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一、实验目的细胞活力是细胞生物学研究中非常重要的指标，能够反映细胞在特定条件下的生长、代谢和功能状态。
本实验旨在通过多种方法检测细胞活力，了解细胞在不同条件下的生长情况，为后续实验研究提供依据。
二、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）2. 试剂：台盼蓝染色液、CCK-8试剂盒、Resazurin细胞活力检测试剂盒、ATP含量测定试剂盒、细胞培养液、培养基、PBS缓冲液等3. 仪器：显微镜、酶标仪、细胞计数板、细胞培养箱、超净工作台等三、实验方法1. 台盼蓝染色法（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）用PBS缓冲液洗涤细胞，加入适量的台盼蓝染色液，室温孵育5分钟。
（3）用PBS缓冲液洗涤细胞，观察细胞染色情况。
2. CCK-8试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl CCK-8试剂，避光孵育2小时。
（4）用酶标仪检测450nm波长下的吸光度（OD值）。
3. Resazurin细胞活力检测试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl Resazurin试剂，37℃孵育4小时。
（4）用酶标仪检测570nm和600nm波长下的吸光度（OD值）。
4. ATP含量测定法检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl ATP含量测定试剂盒，室温孵育10分钟。
（3）用酶标仪检测560nm波长下的吸光度（OD值）。
四、实验结果与分析1. 台盼蓝染色法通过显微镜观察，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色。
一、实验目的通过本实验，掌握生物细胞实验的基本操作步骤，了解细胞的基本结构和功能，为后续的生物学实验打下基础。
二、实验原理生物细胞是生命活动的基本单位，具有复杂的结构和功能。
通过观察细胞的结构和功能，可以了解生命现象的本质。
本实验主要观察细胞的基本结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
三、实验材料1. 实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、酒精灯、吸水纸、显微镜镜头、显微镜台、显微镜光源等。
2. 实验试剂：生理盐水、碘液、苏丹Ⅲ染液、醋酸洋红染液、解离固定液等。
3. 实验材料：洋葱鳞片叶、口腔上皮细胞、小鼠睾丸组织等。
四、实验步骤1. 观察洋葱鳞片叶细胞（1）取洋葱鳞片叶，用镊子撕取一小块透明薄膜内表皮。
（2）将撕取的内表皮浸入载玻片上的生理盐水滴中，用镊子展平。
（3）在盖玻片的一侧滴加稀碘液，另一侧用吸水纸吸引，使染液浸润标本的全部。
（4）将盖玻片轻轻盖在标本上，用镊子夹住盖玻片的一侧，用另一侧的镊子夹住载玻片的一侧，轻轻压紧。
（5）用显微镜观察细胞结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
2. 观察口腔上皮细胞（1）用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。
（2）在载玻片的中央滴一滴生理盐水。
（3）用凉开水漱口，用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下，牙签上就附着了一些碎屑。
（4）把牙签放在载玻片的生理盐水滴中均匀地涂抹几下。
（5）在盖玻片的一侧滴加稀碘液，另一侧用吸水纸吸引，使染液浸润到标本的全部。
（6）将盖玻片轻轻盖在标本上，用镊子夹住盖玻片的一侧，用另一侧的镊子夹住载玻片的一侧，轻轻压紧。
（7）用显微镜观察细胞结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
3. 观察小鼠睾丸组织细胞（1）取小鼠睾丸组织，放在解离固定液中，一定时间后漂洗。
（2）将漂洗后的组织放在载玻片上，滴加适量醋酸洋红染液。
