当前位置：文档之家 › SDS-PAGE凝胶电泳操作

SDS-PAGE凝胶电泳操作

  • 格式：docx
  • 大小：15.89 KB
  • 文档页数：4

SDS-PAGE凝胶电泳操作

一、常规试剂的配制

1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；

2. 1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；

5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；

6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS（1g/L），pH 8.30；

7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；

8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；

9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；

10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。

二、样品的处理

1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品

（1）粉剂（或颗粒）样品

称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。

（2）液体样品

液体样品经离心后，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。

2. 蛋白含量相对较高的酶制剂或原料样品

（1）粉剂（或颗粒）样品 称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液用于电泳实验。

（2）液体样品

液体样品经离心后，取离心上清液用于电泳实验。

3. 未知样品

对未知样品进行归类（是否为酶制剂，是哪一类酶），根据已知电泳图谱确定该类物质能跑出清晰电泳条带的蛋白浓度范围，在对未知样品进行电泳实验前，测定其蛋白含量，根据其结果进行适当处理。

三、凝胶的配制

1. 设备检漏

将电泳玻璃板按顺序装好并固定，在电泳玻璃板间注满蒸馏水，静置15-20min，观察是否有水浸出，若无则进行下一步操作，反之，则拆除进行重新安装，并重复检漏至无液体浸出。

注：如样品数量不多，一块凝胶板就已足够，则另一边使用凝胶隔板，防止跑胶时短路。

2. 分离胶的制备

根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围如下表

蛋白质分子量范围（KD） 适宜的凝胶浓度（%）

>100 8

30-100 10

10-30 12

<10 15

将检漏的蒸馏水倒出，按下表进行SDS-PAGE分离胶的配制（使用凝胶试剂盒）

电泳凝胶浓度

试剂 8% 10% 12% 15%

H2O（ml） 4.63 4.0 3.3 2.3

30%Acr-Bis（29:1）（ml） 2.67 3.3 4.0 5.0

1.5mol/L Tris.cl（pH 8.8）（ml） 2.5 2.5 2.5 2.5

10%SDS（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1

10%AP（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1

TEMED（μl） 4 4 4 4

总体积（ml） 10

注：如室温高于30℃，可适量减少TEMED30-50%，防止胶过快凝结；

如室温低于20℃，可适量增加TEMED30-50%，防止胶过慢凝结。

常用分离胶的浓度为10%。按上表进行配制，所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，迅 速进行注胶，注胶过程要平稳，避免产生气泡，注胶完成后用蒸馏水进行水封（水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡，且防止氧化），凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。

3. 浓缩胶的制备

分离胶制备完成后，静置60-90min，确保分离胶凝结完全后，倒出水封液体并用滤纸把剩余的水分吸干，按下表进行SDS-PAGE浓缩胶的配制。

试剂 浓度（5%）

H2O（ml） 4 2

30%Acr-Bis（29:1）（ml） 1 0.5

1.0mol/L Tris.cl（pH 8.8）（ml） 1 0.5

10%SDS（μl） 80 40

10%AP（μl） 60 30

TEMED（μl） 8 4

总体积（ml） 6 3

所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳（样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平），静置40-60min。

4. 制样

吸取经预处理后样品25μl与25μl上样缓冲液混合均匀后，于沸水煮3-5min去掉亚稳态聚合，冷却后4000rpm离心4min。

5. 上样

浓缩胶凝结后，向上槽内倒入适量电泳缓冲液，拔出样梳（要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果），向每孔内加样10μl（加样时移液枪要始终竖直，且加样迅速，为避免边缘效应，最好选取中部孔注样）。

6. 跑胶

加样完成后，在电泳槽内加入适量电泳缓冲液，连接好冷凝水，接通电源，进行电泳，稳压90V，电泳90min左右，进入分离胶后，电压改为120V，待溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

7. 凝胶板剥离与固定

电泳结束后，取开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内（剥胶时要小心，将凝胶保持完好），用蒸馏水小心清洗1-3次，加入固定液进行固定40-60min，倒出固定液，蒸馏水清洗3-5次。

8. 染色

固定清洗结束后，倒入染色液，染色40-60min。 9. 脱色

染色结束后，蒸馏水清洗3-5次，倒入脱色液进行脱色，30-60min后更换1次脱色液后，脱色至蛋白条带清晰即可。

10.清洗

电泳结束后，将电泳玻璃版及烧杯仔细清洗，并用蒸馏水进行漂洗后，将电泳所用物品归置原位。

合集下载

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

实验原理：

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液

6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

CHANG X C

[实验目的]

（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

[实验原理]

电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

电泳过程必须在一种支持介质中进行。最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。

SDS-PAGE凝胶电泳操作

SDS-PAGE凝胶电泳操作

精品文档

。 1欢迎下载 SDS-PAGE凝胶电泳操作

一、常规试剂的配制

1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；

2. 1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；

5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；

6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS（1g/L），pH 8.30；

7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；

8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；

9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；

10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。

二、样品的处理

1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品

（1）粉剂（或颗粒）样品

称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。

sds page凝胶电泳步骤

sds page凝胶电泳步骤

sds page凝胶电泳步骤

以SDS-PAGE凝胶电泳步骤为标题的文章

SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测量方法，其步骤包括蛋白质样品的制备、样品加载、电泳运行、染色和图像分析等。本文将详细介绍SDS-PAGE凝胶电泳的步骤及相关注意事项。

一、蛋白质样品的制备

准备要分离的蛋白质样品，并将其加入样品缓冲液中，以使蛋白质溶解并保持其天然构象。样品缓冲液通常包含Tris-HCl缓冲液、甘油、SDS和β-巯基乙醇等成分，用于维持样品的pH值和还原环境，使蛋白质完全展开。

二、样品加载

将制备好的蛋白质样品加载到凝胶孔中。通常使用微量吸管或微量注射器将样品缓冲液缓慢地注入凝胶孔中，确保样品完全进入凝胶中。

三、电泳运行

将已加载样品的凝胶板放置在电泳槽中，确保凝胶完全浸泡在电泳缓冲液中。然后将电泳槽连接到电源，并设置合适的电压和电流参数。根据需要，可以选择常规电泳或快速电泳。

在电泳过程中，蛋白质样品会在凝胶中被电场推动，根据其分子大小和电荷不同，被分离成不同的带状条带。较小的蛋白质分子迁移速度较快，而较大的蛋白质分子迁移速度较慢。

四、染色

电泳结束后，需要对凝胶进行染色以可视化蛋白质带状条带。常用的染色方法有银染色和Coomassie蓝染色。银染色对蛋白质敏感性高，但操作繁琐；而Coomassie蓝染色操作简单，但对蛋白质敏感性相对较低。

五、图像分析

通过使用分析软件或图像扫描仪，将染色后的凝胶图像数字化，并进行分析。可以测量蛋白质带状条带的相对迁移距离和相对强度，进而确定蛋白质的分子大小和相对丰度。

在进行SDS-PAGE凝胶电泳实验时，还需要注意以下事项：

1. 准备工作

确保操作台和仪器干净，并准备好所需的试剂和设备。避免在实验过程中发生交叉污染。

2. 样品加载

在加载样品时，应避免空气泡和溢出。确保样品均匀地加载到凝胶孔中，以获得清晰的带状条带。

3. 电泳运行条件