&G2 于21/114 乙腈/水中)至进样管中. 加入450 µL 21/114 乙腈/水至进样管中，旋涡震荡，密封。

o加标: (16 ppb B1, G1) (4ppb B2, G2) 相当于固体加标(16 ppb B1, G1) (4ppb B2, G2，而HPLC应读到的数据是(0.74 ppb B1, G1) (0.185ppb B2, G2)加标10 µL 黄曲霉毒素标准品 (2 µg/mL B1, G1 & 0.5 µg/mL B2, G2)至 5mL 样品萃取液中.净化：样品 基质加标a. 混匀 &液体穿过MycoSep ® 226柱约 1 mL.b. 转移 100 µL 净化后的萃取液于 HPLC 自动进样管中.c. 加入 440 µL 蒸馏水于HPLC 自动进样管中.d. 旋涡 30秒后，样品待检.色谱条件：色谱仪: 高效液相色谱仪HewLett Packard 1100 系列 双元泵 G1312A.多波长检测器 G1314A. 程序性荧光检测器1046A.色谱柱： Zorbax SB Aq (150 x 4.6 mm; 5 µm) 流动相: 5/1/1 水/乙腈/甲醇. 加入100 µL 硝酸和0.3 g 溴化钾溶于1L 流动相中用于柱后衍生。

2015年药典黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法测定药材及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，流速0.8mL/min；采用柱后衍生法检测:光化学衍生法：光化学衍生器（254nm. PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器）；以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm(或365nm)，发射波长λem =450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.0μg/m L、0.3μg/m L、1.0μg/m L、0.3μg/m L、）0.5mL，置10mL于量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

(Pribolab STD#1082-2 AFT混合标准品：AFT B1和AFT G1：1.0μg/mL，AFT B2和AFT G2：0.3μg/mL ）供试品溶液的制备：1. 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11,000r/min,®他物质萃取时间要求不一的需求，通过特殊结构设计实现在短时间内对真菌毒素等物质的高效粉碎、萃取，保证检测结果的准确性和精确度。

粉碎样品在不锈钢杯中通过电机旋转驱动刀同时进行劈裂、碾碎、掺合等过程。

使物料搅拌粉碎,转速高达22000以上,全金属机身和不锈钢杯子,抗有机溶剂的腐蚀,可以实现在2-3分钟高效实现真菌毒素的均质、萃取等关键环节。

优点：高速震荡3分钟即可完成整个真菌毒素及其他物质的萃取过程；●转速两档可调，低速12000r/min，高速22000r/min；●全金属机身，不锈钢材质，抗有机溶剂腐蚀；●可广泛应用于食品检验、科学研究、医学治疗、化工制药等行业；●本机构造方面均合于无菌操作的要求；●通过CE认证。

2021年2月第 42 卷第 3 期检测分析食品研究与开发151 ----DOI : 10.12161/j.issn.1005-6521.2021.03.025原位光化学衍生快速检测黄曲霉毒素荧光强度何丽媛,倪树标,刘科勇,原彩华,张冠文/广东省科学院广东省分析测试研究所(中国广州分析测试中心)，广东省食品营养与安全快速检测仪器工程技术研究中心，广东广州510070)摘 要:通过优化有机溶剂种类和光化学衍生时间，建立采用光化学衍生进行前处理，并利用黄曲霉毒素原位衍生荧 光检测仪快速检测黄曲霉毒素荧光强度的方法。

结果表明，在光化学衍生时间为4min 时,70%甲醇溶剂中黄曲霉毒素B i 和G i 的光化学衍生荧光增强效果最显著，优于甲醇和乙腈；黄曲霉毒素B 2和G 2荧光强度最大且稳定，光化学衍生后无明显增强。

该方法在0.1 ng/mL 〜20.0 ng/mL 线性关系良好,R 2>0.998 4,方法检测限在0.15 ng/mL 〜0.37 ng/mL 之间，检测时间短，操作简单方便，满足食品和中药材中黄曲霉毒素的快速检测要求。