（3）一定时间后加盖玻片，并轻压盖玻片，使细胞分散开。
（4）用显微镜观察细胞结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
五、实验注意事项1. 操作过程中要保持无菌，避免污染。
细胞实验步骤及注意事项本文为各位细胞小白带来细胞实验步骤和细节讲解，希望你看过之后能对细胞实验有个清晰的了解，只要你足够的细心，看完之后完全有能力自己独立操作哦……基本准备工作灭菌、消毒1. 无菌室和操作区消毒实验前用 70% 乙醇擦净洁净台，再将实验器材放入超净工作台，打开紫外线灭菌灯，40 分钟后消毒完毕，关闭紫外线灯，打开吹风，注意两扇门不要同时打开。
细胞房每周都要打开房间的紫外线灭菌灯进行整体消毒。
长期未使用的细胞房在实验前需要用20% 乙酸蒸24 h。
2. 二氧化碳培养箱消毒二氧化碳培养箱定期需要用 70% 乙醇擦拭托盘和内壁，同时使用手提紫外灯进行消毒。
培养箱低端托盘的水也要为无菌水，并两周更换一次。
3. 器皿灭菌、消毒玻璃器皿和螺口盖采用高压灭菌（121 ℃，100 kPa，20 min），玻璃器皿包括移液管、冻存瓶、盖玻片、载玻片、玻璃注射器、玻璃试管、吸管等。
螺口盖的盖子分为有內垫的金属或酚醛树脂盖、聚丙烯盖子、硅树脂盖子、白橡胶盖子。
塑料器皿的消毒通常采用紫外照射 4～6 h 的方法。
PBS、hanks 等平衡盐溶液中的葡萄糖、高压灭菌时会融化变焦，所以要等高压灭菌之后再加。
4. 试剂和培养基这类物质一般采用0.22 μm 滤膜除菌。
基本手法1. 用微量移液器在吸取和加入液体时，枪头须伸入瓶口以降低在空气中污染的几率；2. 像试剂瓶、培养瓶中加入试剂时，一般为右手持微量移液器，左手食指和拇指握住瓶身，食指和中指夹住瓶盖，并使瓶身适当的倾斜，尽量不要让瓶身竖直，更不能用手触摸瓶口。
手小者可以将瓶盖扣在超净工作台的台面上。
3. 试剂瓶、培养瓶等盖上盖子前需要将盖子在酒精灯上晃一秒钟。
超净工作台物品摆放复苏1. 准备工作：提前开启恒温水浴锅，将温度调节在37℃～41℃ 之间；取一细胞培养瓶，加入预热的完全培养基。
提前加入培养基有助于接种时细胞能够均匀分散。
2.取细胞：从液氮罐中取出细胞。
通过本实验，了解细胞活力测试的基本原理和方法，掌握MTT法（MTT比色法）测定细胞活力的操作步骤，并分析细胞在不同条件下的活力变化。
实验时间：2023年4月10日实验地点：细胞生物学实验室实验材料：1. 细胞系：人肺上皮细胞（A549）2. MTT试剂：3-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）3. DMSO（二甲基亚砜）4. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素5. 细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、吸管、试管、离心机、酶标仪等实验方法：1. 细胞培养：将人肺上皮细胞（A549）接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至新的培养瓶中。
3. 实验分组：将传代后的细胞分为实验组和对照组，实验组细胞在特定条件下培养，对照组细胞在正常培养条件下培养。
4. 细胞接种：将实验组和对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为5×104个。
5. 细胞培养：将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。
6. MTT实验：向每孔细胞中加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。
7. 终止培养：弃去孔内液体，向每孔加入150μl DMSO，振荡混匀。
8. 比色：用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度（OD）值。
9. 数据分析：计算实验组和对照组的细胞活力，并比较两组间的差异。
1. 实验组细胞活力较对照组显著降低，说明特定条件下细胞活力受到抑制。
2. 不同浓度药物处理的实验组细胞活力呈剂量依赖性下降，说明药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验结论：通过MTT法测定细胞活力，可以有效地评估细胞在不同条件下的生长状态。
