生化分离技术实践教学大纲

《生化分离技术》实验教学大纲

一、实验教学内容与大体要求

实验一 用溶剂萃取法提取与精制红霉素

（一）目的要求

1．把握溶剂萃取法提取微生物药物的原理和方式。

2．把握溶剂萃取法提取微生物药物的步骤和操作要求。

（二）实验内容

红霉素可在碱性条件下溶于乙酸乙酯有机溶剂中，在酸性条件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成钾盐沉淀析出。

（三） 所需实验设施设备

1．材料 2g红霉素软膏。

2．器材 量杯、烧杯、布氏漏斗及配套抽滤瓶、培育皿、分液漏斗、铁架及铁圈、玻璃棒、镊子、剪子、不锈钢扁匙、PH试纸、滤纸及纺绸布、真空烘箱。

3．试剂

乙酸、乙酸乙酯（BA）、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液。

（四） 教学形式及进程

1.讲解实验进程及注意事项，20分钟。

人一组，分组实验。

实验二 等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白

（一）目的要求

1．学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方式。

2．把握等电点沉析分离的大体操作技术。

（二）实验内容

蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷数量相等而呈电中性，现在溶液的pH值称为该物质的等电点。生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一样疏水性较强的蛋白质可用此法分离。

（三） 所需实验设施设备

1．材料 鲜牛奶。

2．试剂

醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、L pH 醋酸-醋酸钠缓冲液。

3．器具

烧杯（100 mL、）、玻璃棒、滴管、量筒、离心机、水浴锅、布氏漏斗、周密pH试纸或酸度计、表面皿、电子天平、抽滤瓶。 （四） 教学形式及进程

1.讲解实验进程及注意事项，30分钟。

人一组，分组实验。

实验三 离子互换法分离氨基酸

（一）目的要求

学习用阳离子互换树脂柱分离氨基酸的操作方式和原理。

（二）实验内容

本实验采纳磺酸型阳离子互换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=，分子量为）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=，分子量为）的混合液。在pH=条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH=12条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被互换下来。如此，通过改变洗脱液的pH值可使它们被别离洗脱而达到分离的目的。

（三） 所需实验设施设备

1．材料 磺酸型阳离子互换树脂（732型）

2．试剂

树脂处置液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、L柠檬酸缓冲液（pH=）、LNaOH缓冲液（pH=12）、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。

3．器具

离子互换色谱柱、量筒、吸管、搜集器、试管、恒流泵。

（四） 教学形式及进程

1.讲解实验进程及注意事项，20分钟。

人一组，分组实验。

实验四 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

（一）目的要求

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和大体操作技术。

（二）实验内容

蛋白质是两性电解质，在必然的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

（三） 所需实验设施设备

1．材料 标准蛋白混合液 内含：磷酸化酶(Mw94，000)，牛血清蛋白(Mw67，000)，肌动蛋白(Mw43，000)，磷酸酐酶(Mw30，000)和溶菌酶(Mw14，000)

2．试剂

30％凝胶贮备液、分离胶缓冲液／L)、浓缩胶缓冲液、电极缓冲液、10％SDS、10％过硫酸铵(新鲜配制)、1％TEMED、上样缓冲液、％考马斯亮蓝R-250染色液、脱色液、未知分子量的蛋白质样品

3．实验器材

DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)、电泳仪、长滴管及微量加样器、烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、250m1)、培育皿(15cml5cm)、注射器等。 （四） 教学形式及进程

1.讲解实验进程及注意事项，20分钟。

人一组，分组实验。

实验五 乙醇沉析法提取柑桔皮中的果胶

（一）目的要求

1．乙醇沉析法提取柑桔皮中的果胶的大体原理。

2．把握有机溶剂沉析法的大体操作技术。

（二）实验内容

柑桔皮中果胶含量很高，大部份以果胶质形式存在，果胶质不溶于水，但用稀酸可将其水解为可溶性果胶，利用多糖类物质在乙醇中的溶解度的不同，加入必然量乙醇使其沉析，就可使果胶从溶液中析出，经分离、干燥即得果胶纯品。

（三） 所需实验设施设备

1．材料 新鲜柑桔皮50g

2．试剂

正磷酸、／L盐酸、焦磷酸钠（又称磷酸四钠）、80％乙醇、95％乙醇、硅藻土粉末。

3．器具

组织捣碎机、大烧杯（≥500mL）、磁力搅拌器、恒温水浴锅、搪瓷桶、酸度计、不锈钢锅、板框压滤机。

（四） 教学形式及进程

1.讲解实验进程及注意事项，20分钟。

人一组，分组实验。

实验六 海带中甘露醇的制备及鉴定

（一）目的要求

1．了解甘露醇的理化性质；

2．把握从海带中分离提纯甘露醇的原理和大体操作技术。

（二）实验内容

以海带为原料，用自来水浸泡提取甘露醇；通过调剂酸度，沉淀除杂质；煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇；最后通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。

