基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展刘琼^*2，陈宏亮2 ,姜延龙2 ,王春凤2收稿日期：2018—05—03基金项目：国家十三五重点研发计划项目(2017YFD0501000)； 国家自然科学基金项目(31602092，31272552，31272541 )；吉林省科技发展计划项目(20160519011JH,20170204034NY,20180201040NY)(吉林省教育厅科技研究项目(2016120)(吉林工程技术师范学院校级科 研项目(2016)作者简介:刘琼(1980 -)，女，实验师，博士，研究方向为动物微生态与黏膜免疫学，E-mail ： liuqiong@jlenu. edu. cn通讯作者：王春凤,E-mail ：wangchunfeng@ jlau. edu. cn[35] 李海燕，方肇勤，梁尚华.小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用[J ].中国中医基础医学杂 志，2000, 6(1) ：27—29.[36] 姚明，杨建平，王丽娜，等.腹水传代与体外培养Walker 256癌细胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性[J ].中华医学杂志，2008, 88(13) ：880-884.[37] 王红卫，卓忠雄，赵树文，等.大鼠Walker-256皮下移植瘤模型的建立及其超声评价* J ] •临床超声医学杂志，2007, 9(2) ：68—71.[38] Mandio R , Diinne A A , Eikelkamp N , et al. Expression of MMP 一3, MMP 一 13 , TIMP -2 and TIMP -3 in the VX2 carcinoma of the New Zealand white rabbit [ J +. Anticancer Research , 2002, 22(6A )：3 281.[39] Jiu AH , Xu H X , Liu W J , ei al Anti-tumor effect ot Rhapontic-um uniUorum in H22-bearing mica [ J +. chin J Exp Tradit MedForm (中国实验方剂学杂志),2011,17(5) ：165—167.[40] 赵方，胡明道，陈鹏.小鼠肝癌原位移植模型的建立及其研(1.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052 ； 2.吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心 教育部动物生产和产品质量安全重点实验室，吉林长春130118中图分类号：Q78文献标志码:A乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的兼性厌氧菌总称，包括乳球菌、乳杆菌、链球菌、片球菌和双歧杆菌等，美国食品和药品监督管理局 (FDA )将许多乳酸菌定义为“食品级”微生物，极少 数如化脓性链球菌，肺炎链球菌是致病菌。
乳酸菌 可以调节肠道菌群组成从而维持肠道稳态，提高免疫力;还可竞争型地占位，定殖在肠道表面诱导黏 膜液以及肠道上皮细胞抗菌肽(AMP )的产生[1](在治疗消化系统疾病(病毒性及细菌性腹泻)、炎症性肠病(IBD )和自身免疫性疾病中发挥了至关重要的作用。
工程化的乳酸杆菌以其可食性，遗传操作技术成熟简便，效率高，重复性好等特点非常适合作文章编号 $0529—6005(2019)06—0076—04为外源蛋白或药物的递呈工具。
因此，利用基因工程乳酸菌递呈抗原蛋白，无论在体外发酵还是在体内表达，都具有其他工程菌株无法比拟优势，使其成为新型活载体用于多种病原微生物抗原及生物活性分子的表达，成为防治人及动物疾病的理想选择。
1基因工程乳酸菌载体/受体系统1.1基因工程乳酸乳球菌表达系统 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis )是典型模式菌,常用于食品发酵，抗原性弱，自身分泌蛋白较少，基本不在胃肠道内定植，早在21世纪初期，科研人员便开展了对乳球菌载体疫苗的研究)质粒消除菌株Lactococcos lacOsIB1403、Lactococcus lactis MG136 是最常用的宿主菌，基因组序列已经测出。
随着具有广泛宿主范围的乳酸菌复制子发现，派生出低拷贝质粒pI052和 高拷贝质粒pI053,在此基础上利用乳酸菌内源组成型或诱导型启动子构建出表达载体/受体系统, 其中乳链球菌素表达系统(Nisin controlled expree-sion ，NICE )最常用，乳链球菌素NiUn 具有抗微生物究意义[J].现代肿瘤医学，2017, 25(18) ：2 883—2 885.[41 ] Rygaard J. Immunobiology of the mouse mutant &nude' [ J]. ActaPathologica Et Microbioloyica Scandinavica , 1969, 77(4) ：761.[42] Shimosato Y , Kameya T , Nagai K, et al Transplantation of hu man tumorr in nude mice[ J]. Journal ot the National Cancer In stitute, 1976, 56(6) ：1 251.