本实验结果表明，特定条件下细胞活力受到抑制，且药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验讨论：1. MTT法是一种简单、快速、灵敏的细胞活力测定方法，适用于多种细胞系和药物筛选实验。
高中生物细胞实验教案一、实验介绍高中生物课程中，细胞是一个重要的研究对象。
细胞实验可以帮助学生加深对细胞结构和功能的理解。
本教案将介绍一个针对高中生的细胞实验，旨在通过实际操作和观察，让学生亲自体验细胞的结构和功能，提高实践能力和科学思维。
二、实验目的本实验旨在帮助学生：1. 了解细胞的基本结构和功能；2. 学习如何通过显微镜观察细胞；3. 培养实验操作技能和科学态度。
三、实验准备1. 实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、移液管、生理盐水、荧光染色剂等；2. 实验材料：洋葱、小麦胚芽、酵母、水蕨等；3. 实验环境：安静、明亮的实验室。
四、实验步骤1. 收集细胞样本：a. 将洋葱切成薄片，用显微镜夹具将薄片固定在载玻片上；b. 用滴管滴上一滴生理盐水，覆盖上盖玻片；c. 用显微镜调节放大倍数，观察洋葱表皮细胞的形态和结构。
2. 观察细胞结构：a. 收集小麦胚芽、酵母、水蕨等不同的细胞样本；b. 按照步骤1中的操作，制作细胞载玻片；c. 分别放大观察不同细胞样本，记录细胞的结构特点。
3. 染色观察：a. 准备荧光染色剂，并按照说明书的要求进行染色；b. 将洋葱细胞载玻片放入染色剂溶液中浸泡一段时间；c. 用显微镜观察染色后的细胞样本，记录并比较染色前后细胞的变化。
五、实验结果和讨论1. 学生观察到洋葱表皮细胞的大规模整齐排列，细胞间有壁和空隙；2. 小麦胚芽细胞呈矩形，有明显的细胞核和细胞质；3. 酵母细胞呈圆形，单细胞结构简单；4. 水蕨细胞呈带状，呈现松散的细胞结构。
六、实验总结通过上述实验，学生们亲自参与了细胞的制作、染色和观察过程，提高了他们的实践能力和科学思维。
同时，他们也深入了解和熟悉了细胞结构和功能，加深了对细胞的理解。
通过本实验，学生们还学会了使用显微镜观察细胞，并学会了制作细胞载玻片和使用荧光染色剂。
这些实践操作对于培养学生们的实验技能和科学态度都有积极的作用。
七、延伸拓展针对不同学生的学习水平和兴趣，可以进行以下延伸拓展：1. 深入了解细胞器官的结构和功能；2. 进一步学习细胞的分裂和遗传；3. 探索细胞与生物的关系，如细胞的代谢和能量转化等。
一、实验目的1. 了解细胞在特定条件下的运行特性。
2. 掌握细胞运行测试的基本原理和方法。
3. 分析细胞在不同环境条件下的运行速度和方向。
二、实验原理细胞在体内或体外环境中，受到各种内外因素的作用，会产生运动。
细胞运行测试是通过观察细胞在特定条件下的运动轨迹、速度和方向，来研究细胞生物学特性的实验方法。
本实验采用细胞追踪技术，通过观察细胞在细胞培养板上的运动，分析细胞的运行特性。
三、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）。
2. 培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）。
3. 细胞培养板：96孔板。
4. 细胞追踪系统：细胞追踪显微镜。
5. 计算机软件：细胞追踪分析软件。
四、实验步骤1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%汇合度时进行实验。
2. 实验分组：将细胞分为三组，分别模拟不同环境条件下的细胞运行。
- A组：正常细胞运行组。
- B组：细胞生长因子缺失组。
- C组：细胞生长因子过量组。
3. 细胞追踪：将细胞培养板置于细胞追踪显微镜下，选择A组细胞进行追踪实验。
使用细胞追踪分析软件，记录细胞在细胞培养板上的运动轨迹、速度和方向。
4. 数据分析：将A、B、C三组细胞的运行数据进行分析，比较不同环境条件下细胞运行特性的差异。
五、实验结果1. A组细胞在正常环境条件下，运动速度较快，运行轨迹较为规律。
2. B组细胞在生长因子缺失环境下，运动速度明显降低，运行轨迹较为杂乱。
3. C组细胞在生长因子过量环境下，运动速度较快，但运行轨迹较为曲折。