（三） 所需实验设施设备

1．材料 海藻或海带、粉末活性炭

2．试剂

30％NaOH、硫酸-水混合液(1：1)、95％乙醇、1mol／L三氯化铁溶液、1mol／LNaOH溶液

3．器具

电瓷炉、不锈钢锅、布式漏斗、抽滤瓶、回流装置、pH试纸

（四） 教学形式及进程

1.讲解实验进程及注意事项，20分钟。

人一组，分组实验。 二、实验课程学时分派表

序号 实验项目名称 实验

学时 每组

人数 实验

属性 实验

类别 实验

要求 内容提要

1 用溶剂萃取法提取与精制红霉素 4 4 专业基础类 操作性 必做 红霉素可在碱性条件下溶于乙酸乙酯有机溶剂中，在酸性条件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成钾盐沉淀析出。

2 等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白 4 4 专业基础类 操作性 必做 牛乳中的酪蛋白是两性电解质，当其溶液在某一pH值，即等电点时，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。

3 离子交换法分离氨基酸 4 4 专业基础类 验证性 必做 氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，各种氨基酸分子结构不同，在同一pH值时所带电荷的性质（正、负）和多少不同，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的效果。

4 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 4 4 专业类 验证性 必做 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

5 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶 4 4 专业类 综合性 必做 柑橘皮中果胶含量很高，大部分以果胶质形式存在，果胶质不溶于水，但用稀酸可将其水解为可溶性果胶，利用多糖类物质在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果胶从溶液中析出，经分离、干燥即得果胶纯品。

6 海带中甘露醇的制备及鉴定 4 4 专业类 综合性 必做 以海带为原料，用自来水浸泡提取甘露醇；通过调节酸度，沉淀除杂质；煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇；最后通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。 三、与其它相关课程的联系与分工

本课程实验与有机化学、生物化学等基础课实验具有必然的联系，为专业基础课或专业类实验，让学生具有生产各类生化产品的大体理论和技术，适应不同类型生化工厂及尔后从事科学研究工作的需要。

四、考核方式

本门课程各实验必需完成实验报告，要求实验报告格式标准、列出当次实验的目的、要求、实验内容和自己的完成情形。实验课成绩占课程总成绩的比例为30%。

五、实验指导书、参考书

⑴. 生物分离工程实验.北京. 高等教育出版社.2007年。

⑵张龙翔. .北京. 高等教育出版社.2006年。

《生化分离技术》实验指导书

实验一 用溶剂萃取法提取与精制红霉素实验

实验项目名称：用溶剂萃取法提取与精制红霉素

实验项目性质：专业基础类

所属课程名称： 生物技术原理

实验打算学时： 4

一、实验的目的

通过本实验的学习，使学生了解溶剂萃取法提取微生物药物的原理和方式，把握溶剂萃取法提取微生物药物的步骤和操作要求。

二、实验内容和要求

教师讲解实验进程及注意事项后，4人一组，进行操作实验。

三、本实验的大体原理和方式

红霉素属大环内酯类抗生素，可在碱性条件下溶于乙酸乙酯有机溶剂中，在酸性条件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成钾盐沉淀析出。

四、实验要紧仪器设备和材料

1．材料 2g红霉素软膏

2．器材 量杯、烧杯、布氏漏斗及配套抽滤瓶、培育皿、分液漏斗、铁架及铁圈、玻璃棒、镊子、剪子、不锈钢扁匙、PH试纸、滤纸及纺绸布、真空烘箱。

3．试剂

乙酸、乙酸乙酯（BA）、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液（配制方式：取醋酸钾10g溶于100mL于水乙醇中，配成饱和溶液，现用现配）

五、实验方式、步骤

（一）取2g红霉素软膏，放入烧杯中，加6ml乙酸丁酯，用乙酸或乙酸丁酯调pH值为 ～，抽滤，得澄清滤液，供下一步萃取用。

（二）澄清滤液放入搪瓷缸顶用乙酸酸化pH值为～，加乙酸丁酯分两次（每次加10～20ml）进行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸内上下翻动，使滤液和乙酸丁酯能充分混合接触，然后静置30 min使之分层，用100ml烧杯搜集上层萃取液。

（三）取上述下相液，加入必然体积的饱和食盐水，加入乙酸乙酯分两次萃取，充分混合接触，待静置分层后，将上层萃取液（BA液）倾倒出或吸出，转入另一只烧杯中。

（四）结晶与干燥：量取乙醇-醋酸钾溶液，缓慢加入上述BA液中，待有沉淀产生时，搅拌后静置30min后过滤，得红霉素晶体，将湿晶体放入烧杯中，加异丙醇30～50ml，搅拌成糨糊状，然后过滤抽提，将湿品平铺培育皿，可置真空干燥箱干燥得干品。

六、实验报告要求

认真书写实验报告，做好实验现象的描述、实验结果的分析，要求记录清楚，并对实验方案提出改良的意见等。

七、实验中的注意事项

1．通过调剂溶液的pH值使红霉素转入有机溶剂相或水相，应注意操纵溶液的pH值。

2．注意萃取时幸免乳化现象。