伴高血压2型糖尿病大鼠模型的建立
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伴高血压2型糖尿病大鼠模型的建立作者：孙兆峰王利张玲李大伟夏作理【摘要】目的制备与人类发病过程类似的伴高血压2型糖尿病大鼠模型。
方法选择40只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为对照组12只和实验组28只，对照组以标准大鼠饲料饲喂，实验组以高脂高盐饲料喂养，两组均饮用大鼠专用去离子水，16 w进行正糖钳实验，确定胰岛素抵抗，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)造成2型糖尿病。
实验过程中每周测食量、水量和体重，每4 w测血糖和尾动脉血压，实验16 w时取血测空腹血浆胰岛素。
结果饲喂高脂高盐饲料16 w后，与对照组相比，实验组尾动脉血压明显升高，差异显著（P＜0.01）；实验组空腹胰岛素浓度明显高于对照组（P＜0.01）；与对照组相比，实验组葡萄糖输注速率明显降低，两组差异有统计学意义；STZ注射后实验组血糖明显升高，达到了糖尿病的诊断标准。
结论高脂高盐饮食配合STZ腹腔注射可成功诱导出伴高血压2型糖尿病大鼠模型。
【关键词】 2型糖尿病；高血压；高脂肪高盐饮食；高胰岛素正常血糖钳夹实验高血压是糖尿病患者极为常见的共患病，总体上糖尿病伴高血压的患病率约在20%～50%左右。
以往研究多集中于单纯2型糖尿病或单纯高血压，对2型糖尿病合并高血压的实验研究相对较少，而后者的实验结论往往对临床则有更高的指导意义。
长期食用以脂肪为代表的高热量饮食可导致胰岛素抵抗(IR)，而高盐饮食则和高血压的发生有关，新近已有学者〔1，2〕采用不同配比的高脂高盐饲料喂养建立代谢综合征(MS)大鼠模型。
本研究旨在以高脂肪高盐饮食诱导配合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立一种伴高血压的2型糖尿病大鼠模型。
1 材料与方法1.1 实验动物选用SPF级雄性Wistar大鼠 40只，体质量（140±20） g，购于山东中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(鲁)。
动物饲养于半透明IVC盒内，自由饮食进水，明暗周期12 h，单笼饲养。
动物房温度 22～26℃，湿度55%～65%。
适应性饲养7 d 后，用随机数字法将大鼠分为对照组12只和实验组28只。
实验组于注射STZ后第3天和第5天各死亡1只。
1.2 实验材料和主要仪器 STZ和戊巴比妥钠购于Sigma公司，肝素和中性胰岛素购于江苏万邦生化医药公司，罗康全血糖仪及试纸购于美国罗氏公司，胰岛素放免试剂盒购自中国原子能科学研究院同位素研究所。
微量注射泵购于浙江大学医学仪器公司，ALC NIBP 无创血压测定分析系统由上海澳尔科特生物技术公司生产。
1.3 方法1.3.1 造模饲料实验大鼠标准饲料购于山东中医药大学实验动物中心。
造模饲料由质量比占75%标准饲料加食用化猪油20%和氯化钠5%加工而成。
1.3.2 模型制备实验大鼠适应性饲养7 d后，对照组继续以标准大鼠饲料喂养，实验组则以高脂饲料取代标准大鼠饲料喂养，两组均饮用大鼠专用纯净水，喂养16 w后，两组各取6只大鼠进行正糖钳实验，确定发生IR后，实验组给予STZ 20 mg/kg腹腔注射，对照组予相同体积枸橼酸缓冲液（pH=7.4）。
1.3.3 正常血糖钳夹实验采用罗谋伦〔3〕等的方法稍加改良，禁食不禁水大鼠12 h 后，称重，以 1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉。
大鼠仰位固定于大鼠手术台上，保持体温在37.5℃左右，用0.03 mm硅化胶管进行双侧颈静脉和左侧颈动脉插管，管腔中预先注入 200 IU/ml 的肝素生理盐水抗凝。
双侧静脉导管分别连接微量注射泵的两个针筒座上，用以分别输注葡萄糖和胰岛素，左颈动脉导管用以取血测血糖。