六、实验结论1. 细胞在正常环境条件下具有较好的运动能力，运动速度较快，运行轨迹较为规律。
2. 细胞生长因子对细胞运行具有显著影响，生长因子缺失或过量均会导致细胞运行能力下降，运行轨迹变差。
3. 本实验结果表明，细胞运行测试可以用于研究细胞生物学特性，为细胞生物学研究提供新的实验方法。
七、实验讨论1. 细胞运行测试可以用于研究细胞在特定环境条件下的生物学特性，为细胞生物学研究提供新的实验方法。
020301Contents0201实验目的及原理Experimental purpose and principle01.实验目的及原理Experimental purpose and principle学习荧光显微技术来测定细胞活力实验用品Experimental supply02.实验用品Experimental supply(一) 材料：新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆原生质体悬液，人口腔上皮细胞。
(二) 用品：荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，烧杯，牙签等。
(三) 试剂：1．二丙酸酯荧光素溶液：取10mg二丙酸荧光素于5ml丙酮中，将此溶液逐滴加入 5ml PH5-6生理盐水或0.65M的甘露醇溶液中，直到出现永久性乳白沉淀为止。
2．0.01％吖啶橙的生理盐水溶液。
实验方法Experimental methods04.实验方法Experimental methods(一) 细胞二丙酸酯荧光素分解酶的活性及细胞活力的测定原理：二丙酸酯荧光素是非荧光性的亲酯性化合物，很容易进入细胞活力较强的细胞内。
①细胞内有较强的活性酯酶而将二丙酸酯荧光素中的荧光素分解出来，从而在荧光显微镜下发出了强烈的黄绿荧光②相反活力较弱的细胞，由于酯酶的含量低，表现荧光较弱③而死亡的细胞，由于酯酶活性丧失，不能分解二丙酸酯荧光素，而完全没有荧光(一) 细胞二丙酸酯荧光素分解酶的活性及细胞活力的测定1．取少许新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆表皮放在玻片上，加二丙酸酯荧光素溶液一滴，5-1O分钟后，在荧光显微镜下观察，时间不宜太长，以免细胞逐渐死亡。
2．若着染是悬浮细胞，可将上述染色液数滴直接加入细胞培养液5分钟后，可离心收集。
再用无细胞和无染料的培养液洗二次，即可收集观察。
上述染过的细胞可保存在4℃左右的冰箱中，直到细胞死亡前都可观察。
(二) 吖啶橙鉴定细胞死活（台盼蓝也可鉴定）细胞经吖啶橙染色，在激发光作用下，活细胞核呈黄绿色或亮绿色荧光，而细胞质为淡红色，但含有粘多糖的细胞在其细胞质中出现桔黄色颗粒，或整个细胞质呈桔黄桔红色荧光，死细胞核呈红色荧光方法如下：用牙签取少许口腔粘膜上皮细胞，涂在载玻片上，滴加1-2滴0.01％吖啶橙生理盐水溶液，加盖玻片，待染色5分钟后于荧光显微镜下观察，注意细胞核所呈荧光颜色。
细胞生物学实验方法与技术1.细胞培养：细胞培养是细胞生物学研究中最基本的实验技术之一、它通过将细胞放入培养基中，在特定的环境条件下进行体外培养。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞进行进一步的实验研究。
2.免疫荧光染色：免疫荧光染色是一种常用的细胞实验方法，通过此方法可以检测特定蛋白质或分子在细胞中的分布和定位。
该技术利用特异性的抗体与目标分子结合，并用荧光染料标记抗体，从而利用荧光显微镜观察染色结果。
3. 免疫印迹法（Western Blot）：免疫印迹法是一种用于检测特定蛋白质的定量和分析的方法。
该方法通过将细胞或组织中的蛋白质经过电泳分离，并转移到膜上，然后用特异性的抗体与目标蛋白质结合，最后通过酵素反应或荧光信号检测目标蛋白质的存在和表达水平。
4.转染技术：转染技术是将外源的DNA或RNA导入到目标细胞中的一种常用方法。
常见的转染技术包括植入病毒载体、使用质粒转染剂、电穿孔和化学转染等。
通过转染技术，可以实现基因过表达、基因沉默等实验研究。
5.索引技术：索引技术是一种分析和比较细胞中基因表达的实验方法。
通过索引技术，可以快速筛选出在不同生理状态下表达差异显著的基因，并进一步研究这些基因的功能和调控机制。
常见的索引技术包括差异显著性分析、基因芯片、RNA测序等。
