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Hela细胞的传代培养及生长周期观察HE染色观察高学敏生36 2013012322一、实验背景（一）关于Hela细胞Hela细胞是源自美国妇女Henrietta Lacks的子宫颈癌细胞，取于1951年，属于增殖型表皮癌细胞。
在体外培养条件下，经过筛选，目前实验使用的Hela 细胞为无限细胞系，在适宜条件下可以无限分裂，不会衰退，可以连续传代。
经过六十多年，Hela细胞已经被培养出多个细胞系，它几乎成为细胞生物学中的一种“模式生物”。
似癌细胞的特征，其核型已非二倍体型，而是非整数倍体（aneuploid）。
2013年Andrew Adey等人在Nature发表的研究表明，Hela细胞的基因组相当稳定，可将不同细胞系区分开的点突变和基因拷贝数改变相当少1，这是Hela细胞的一大特点。
（二）原代培养、传代培养、衰退进行细胞体外培养前，最初需要从活体中获得细胞。
从体内获得细胞进行的首次培养为原代培养。
当原代培养细胞增殖达到一定密度后，需要做继代培养，被称为传代培养。
细胞在体外培养过程中的群体生存状况与在完整机体内的生存与衰老死亡基本一致；本次所做的Hela细胞实验为Hela细胞传代实验，即将已长到相当密度的原培养皿中的Hela细胞转移至新培养皿中培养。
在原代培养期，细胞增殖能力弱，第一次传代后，部分细胞可以重新贴壁，此时细胞增殖能力增强；另外亦是为了获得更多的细胞，因此进行传代操作。
培养的组织细胞在体外可以反复传代十几次左右，若传代十几次后细胞进入衰退阶段并死亡，则该细胞系称为有限细胞系；若在衰退阶段，部分细胞的遗传特性发生改变，可以无限传代，则该部分细胞将发展为无限细胞系。
Hela 细胞系即为无限细胞系，已历经六十多年的传代培养。
（三）贴附型细胞与悬浮型细胞在体外培养时，根据细胞能否贴附于支持物上分为贴附型细胞和悬浮型细胞两类。
大多数细胞系属于贴附型细胞，血液中的白细胞和某些癌细胞属于悬浮型细胞。
Hela细胞属于贴附型细胞，它需要贴附于支持物上才可能存活并增殖。
一、实验目的1. 掌握细胞传代培养的基本操作流程。
2. 熟悉细胞传代培养过程中的注意事项。
3. 了解细胞传代培养在生物科学研究中的应用。
二、实验原理细胞传代培养是指将已经生长到一定阶段的细胞，通过特定的方法进行分离、洗涤、消化、计数和稀释等步骤，将细胞转移到新的培养容器中继续培养的过程。
细胞传代培养是维持细胞生长、扩大细胞数量和保持细胞特性的重要手段。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞2. 培养基：DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清）3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、10%FBS、PBS缓冲液、酒精4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、移液枪、培养瓶/皿、吸管等四、实验步骤1. 准备阶段（1）将HeLa细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液轻轻洗涤一次，去除残留的培养基。
（2）准备胰蛋白酶工作液，将其置于37℃水浴中预热。
（3）准备含有10%FBS的培养基，将其置于37℃水浴中预热。
2. 分离细胞（1）用移液枪吸取适量胰蛋白酶工作液，滴加到细胞培养皿中的细胞层上。
（2）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中消化2-3分钟。
（3）倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含有10%FBS的培养基终止消化。
（4）用移液枪轻轻吹打细胞，使其成为细胞悬液。
3. 计数（1）取适量细胞悬液，使用细胞计数仪或显微镜配合琼脂滴定法计数。
（2）根据计数结果，调整细胞密度至所需的浓度，一般为每毫升105-106个细胞。
4. 传代（1）向含有预热的培养基的离心管中加入细胞悬液，并轻轻混匀。
（2）离心管离心，在1500 rpm速度下离心3-5分钟，以沉淀细胞。
（3）弃去上清液，保留沉淀的细胞。
（4）加入适量的新鲜培养基，将细胞重新悬浮。
（5）将细胞悬液转移到新的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
五、实验结果1. 成功完成细胞传代培养，观察到细胞在新的培养瓶中继续生长。
2. 细胞生长状态良好，细胞密度符合预期。
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
《HeLa细胞长期传代过程中基因组突变动态变化》篇一一、引言HeLa细胞，作为一种人类宫颈癌细胞系，因其易于培养、繁殖迅速和遗传稳定性等特点，在生物学、医学和遗传学等领域得到了广泛的应用。
然而，随着传代次数的增加，HeLa细胞的基因组会发生突变，这对其生物学特性和应用价值产生了深远的影响。
本文旨在探讨HeLa细胞在长期传代过程中基因组突变的动态变化。
二、材料与方法1. 细胞系与传代本实验采用HeLa细胞系，在标准实验室条件下进行长期传代。