待输注装置安装完毕后，首先经左颈动脉导管取血0.5 ml用于基础血糖值和基础血浆胰岛素测定，从右外颈静脉插管按1 ml/kg体重注射入1 000 IU/ml肝素生理盐水溶液使血液抗凝，然后封住插管的出口，以免静脉血流出。
然后从右颈静脉恒速输注胰岛素，速率为4 mU·kg-1·min-1，当血糖值从基础值下降达到0.5 mmol/L时，开始从左颈静脉输注 10%葡萄糖溶液，每5 min测一次血糖，根据所测血糖值不断调整葡萄糖输注速率(GIR)，连续30 min血糖值稳定在基础血糖值±0.5 mmol/L范围内，称之为“钳夹形成”，记录稳态下连续60 min的GIR。
取稳态下6次GIR的平均值。
1.3.4 尾动脉血压测定使用ALC NIBP无创血压测定分析系统，预热仪器，把大鼠用固定盒固定，露出尾巴安装并调整好压力感受器，放入恒温箱中30 min，待大鼠安静且脉搏波形稳定后开始测量，每只记录6次，去掉最高和最低值，取其平均作为此次的血压值。
1.3.5 生化及一般指标检测每周测1次食量、饮水量和体重。
每4周同一时间点剪尾尖取血测血糖，采用葡萄糖氧化酶法，以血糖≥13 mmol/L诊断为糖尿病。
正糖钳实验同时颈动脉取血0.5 ml，肝素抗凝，4℃恒温3 000 r/min离心，取血浆采用放免法测空腹血浆胰岛素(FINS)。
1.4 统计学分析使用SAS8.1 软件进行数据处理，实验数据以x±s表示，组间差异采用t检验。
2 结果2.1 两组大鼠食量、饮水量和体重变化情况与对照组大鼠比较，实验前8 w实验组大鼠食量无明显差异，8 w后实验组24 h摄食量有所下降，STZ注射后1 w食量进一步下降，从第2周实验组食量明显增加；饮水量自实验起始至终止实验组明显高于对照组(P＜0.01)，STZ注射后2 w实验组饮水量较注射前增加近3倍；STZ注射前两组大鼠体重无显著差异，注射后实验组大鼠体重急剧下降，范围在45～50 g左右，见表1。
表1 两组大鼠食量、饮水量以及体重的变化（略）与对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01，下表同2.2 两组大鼠尾动脉血压、FINS和GIR的比较饲喂高脂高盐饲料16 w后，与对照组相比，实验组尾动脉血压明显升高（P＜0.01）；实验组FINS明显高于对照组（P＜0.01）；与对照组相比，实验组GIR 明显降低，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。
见表2。
表2 STZ注射前两组大鼠血压、FINS和GIR的比较（略）图1 STZ注射后两组大鼠血糖的变化（略）2.3 STZ注射前后两组大鼠血糖值的变化情况 STZ注射前实验组大鼠血糖值与对照组无显著差异。
实验组STZ注射后3 d血糖值达到高峰，以后逐渐下降，第16天时达到低值，又渐上升达到较稳定状态，STZ注射后各时间点血糖值均与对照组差异显著(P＜0.01)。
见图1。
3 讨论糖尿病和高血压是MS的两个重要组成部分，IR作为一种异常的病理生理状态，是MS多种临床表型如高血压、糖尿病等发病的“共同土壤”与中心环节，IR与2型糖尿病和高血压关系十分密切，已成为各国学者研究的热点〔4〕。
建立准确模拟临床疾病特征的动物模型是开展研究的基础。
本文结合文献〔5〕，用高脂高盐饮食诱导配合STZ腹腔注射建立了伴高血压2型糖尿病大鼠模型。
临床及实验研究表明，脂肪摄入过多与IR关系密切，饮食中脂肪摄入过多是公认的引发IR和2型糖尿病的重要环境因素，本实验用高脂饮食诱导16 w可使大鼠发生IR也支持这个观点，其机制可能为高脂饮食导致骨骼肌葡萄糖摄取减少，减弱胰岛素抑制肝糖输出的能力，并影响葡萄糖刺激胰岛细胞的胰岛素分泌，最终可导致IR的发生〔6，7〕。
本实验结果显示，前8 w两组食量无差别，8 w后实验组食量有所下降，STZ注射后1 w食量进一步下降，从第2周实验组食量明显增加，这可能是STZ注射使大鼠器官代谢功能下降出现食量下降，实验中实验组死亡大鼠解剖可见，胰腺充血，体积缩小，膀胱蓄积血性尿液，而后的食量增加是模型建成的证据之一。