6.荧光显微镜技术：荧光显微镜技术是一种使用荧光染料观察细胞结构和功能的方法。
荧光显微镜可以通过选择不同的染料和光源，实现对细胞核、细胞器等结构的观察。
此外，还可以利用特定的荧光探针，实现对细胞内的信号分子、离子和代谢产物的监测。
7.流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测细胞的光学和物理特性，实现对单个细胞的定量分析和分选的方法。
该技术可以实现细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。
特别是流式细胞术结合细胞分类仪，可以实现高通量的细胞分析。
综上所述，细胞生物学实验方法与技术为研究细胞的结构、功能和特性提供了重要的工具。
随着科技的不断发展，细胞生物学实验方法与技术也在不断更新与创新，为我们更好地理解细胞的生命活动提供了强大的支持。
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
细胞功能学实验一、引言细胞是生命的基本单位，细胞功能学实验是研究细胞结构和功能的重要手段。
通过实验可以探索细胞的生理功能、代谢活动以及对外界刺激的响应等。
本文将介绍细胞功能学实验的一些常见技术和方法。
二、细胞培养实验1. 细胞培养基的准备细胞培养基是维持细胞正常生长的基础，其成分包括营养物质、生长因子、激素等。
实验中需要根据不同细胞类型的需求调配适当的培养基，以提供细胞所需的营养和环境。
2. 细胞的传代和增殖实验细胞的传代是指将细胞从一代转移到下一代的过程。
在实验中，要根据细胞的生长情况和密度，适时进行细胞的传代。
细胞增殖实验可以通过细胞计数和增殖曲线绘制来评估细胞生长速度和增殖能力。
3. 细胞凋亡实验细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，具有重要的生理和病理意义。
实验中可以利用DNA染色和流式细胞术等方法，观察细胞的凋亡情况，并通过荧光显微镜或流式细胞仪进行定量分析。
三、细胞生物学实验1. 细胞膜通透性实验细胞膜是细胞与外界环境之间的物质交换的关键界面。
实验中可以利用细胞渗透压实验、细胞内外溶液浓度差实验等方法，探究细胞膜对不同物质的通透性和选择性。
2. 细胞分裂实验细胞分裂是细胞生命周期的重要阶段，也是细胞增殖和生长的基础。
实验中可以通过显微镜观察细胞分裂的各个阶段，如有丝分裂和无丝分裂，并记录其形态和时间，以研究细胞分裂的机制和调控。
3. 细胞器实验细胞器是细胞内部的功能分区，包括线粒体、内质网、高尔基体等。
实验中可以利用细胞染色和荧光探针等技术，观察细胞器的形态和运动，并研究其在细胞功能中的作用。
四、细胞信号传导实验1. 细胞蛋白磷酸化实验细胞蛋白磷酸化是细胞信号传导的重要方式之一，可以调控蛋白的活性和功能。
实验中可以利用免疫印迹等技术，检测和分析细胞内的磷酸化蛋白，以研究细胞信号传导通路的激活和调控。
2. 细胞表面受体实验细胞表面受体是细胞与外界环境之间进行信号识别和传递的重要结构。
实验中可以利用荧光标记和流式细胞术等技术，检测和定量细胞表面受体的表达水平和活性，以研究细胞对外界刺激的响应。
一、细胞运动性概述细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。
在低等生物中，原始细胞通过变形和伪足活动趋近食物和远离伤害。
在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切相关。
人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息相关。
细胞的运动依赖于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，例如肌动蛋白是细胞运动伪足中最主要的结构单位。
当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展和基部的收缩，以及细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。