每次传代均严格按照细胞培养的规范操作。
2. 基因组突变检测采用全基因组测序技术，对不同传代次数的HeLa细胞进行基因组突变检测。
3. 数据处理与分析将测序数据导入生物信息学软件，进行数据清洗、比对和突变分析。
三、结果1. 基因组突变类型与数量随着传代次数的增加，HeLa细胞的基因组突变类型和数量均有所增加。
其中，点突变、插入/删除突变和染色体结构变异是主要的突变类型。
2. 突变动态变化在长期传代过程中，HeLa细胞的基因组突变呈现出动态变化的特点。
早期传代时，突变数量较少，类型单一；随着传代次数的增加，突变数量逐渐增多，类型也变得更加复杂。
3. 关键基因突变部分关键基因在传代过程中发生了突变，如肿瘤相关基因、细胞周期调控基因和DNA修复基因等。
这些突变可能影响了HeLa细胞的生物学特性和行为。
四、讨论1. 基因组突变对HeLa细胞的影响基因组突变可能导致HeLa细胞的生物学特性发生改变，如增殖能力、侵袭性和耐药性等。
这些改变可能使HeLa细胞更适合在体外环境下生长和繁殖，从而提高了其在生物学、医学和遗传学等领域的应用价值。
2. 关键基因突变的意义关键基因的突变可能对HeLa细胞的生长、分化和功能产生重要影响。
例如，肿瘤相关基因的突变可能使HeLa细胞具有更强的增殖能力和侵袭性；细胞周期调控基因的突变可能导致细胞周期失控，从而加速细胞的增殖；DNA修复基因的突变可能影响细胞的DNA修复能力，进一步促进基因组的不稳定性。
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
海拉细胞培养流程目的及应用：用于细胞传代试剂及设备：培养基，0.25%胰酶，75%酒精，95%酒精，细胞培养箱，超净台，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤：一．实验前准备工作超净台的操作步骤：先开紫外线再开灯光最后开吹风进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。
二．准备实验先关闭紫外灯30min后再进行实验；75%酒精喷于纱布上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。
1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。
2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。
取下用后的移液管3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL DMEM培养液终止消化。
反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。
4．离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。
将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。
细胞学实验报告五Hela细胞的传代和HE染色生96 华以超2009030049同组姓名：赵宇实验日期：2010.11.11-13一、实验原理：苏木精(hematoxylin)：为从苏木中提取。
苏木精本身不是染料，不能直接染色，必须经氧化才能染色。
可以在空气中自然氧化，但需时很长，所以一般都是加氧化剂（如碘酸钠）氧化。
同时，被染材料又须经媒染剂作用后才有着色能力，所以在配制苏木精染液时，都加有媒染剂。
苏木精液主要着染细胞核。
有数种不同配方的苏木精液。
伊红(eosin)，又分几种，如伊红Y、伊红B等。
对细胞质、肌纤维、胶原纤维具有着色性。
一般用0.5%伊红/70%乙醇液或1%伊红水溶液。
由于苏木精着染细胞核，伊红着染细胞质，所以这种方法称为双重对比染色法。
二、实验步骤：1．传代培养（操作环境：超净台）⑴镜检，观察并记录细胞状态；⑵吸弃培养基，加入1mL PBS 溶液洗去残余培养基，重复进行一次（吸管口不可以接触培养瓶口，加液时不要直接冲击细胞层）；⑶向培养皿内滴加200uL 胰酶－EDTA 消化液，37ºC 消化约1-2 min；⑷观察细胞开始脱离器壁时，加入500uL 含10％血清的DMEM培养基终止消化，反复吹吸（吹吸时不要产生气泡），冲洗细胞层（洗到每个角落），以充分悬浮细胞；⑸分盘，并补充培养基至1.5ml，进行传代培养用于以后的实验。
缓慢、柔和的摇晃培养盘，使得每盘细胞分散尽可能均匀；37ºC、5％CO2培养；2．HE染色⑴镜检，观察并记录细胞状态，选取生长相对稀疏的一盘准备HE 染色；⑵吸弃旧的培养液，用PBS（1mL）漂洗2 次；⑶用Carnoy 固定液固定15min；⑷吸弃固定液，用蒸馏水漂洗一次；⑸加入苏木精染液（1mL，可重复使用）染色十数分钟（随时镜检，以确定染色时间）；⑹用流动的自来水洗去浮色；⑺加入0.5%的盐酸酒精溶液分色数秒（至细胞质近无色）；⑻再用流动的自来水水洗；⑼ 加入适量 0.5%的氨水返蓝处理（数十秒）（作用于苏木精染剂）；⑽ 用流动的自来水洗一次，观察细胞染色效果；如效果较好，以蒸馏水漂洗；⑾ 加入伊红溶液染色数秒后立即弃去；⑿ 用蒸馏水洗涤 1‐2 次；⒀ 观察（细胞核呈紫色、细胞质呈粉红色，层次感分明）并照相记录。