STZ注射前两组体重一直未出现差别，STZ注射后的体重下降则与大鼠器官功能下降有关。
IR的诊断方法种类繁多，本实验采用了诊断IR的“金标准”正糖钳实验检测，结果显示，经过16 w的高脂高盐诱导，实验组的GIR明显下降，说明这种方法是较为可靠和稳定的。
实验过程应注意以下几点，可增加正糖钳实验的成功率：①保证12 h的禁食，且禁食的时间点也应保持一致，禁食前更换垫料可最大程度的排除饮食对血糖的干扰。
②保持稳定的麻醉深度，戊巴比妥钠麻醉效果要优于水合氯醛，安全性也高，术中保温可有助于大鼠状态的稳定。
③实验中未使用三通管，左右颈静脉分别插管用来输注胰岛素和10%葡萄糖，可减少相互干扰。
④从动脉插管处预先取血0.5 ml，再取血1滴测血糖，可准确反映体内真实血糖值。
实验中还观察到实验组的FINS值明显高于对照组，这说明高脂高盐饮食已引起IR，胰岛素代偿性增加。
高脂高盐饲料喂养大鼠16 w后，实验组血压明显高于对照组，其原因可能为：①IR发生时，血中胰岛素水平升高而促进血管紧张素Ⅱ生成。
血管紧张素Ⅱ有缩血管和协同胰岛素增敏内皮素的活性〔8〕，导致血压升高。
②与IR时胰岛素刺激Na＋K＋ATP酶和增强交感神经活性有关。
③肾素血管紧张素醛固酮系统活动的增加也是重要的影响因素之一〔5〕。
另外血管紧张素Ⅱ还能抑制胰岛素信号转导过程，加重IR〔9，10〕，并引发多种心脑血管并发症。
综上所述，用高脂高盐饮食诱导加STZ腹腔注射可以建立伴高血压2型糖尿病大鼠模型，与以往类似研究不同的是，大鼠体重未出现明显增长，这可能与大鼠品系或大鼠对高脂高盐饮食不敏感有关，还需进一步研究。
【参考文献】1 曹廷兵,闫振成,沈成义，等.代谢综合征大鼠模型的建立及其相关基因表达变化的研究〔J〕.解放军医学杂志,2005；30(8):7025.2 李建生，赵敏，余海滨,等.代谢综合征大鼠模型的建立与评价及增龄因素的影响〔J〕.中国老年学杂志，2005；25(12):14902.3 罗谋伦，郭欲晓，林志彬.大鼠正糖钳实验方法学〔J〕.药学学报，1999；34(4):2559.4 黄峻,刘超，丁国宪.代谢综合征与心血管疾病〔M〕.北京:科学出版社,2004:19.5 玉从容，吕俊华.葛根素对胰岛素抵抗高血压模型大鼠血压和肾素血管紧张素系统的影响〔J〕.四川中医，2005；23(4):20 2.6 Fueger PT，Bracy DP，Malabanan CM,et al.Hexokinase Ⅱoverexpression improves exercise stimulated but not insulin stimulated muscle glucose uptake in high fat fed C57BL/6J mice〔J〕.Diabetes，2004;53（2）:30614.7 卜石，杨文英,王昕，等.长期高脂饲料饲养对大鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2003；19(1):258.8 Bloomgarden ZT.American Diabetes Association annualmeeting，insulin resistance，exercise and obesity〔J〕.Diabetes Care，1999；22(3):51722.9 Sowers JR.Insulin resistance and hypertension〔J〕.Am J Physiol，2004；286(5):1597602.10 Fukuda N，Satoh C，Hu W,et al.Endogenous angiotensin Ⅱsuppresses insulin signaling in vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats 〔J〕.J Hypertens,2001;19(9):16518.。