关键词：黄曲霉毒素;原位光化学衍生；荧光强度;快速检测；食品和中药材Rapid Detection of Aflatoxin Fluorescence Intensity by Insitu Photochemical DerivatizationHE Li-yuan , NI Shu-biao , LIU Ke-yong , YUAN Cai-hua , ZHANG Guan-wen/ Guangdong Institute of Analysi s / China National Analytical Center , Guangzhou), Guangdong ProvincialEngineering Research Center of Rapid Testing Instrument for Food Nutrition and Safety , GuangdongAcademy of Sciences , Guangzhou 510070, Guangdong , China /Abstract : Through the optimization of organic solvent type and photochemical derivatization time ，a method for rapid detection of aflatoxin fluorescence intensity was established by using photochemical derivatization pretreatment and aflatoxin insitu derivatization fluorescence detector. The results showed that the fluorescenceenhancement effect of aflatoxin B 1 and G 1 in 70% methanol solvent was the most significant when the time of photochemical derivatization was 4 min ，which was better than that of methanol and acetonitrile. At the sametime ，the fluorescence intensity of aflatoxin B and G 2 in 70% methanol solvent was the highest and stable ，but there was no obvious enhancement after photochemical derivatization. The method had a good linear range when the concentration of aflatoxin was between 0.1 ng/mL-20.0 ng/mL ， R 2>0.998 4，the limit of detection wasbetween 0.15 ng/mL and 0.37 ng/mL,with short detection time ，simple and convenient operation ，and it could meet the requirements of rapid detection of aflatoxin in food and Chinese medicine materials.Key words : aflatoxin ； insitu photochemical derivatization ； fluorescence intensity ； rapid detection ； food and Chinese medicinal materials引 文格式：何丽媛，倪树标，刘科勇，等.原位光化学衍生快速检测黄曲霉毒素荧光强度[J].食品研究与开发,2021, 42(3):151-157.HE Liyuan , NI Shubiao , LIU Keyong , et al. Rapid Detection of Aflatoxin Fluorescence Intensity by Insitu PhotochemicalDerivatization[J]. Food Research and Development ,2021,42(3)： 151-157.基金项目：广东省科学院发展专项(2019GDASYL-0105024)作者简介:何丽媛(1984—),女(汉)，助理研究员，硕士，研究方向:食品安全快速检测仪器及试剂。

2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。

当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测， （1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g， 加入甲醇 100ml 使溶解， 用水稀释至 1000ml 制成)， 衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃； （2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm） ；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。

混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

柱后光化学衍生高效液相色谱法测定调味品中黄曲霉毒素王韦岗;唐双双;陆源;朱新生【摘要】建立了柱后光化学衍生高效液相色谱法同时测定调味品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的方法.对四种调味品进行加标回收和精密度实验,黄曲霉毒素的回收率均在85％以上,相对标准偏差(RSD)为1.27％～4.82％.实验结果表明,该方法操作简单,检测速度快,重现性好,可以满足调味品中黄曲霉毒素检测的要求.【期刊名称】《江苏调味副食品》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】4页(P34-37)【关键词】固相萃取;多功能净化柱;光化学衍生;黄曲霉毒素;调味品【作者】王韦岗;唐双双;陆源;朱新生【作者单位】镇江市产品质量监督检验所,江苏镇江 212001;镇江市产品质量监督检验所,江苏镇江 212001;镇江市产品质量监督检验所,江苏镇江 212001;镇江市产品质量监督检验所,江苏镇江 212001【正文语种】中文【中图分类】TS207.4黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是一种常见的腐生真菌，多见于发霉的粮食、粮食制品及其他霉腐的有机物中，主要存在形式为B1、B2、G1、G2、M1和 M2。

1993 年，黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为一级致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质［1］。

研究表明，长期食用被黄曲霉毒素污染的食物将导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病。

为了防止黄曲霉毒素危害人类健康，世界各国对黄曲霉毒素在食品中的残留限量都作了严格的规定［2］。

食醋、酱油、料酒等调味品是以大米、小麦、高粱和黄豆等粮食为主要原料发酵配制而成的，在原料储存、发酵和产品生产过程中容易受到黄曲霉毒素的污染，从而危害人体健康。

建立调味品中黄曲霉毒素快速有效的检测方法是保障食品安全的重要手段之一。

目前，常用固相萃取柱［3，4］、免疫亲和柱［5，6］和多功能净化柱［7，8］等对食品样品中的黄曲霉毒素进行提取和净化，但由于食醋、酱油等调味品基质复杂，所以单一的净化方法并不能满足检测要求。