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SDS凝胶电泳操作手册

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各项检验操作注意事项

一. SDS-PAGE操作及注意事项

1. 制胶

按如下配方制备分离胶和浓缩胶

4%浓缩胶（3ml） 10%分离胶（4ml）

AB-3 0.25mL

AB-6 0.8mL

3×gel buffer 0.75mL 1.335mL

50%甘油(v/v) 0.64mL

H2O 2mL 1.235mL

10%APS(w/v) 22.5uL 20uL

TEMED 2.25Ul 2uL

注意事项：

（1） 配制前先将两块玻璃板夹紧，可以先试漏。首先配置分离胶，用水封，静置40min后，将水吸干，再注入浓缩胶，插上梳子，注意要避免梳孔出现气泡。

（2）在加入APS（10%过硫酸铵）和TENED后要尽快将胶注入，防止其凝固后无法注入玻璃板内。

2. 电泳

注意事项：

（1）制样：取40uL待测样，加入10uL5×SDS PEGE loading buffer，混匀后煮沸10min（电磁炉1000W），制好的样放至室温后，放4℃保存，待电泳。

（2）电泳：在电泳槽底部加入阳极缓冲液，将制好的胶连同装置放入电泳槽中，在两块胶之间注入阴极缓冲液。取2uL Marker注入胶孔中作为参照，再一次取5uL样品缓慢注入胶孔中，调整电压800-100V。待溴酚蓝从浓缩胶进入分离胶后，电压加至120-155V。继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源。小心撬开玻璃板，除去浓缩胶，取出分离胶，加入R250考马斯亮蓝染色40min，再用脱色液脱色。

3. 溶液的配制：

（1）正极缓冲液Anode buffer(1×)：12.114gTris加少量ddH2O溶解后，用HCL调PH至8.9，最后用容量瓶定容至500mL，4℃保存。

（2）负极缓冲液 Cathode buffer (1×)：6.057gTris+8.96gTricine+0.5SDS加入少量ddH2O溶解后，定容至500mL，4℃保存。

（3）凝胶缓冲液Gel buffer (3×)：36.342gTris+0.3gSDS加ddH2O定容至100mL，HCL调PH=8.45，过滤4℃保存。

（4）AB-3：24g Acrylamide+0.75g Bis-acrylamide加ddH2O溶解定容至50mL，过滤4℃保存。

（5）AB-6：23.25gAcrylamide+1.5g Bis-acrylamide加ddH2O溶解定容至50mL，过滤4℃保存。

（6）5×SDS PAGE Loading buffer：分别取1.25mL1M Tris-HCL(PH6.8)，0.5Gsds,25mg溴酚蓝及2.5mL甘油，加纯水至5mL。注：Loading使用前加入巯基乙醇，1mL溶液加100uL巯基乙醇，室温下保存。

（7）脱色液： 水：甲醇：冰醋酸=5:4:1

（8）APS：10%过硫酸铵

（9）R250考马斯亮蓝：500ml甲醇+400ml纯水+100ml冰醋酸，加入2.5g考马斯亮蓝

二. BCA法蛋白质浓度测定

操作步骤：

将标准蛋白（1mg/mL）稀释成500ug/mL。在酶标板上取8孔，按如下加入溶液。将待测样品稀释到适合的浓度，加20uL在酶标空中，设重复。再每孔加入200uL AB工作液A:B=50:1。混匀后37℃保温30min。冷却至室温，在酶标仪上测各孔的A562值。使用excel绘制标准曲线，计算出待测样品浓度。

uL 1 2 3 4 5 6 7 8

标准蛋白浓度（ug/mL） 500 400 300 200 100 50 25 0

BSA（500ug/mL） 20 16 12 8 4 2 1 0

PBS 1× 0 4 8 12 16 18 19

20

三．Bradford法蛋白浓度测定

操作步骤：

在酶标板上取8孔，按如下加入溶液。将待测样品稀释到适合的浓度，加20uL在酶标空中，设重复。再每孔加入200uLBradford溶液，混匀后室温放置10min。在酶标仪上测各孔的A595值。使用excel绘制标准曲线，计算出待测样品浓度。

uL 1 2 3 4 5 6

标准蛋白浓度（ug/mL） 0 100 150 200 250 300

BSA（500ug/mL） 0 2 3 4 5 6

H2O 20 18 17 16 15 14

三. ELISA法测定EGF浓度

操作步骤：

1. 待测样品的稀释

取10ul待测样品至1mlPBS（1×）中混匀，取10ul以上溶液至1mlPBS(1×)中混匀，再取10ul以上溶液至100ul PBS(1×)中混匀，及为稀释1×105倍。

2. 取出ELISA酶标板

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

实验原理：

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液

6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

SDS-PAGE电泳标准操作规程（SOP）rosoftOfficeWord文档

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SDS-PAGE电泳标准操作规程

(SOP)

一．仪器装置

1．电泳仪

2．夹心式垂直电泳槽

3．玻璃板：长14.5×11.5×2mm、短14.0×11.5×2mm

4．可调微量移液器

5．微量进样器

6．转移脱色摇床

二．试剂配制

1．丙烯酰胺液（30%T/2.7%C）

用天平分别称取58.4g丙烯酰胺（Acr）和1.6g N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis），溶于120ml温热（37℃左右，以利于溶解Bis）的去离子水中，然后转移至200ml容量瓶中，补加去离子水至刻度，摇匀，用滤纸过滤后，检查其pH值应不大于7.0，贮存在棕色瓶中，4℃保存。每隔2个月重新配制。

小心：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套。如不慎接触皮肤，应立即用水和肥皂清洗。

2．分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.8）

用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至8.8~8.9（先加5ml浓HCl，再逐滴加1M

HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。

3．浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH6.8）

用天平称取12.1g Tris，溶于160ml去离子水中，用HCl调pH值至6.7~6.8（先加8ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。

4．10% 十二烷基硫酸钠溶液 用天平称取20.0g 电泳级十二烷基硫酸钠（SDS），加180ml去离子水，68℃水浴使溶解后，用去离子水定容至200ml，室温保存。

5．10% 过硫酸铵溶液

用天平称取0.50g过硫酸铵（APS），溶于5ml去离子水中，分装Eppendof管冰冻保存。

6．四甲基乙二胺（TEMED）液

7．分离胶覆盖液（（0.375M Tris-HCl，pH8.8，0.1% SDS）

SDS-PAGE电泳相关溶液的配置

SDS-PAGE电泳相关溶液的配置

电泳相关溶液的配置：

1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）：称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，过滤，4摄氏度保存一个月。

2、 5×SDS电极缓冲液：称取Tris base15.1g，甘氨酸94.g，SDS 5.g加dH2O定容至1000ml。

3、2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTris·Cl（pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。

4、染色液的配制（1000ml）:

用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml锥形瓶中，用蒸馏水加以补足至1000ml。加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。

5、脱色液（1000ml）:

用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中，待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用。

收集液的SDS-PAGE分析：

1、取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。

分离胶配方

Resolving Gel (10ml) 6% 8% 10% 12% 15%

H2O 5.4 4.7 4.1 3.4 2.4

30% acrylamide mix 2.0 2.7 3.3 4 5

4x resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

20% SDS 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

20% APS 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004

SDS-PAGE凝胶电泳操作

SDS-PAGE凝胶电泳操作

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一、常规试剂的配制

1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；

2. 1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；

5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；

6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS（1g/L），pH 8.30；

7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；

8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；

9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；

10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。

二、样品的处理

1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品

（1）粉剂（或颗粒）样品

称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。