[43]叶翩，张淑玲，揭盛华，等.人肝癌裸鼠移植模型的研究进 展[J].世界华人消化杂志，2006, 14(36)：3 500—3 503.[44]张丽娜，林美桂，刘桃丽，等.人肝癌细胞HepG2接种于BALB/C 裸小鼠移植瘤的性别差异* J].海南医学，2017, 28 (9) ：1 380T 382.[45]孙保国，张磊，项婷，等.健脾解毒方对脾虚肝癌大鼠TCRV 0CDR3基因谱系变化的影响[J].中国中西医结合杂志，2016, 36(6) ：735—743.[46]邵成伟，田建明，王培军，等.两种大鼠肝癌模型制作方法 的比较研究* J] •临床放射学杂志，2002, 21(12) ：985—987.活性，它的生物合成受到NisK和NisR双组分调节系统控制，环境中存在Nisin时,Nisk可以识别Nisin,使NisR磷酸化从而激活NisA启动子,转录下游基因。
近年来又出现的一些较为高效的诱导表达系统,如锌离子浓度调节的Ziree表达系统*2+、热应激蛋白基因groESL启动子所调控的压力诱导性表达系统（Stress inducible controlled expression,SICE）*。
1.2乳酸乳杆菌表达系统随着人们对乳杆菌的研究日益增多包括：鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌以及加氏乳杆菌等，乳杆菌属因为高基因多样性使表达载体的制备非常困难，只有在特定的菌株内才有适合的配套质粒复制系统。
最常用的植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，加氏乳杆菌的质粒复制子分别为pWV01、pSH71和pAMbeta-1。
乳杆菌质粒表达载体构成中既有组成型的启动子如磷酸甘油酸变位酶启动子Ppgm、乳酸脱氢酶启动子Pldhl和S层蛋白启动子PslpA,也有诱导型启动子。
随着国内外对乳酸杆菌基因组的研究，已经鉴定出多种环境诱导型启动子，并应用于报告基因的表达，常见的是肠球菌热休克蛋白启动子，它的活性在植物乳杆菌中已得到检验⑷，以嗜酸乳杆菌为宿主的糖诱导表达系统如:低聚果糖启动子P+os,乳糖P-c和海藻糖P er，还有pH值诱导表达系统、噬菌体诱导表达系统、温控诱导表达和清酒乳杆菌素诱导表达系统。
1.3外源蛋白的定位表达乳酸菌质粒表达载体可定向运输其表达的外源蛋白，根据蛋白与宿主菌的相对位置,将外源蛋白的表达情况分为胞内表达，胞外分泌表达及菌体表面锚定表达。
乳酸菌作为活载体的免疫效果受到外源蛋白表达位置、免疫途径、免疫程序、受体菌株种属及抗原的表达量影响,尤其是抗原的表达量直接影响免疫水平和免疫类型。
迄今为止，外源抗原蛋白在乳酸菌宿主细胞上的最有效定位还没有明确定论。
大量的外源蛋白表达在胞内会使细胞致死或是抗原集中降解，而且在细胞内表达的外源抗原不能充分地与黏膜免疫系统接触而影响免疫应答效果是目前科研工作者亟待解决的一个主要问题。
近期的研究结果证明，将外源蛋白锚定表达在宿主细胞表面是活载体疫苗向黏膜免疫系统提呈抗原的最有效方式，因此对乳酸菌锚定表达系统的深入研究对提高疫苗的效果具有重要的实践意义。
外源蛋白在菌体表面定位表达方面,本研究室的刘琼以pW425et为基础载体利用嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因构建了锚定表达系统pW425et-S*5+,蔡若鹏将来源于枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis）聚-$谷氨酸合成酶A#Poly-~y-Glutamsc Acid Synthetase A, pgs A）基因截短连接在诱导型表达载体pSIP409启动子之后，获得锚定表达载体pSIP409pgsAr该载体可将EGFP和IP-10锚定在植物乳杆菌表面*6在此研究基础上,2016年周芳玉*7+及2017年Jiang 等人分别以锚定表达载体pSIP409pgsA和pSIP409 pgsA'成功表达鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因和禽流感病毒H9N2亚型HA2蛋白，获得的工程菌口服免疫雏鸡具有中等的抗球虫效果，锚定表达含有HA2蛋白和佐剂分子LTB的植物乳杆菌可以显著地提高免疫小鼠的抗禽流感病毒能力*8]o1.4载体的无抗性选择标记区分细胞是否含有重组质粒要用选择标记进行筛选,行之有效且应用较多的是抗生素抗性标记，如红霉素、氯霉素等，但随着人们对食品安全的重视日益增强，抗性基因漂移将会给人类和环境带来严重的危害。
经过几十年的研究，科学家们研究发现一系列代替抗的筛选标记，主要包括糖类、细菌素、营养互补、金属离子选择标记等。
营养互补选择标记主要包括嘧啶和氨基酸营养互补选择标记。
王春凤利用胸腺嘧啶核苷酸合成酶（thyA）基因替代穿梭载体pW425e 中的红霉素抗性基因，得到了以thyA为选择压力的非抗性质粒载体pW425t,达到非抗性筛选阳性重组体目的*9+）2基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白防治疾病的应用2.1!抗病原微生物!大多数乳酸菌疫苗研究都集中在乳酸乳球菌，也有部分研究是关于植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌以及枯草芽抱杆菌。
其中，植物乳杆菌属的几种典型菌株，具有耐酸耐胆盐，在肠道内吸附和定殖的能力，同时竞争性地抑制病原微生物的定殖。
与乳球菌相比,植物乳杆菌存在的最大问题是蛋白表达的水平偏低，蛋白表达低就不能引起足够强度的免疫反应，不能提供对疾病的有效保护。
