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浅析细胞周期的常用测定方法

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ｌ 脉 冲标 记 Ｄ Ａ复 制 和 细 胞 分 裂 指 数 观 察 测 定 法 Ｎ
胞 ） 刚进入 ｓ期的细胞 （ 和 最慢 的被标 记细胞 ） 。最先 进入 Ｍ期 的标记细胞是 即将 结束 Ｓ 的细胞 ， 迟进 期 最 入 Ｍ期的标记细胞是 刚进 入 Ｓ期 的细 胞 ， 以从更 换 所
培养液到被标记 的 Ｍ 期细 胞开始 出现 为 Ｇ 期时 间 ，
从被标记的 Ｍ期 细胞 出现 到其 所 占 Ｍ 期细胞 总数 的 比例达到最大（ 最快 的被标 记 细胞 刚结束 Ｍ 期 ） Ｍ 为 期时 间， 从被标记的 Ｍ期细胞开始 出现到被标 记的 Ｍ 期细胞 占 Ｍ期 细胞总数的 比列开始减小 （ 慢的被标 最
记 细 胞 刚 进 入 Ｍ 期 ） Ｓ期 时 问 ， 为 最 早 进 入 Ｍ 期 为 因
钾溶液来检测 ） （） ３ 记录所 消耗 的高锰 酸钾 溶液 的滴 数 ， 比较它 们 所含维生素 ｃ的多少 。
压。用牙签蘸很少 一点食用 油点在 白纸上 ， 与压 过花
生的白纸比较 ， 观察现象。
４ ２ 分 组 自行 选 择 试 验 材 料 、 计 试 验 方 法 ， 试 探 ． 设 尝
一
“ 鉴定食物 中维生素 ｃ含量 ” 实验设计 、 记录表如
下：
实验材料 所 要高锰酸钾 实验结论 溶液 的滴数
１ ．
压。
选做 实验 １ 选做 实验 ２ 选 做 实验 ３
必 做 实 验
２． １ ．
选 做 实 验
２．
生物 学教学 ２１年（ ５ 第７ ００ 第３ 卷） 期
３ ： 电甜 ， ２ ｋ ｋ ０ ｋ
４ 鉴定 常见食物 中主要营养成分实验操作步骤 ４ １ 完成 教材 上安 排 的探 究食 物 中含 有蛋 白质 、 ． 糖
５ 鉴定食 物中维生素 Ｃ含量实验操作步骤
５１ （ ． 必做实验 ） 鉴定 比较两种不 同蔬菜 、 水果 汁中维
进入 Ｇ。 的这段 时间 ， ｂ—ｄ的时间 （ 即 最早 进入 Ｍ期
数（ 包括被标记 的和未被 标记 的） 比例 ， 因而待 测细胞 群体应是一个种类构成相 对简单 ， 细胞 周期相对较 短 ，
周期 运 转 较 为均 匀 的 细胞 群 体 。
・
５３ ・
来处于 Ｄ Ａ复制的最晚阶段的细胞 已经完成 Ｍ期 ， Ｎ 进
入 Ｇ 期。从原来 处于 Ｄ Ａ复制 的最早 阶段 的细胞 进 ， Ｎ 入Ｇ 期开始到原来处于 Ｄ Ａ复制 的最 晚阶段 的细胞 Ｎ
究不同种早餐食 物 中含 有 的主要 营养成分 。“ 定常 鉴
５２ （ ． 选做实验 ） 同一种蔬果汁模 仿烹饪 的过程进 对 行 不同处理 （ ： 如 煮沸 和微波 加热 等 ） 然 后 鉴定 比较 ， 新鲜的和处理过 的蔬果 汁 中维生 素 ｃ含量 的多少 ； 鉴 定 比较 自制 的果汁和市场上出售的同种果 汁 中维生素
（） ３ 拿一粒炒熟 的花生种子 ， 在 白纸上 ， 放 用力 挤
（） １ 取等量 的两种 不 同蔬 菜 、 水果 汁分 别放 入两 支试 管内。 （） ２ 将高锰酸钾 溶液逐滴滴入试 管 中， 动试管 ， 晃 观察 紫色是 否消失 ， 直至试 管 中的溶液颜 色变成 褐紫
色， 并较长时间不褪色。（ 预先配好 的同一瓶高锰酸 用
Ｔ Ｒ短暂标记后 ， Ｄ 凡是处 于细胞周 期 中 Ｓ期 的细 胞均 被标记 ， 包括 即将结束 ｓ期 的细胞 （ 快 的被标 记细 最
： ６ ‘ ‘ ‘ ： ＾ ＾ ● ｔ ＾●＝ ＝ ＾ ＝ ＝ ｑ＾‘ ０ ＾ ＾ ２ ： ＾ ＾ ： ０、 、
由于需要统计被标记的 Ｍ期细胞 占 Ｍ 期 细 胞 总
的细胞 和最 晚进入 Ｍ期 的细胞之 间 的时间差 为 Ｓ期 时间 ， 从被标记 的 Ｍ 期细胞 开始 出现 并渐 渐 消失 ， 到 被标 记的 Ｍ期 细胞重新 出现为 整个细胞 周期 （ ．Ｓ Ｇ、、
Ｇ 、 的时间。 ２ Ｍ）
Ｄ Ａ的 复制 需 要 原 料 ， 括 —Ｔ Ｒ， 而 经 — Ｎ 包 Ｈ Ｄ 因 Ｈ
应用 Ｔ Ｒ（ Ｈ— Ｄ 氚标记胸腺嘧啶核苷） Ｂｄ （ 或 ｒＵ 溴 脱氧尿嘧啶核苷 ， 为胸腺嘧啶核苷类 似物 ， 通过竞争掺 入 Ｄ Ａ合成 期（ Ｎ Ｓ期 ） 细胞 的单链 Ｄ Ａ核苷 酸序列替 Ｎ 代胸腺嘧啶） 短期饲养细胞 ， 后将 此 Ｈ—Ｔ Ｒ洗脱 ， Ｄ 置 换新鲜培养液继续培养 ， 定时取样 ， 放射 自显影观察 作 分析。 在整个细胞 周期 中， Ｎ Ｄ Ａ的复 制发 生在 Ｓ期 ， 而
生 素 Ｃ含 量 的 多少 。
类、 脂肪 的试验 ， 学会鉴定食 物主要成分 的简单方法。 （） １ 取一些馒头屑 放在载玻 片上 ， 滴上 １ 碘酒 ， 滴 观察发生 的变化 。 （） ２ 取一些鸡蛋 清 ， 别放进 ２只烧 杯里 ， 中 １ 分 其 只加入少量开水 ， 并迅速搅 拌 ， 观察变化 。
・５－ ２ 生物学教 ２ ０ （ ５ 第７ ０ 年 第３卷） 期 １
浅 析 细 胞 周 期 的 常 用 测 定 方 法
金 ］ 杰 （ 江 绍 县 中 ３ ０ ） 王 浙 省 兴 柯桥 学 １３ ２０
细胞种类众多 ， 繁殖有快有慢 ， 其细胞周期长短 各 异 。关 于细胞周期 时间 长短 的测定 ， 两种 常用 的方 有 法， 在这里结合相关例题作简单介绍 。
Ｃ含量 的 多少 。
见食物 中主要营养成分” 实验设计 、 录表如下 ： 记
证 明含 有 实验材料 实验 方法 试验现象 的主要 营 养 物质 为 必做 放 在 载 玻 实验 １ 馒头屑 片上 ， 上 滴 滴碘酒 必 做 加 入 少 量 实验 ２ 鸡蛋清 开水 ， 迅 并 速搅拌 必 做 炒 熟 的 花 放 在 白 纸 实验 ３ 生种 子 上， 用力挤