细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不同的粘附因子与细胞外基质（Extracellular Matrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不同细胞的特定组织转移与偏好。
图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复二、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。
然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的主要方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕和Boyden Chamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性以及细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记对于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包括细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。
1.基于显微镜的形态观察（可免疫荧光标记）基于显微镜直接观察细胞运动性一般依赖活细胞工作站记录单一细胞的运动轨迹，如果通过染色标记可以观察细胞骨架的改变。
该方案对显微系统要求高，难以同步观察细胞群落的整体状态，染色侵入式标记对细胞损伤大。
活细胞工作站观察非小细胞共聚焦显微镜观察绿色荧光标记运动中的细胞肺癌（A549）的体外运动2.体外组织移植（可免疫荧光标记）通过原代组织，建立短期的移植物离体培养，经染色可直接观察迁移能力。
适用于少数特定组织如神经元，应用范围有限，技术难度大。
小鼠嗅球神经干细胞体外移植物迁移小鼠海马神经干细胞体外移植物定向迁移（无趋化因子诱导）（SDF-1趋化因子定向诱导）3.细胞集落划痕建立细胞培养划痕实验，观察人为划痕的愈合状态来间接评估细胞迁移率，实验简单，但误差大，重复性低，干扰因素多。
细胞伤痕愈合试验单细胞层刮出条状“伤口”0小时，18小时后，细胞层的愈合状况。
I: 诱导表达14-3-3蛋白的3T3细胞；U:未诱导表达14-3-3蛋白3T3细胞。
虚线表示了细胞运动的远端位置。
4.Boyden Chamber法Boyden Chamber法又称Transwell技术，是目前最常用的检测细胞运动性方法，通过将细胞加入上孔室，在下孔室加入血清或其它趋化因子诱导细胞迁移到下室。
利用染色人工计数迁移细胞数目用于评估细胞的迁移。
该方法无法满足动态同步监控，人为计数误差较大，重复率低。
显微镜观察迁移到微孔膜底部的细胞（染色后）5.基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence-RTCIM）xCELLigence-RTCIM是Roche与AceaBio公司联合开发出来最新一代细胞检测技术，将微电子传感技术与Boyden Chamber原理相结合，将电子芯片植入上孔底部膜表面，从而实现了动态、非标记的实时监控细胞迁移。
同理在上孔基部膜上侧包被不同的基质层，可用于检测癌细胞侵袭。
该xCELLigence包含6X16的检测孔，可同步检测多达96组样品，与xCELLigenc-RTCES系统结合还可同步检测细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学指标。
A B C图：xCELLigence（RT-CIM）对非小细胞肺癌细胞株A549迁移运动的实时监测A：用于检测细胞迁移与侵袭的实时细胞分析系统xCELLigence（RT-CIM）B：基于Boyden Chamber原理的整合细胞阻抗传感技术的检测板。
上室板中的细胞向含趋化因子的下室板定向迁移过程中，内置的阻抗传感器实时纪录细胞的运动过程。
C：A549细胞的细胞迁移动态曲线绿色：无血清诱导对照；红色：血清成分诱导对照组表：几种细胞运动检测方法的比较三、细胞微电子芯片检测技术（xCELLIigence）1.原理简述xCELLigence细胞实时分析系统是基于检测电子传感器阻抗变化以反映细胞生理状态的新型细胞分析系统，其系统的核心是把微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞检测板的底部或细胞浸润迁移板的微孔膜。