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检测细胞周期的方法

检测细胞周期的方法

检测细胞周期的方法
1. 流式细胞术：
PI能够插入双链DNA中。

它被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜。

(1) 收集细胞（1～5）×10 6个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

(2) 3ml PBS洗一次。

(3) 离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。

(4) 离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。

(5) 400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。

(6) 用1ml PI染液，4℃避光30min。

(7) 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

2. 高内涵分析
PI ,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA 结合后能被激发产生荧光,通过高内涵检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度可以反映了细胞内DNA 含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N) ,G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此,通过高内涵拍照，利用图像分析软件可以将细胞周期各时相区分为G1/ G0 期,S 期和G2/ M 期,并可通过软件计算各时相的百分率。

细胞周期的流式检测方式技巧

细胞周期的流式检测方式技巧

细胞周期的流式检测方法细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为G0/G1期、S期、G2/M期。

在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。

细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI从而测定细胞群体的周期分布。

因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson）公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪测定PI标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。

一、PI染色步骤概略1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min，弃上清。

2、PBS 1ml离心，弃上清。

3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。

4、PBS 1ml离心，弃上清。

5、RNase A的PBS溶液(20ug/ml)，500ul，37℃，30min，离心弃上清。

6、PBS 1ml离心，弃上清。

7、PI的PBS溶液(50ug/ml)，500ul，室温避光孵育30min。

8、吹打混匀，300目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。

二、Calibur仪器设置及数据收集1、依次打开Calibur机器电源、电脑开关和CellQuest Pro软件，按快捷键Command+B连机，按快捷键Command+1、2、3、4调出Detectors/Amps面板、Threshold面板、Compensation 面板和Status面板，软件的操作界面如图1所示。

图1. Cell Quest Pro软件操作界面2、建立实验模板，包括FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图和FL2-A直方图。

因为PI 在Calibur上是由488nm的激光器激发，530/30滤光片收集信号，所以选择FL2通道进行检测。

细胞周期是2N和4N的循环，所以FL2通道的Mode参数应设置为Lin模式，同时阈值（Threshold）的Primary Param参数设置为FL2-H，Four Color DDM Param参数设置为FL2，如图2、图3所示。

2014-5-6 PI法细胞周期检测

2014-5-6 PI法细胞周期检测

细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。

S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。

细胞周期检测介绍

细胞周期检测介绍

细胞周期检测介绍全心全意就为医生服务，一心一意只为造福医生细胞周期检测的原理：PI法是经典的周期检测方法。

PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

实验步骤：1. 细胞培养:六孔板种下细胞，每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液（三复孔）,处理相应时间后，收细胞检测(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106)2. 细胞处理：胰酶消化含血清培养基中和，2000 rpm 5 min，用预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;3. 细胞固定：1ml PBS充分重悬，成单细胞，轻轻边vortex，边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇，至终浓度75%，4度静置过夜（18-24h），-20度长期保存一个月（预约流式细胞仪）4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次，2000rpm 5min去除PBS 后加入200 ul PBS(约400ul)，为减少细胞损失可用1.5ml离心。

移至1.5ml EP管中, 轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团。

加入20 μLRNase（储存浓度25 mg/mL，PBS 稀释成1mg/ml，工作浓度50ug/ml），重悬细胞，37 ℃水浴消化30 min；加入PI 20ul至终浓度50ug/ml（储存液浓度25mg/ml, PBS稀释1mg/ml加入10ul）锡箔纸包住，避光4度染色30min，24h内上机检测。

充分混匀细胞，用200 目滤网过滤后，便可利用流式细胞仪进行细胞周期。