微电子芯片测定的电阻抗即反映了细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁程度等一系列生理状态。
图：基于电子阻抗原理的高通量细胞芯片技术示意图A:细胞检测板底部的微电子细胞传感器用于检测阻抗变化B:基线阻抗纪录了检测板加入细胞之前的状况C:阻抗的变化放映了细胞生长、增殖、迁移等生理状态细胞指数(CI))是基于阻抗和细胞状态（包括贴壁细胞数量和贴壁状态）之间的对应关系，转化的一个指数参数，用以定量和比较细胞的真实状态。
CI值具有以下几个特点：◆当不存在细胞或者细胞没有很好贴壁在电极上，细胞指数为零。
◆在相同的生理条件下，贴附在此孔电极表面的细胞越多细胞指数越大。
细胞指数可以用来定量检测孔里存在的细胞数量。
◆细胞状态的变化，比如细胞形态，细胞贴附或者细胞生长都会导致细胞指数的变化。
基于微电子阻抗传感技术的xCELLigence细胞实时分析系统具有免标记、实时、定量、自动化等诸多优势。
具体表现为：◆高信息量：可连续检测生物反应的全过程，提供大量重要的动态反应信息。
◆无标记：分析无需昂贵的标记或报告。
◆无创伤：电子检测不会干扰细胞生长和分析。
◆高准确度和精确度: 定量衡量细胞生长，提供高于2个数量级的动态范围，孔对孔CV通常低于5％。
◆自动实时检测：整个实验过程自动收集数据，实时分析，大大改善仅仅在最终点分析的结果。
◆灵活性：独特的设计允许自定义分析项目，提高实验室的效率。
◆易操作：用户友好的软件，简单直接的安装，简化培训和操作。
◆系统整合：微孔感应设备可与已有的滴定板设备配套使用。
活细胞品质控制：在培养孔中检测细胞质量。
xCELLigence细胞实时分析系统包括RT-CIM™和RT-CES®两个系列：细胞迁移与侵袭性监控分析系统，动态细胞高通量功能检测系统2.细胞迁移与侵袭性监控分析系统xCELLIigence/RT-CIMxCELLIigence/RT-CIM的检测板由上室板和下室板组成。
上室板微孔底部具微孔膜，其下表面整合了微电子生物传感器。
下室板则作为细胞培养基的容器。
当上室板中的细胞通过微孔发生迁移时就可被生物传感器检测到。
通过系统测量的阻抗得到的指数，反映迁移细胞的数量。
图：装配一体的上室板和下室板以及上、下室之间的带电极的微孔（8um）膜3.动态细胞高通量功能检测系统xCELLIigence/RT-CES图：动态细胞高通量功能检测系统的检测板：16孔板，96孔板以及微孔底部金电极4.xCELLIigence应用领域与已发表论文目录细胞侵袭和迁移细胞增殖细胞质控化合物介导的细胞毒性细胞介导的细胞毒性细胞贴壁和伸展受体介导的信号传导功能性监测GPCR信号的功能监测IgE受体功能屏障功能病毒定量已发表的参考论文（略）/Literature/index.htm四、应用实例1.乳腺癌细胞株（MCF7）的迁移力动力学检测乳腺癌细胞株（MCF7）上室孔含5000个细胞/孔，无血清饥饿6小时，下室孔含10%血清。
2.某种趋化因子不同的浓度梯度对破骨细胞迁移的影响上室孔含成骨细胞10000个细胞/孔；底部微孔膜包被2小时，下室孔培养液含不同浓度的BMP趋化因子，无血清诱导。
3.小鼠某种肿瘤细胞迁移能力Control为野生型小鼠乳腺肿瘤细胞；Mutant为某基因敲除缺陷型乳腺肿瘤细胞上室孔含乳腺肿瘤10000个细胞/孔；底部微孔膜Fibronectin包被2小时，下室孔培养液含不同浓度的BMP趋化因子，无血清诱导。
4.某种细胞的分化功能检测Control为野生型小鼠神经干细胞；Mutant为某基因敲除缺陷型神经干细胞检测芯片预先PDL＋Laminin双层包被处理，神经元分化24小时后加入2%血清诱导胶质细胞分化。
5.某抗肿瘤药物抑制乳腺癌细胞（MCF7）的动力学分析低，中，高三种浓度长春瑞滨（NVB）作用于乳腺癌细胞（MCF7）的动力学效应。
6.细胞增殖的动力学图谱指导天然药物活性成分分离的运用A: 某天然药物经阴离子交换柱分离获得的非极性，阳离子混合组分与阴离子组；B,C ：阴离子组分(B)与经超滤分离的大于3KD 组分(C)均不能呈现特征性细胞指纹图谱； D:非极性，阳离子混合组分与超滤小于3KD 组分呈现与天然药物类似的特征性“细胞指纹图谱7. 细胞增殖的动力学图谱预测天然药物细胞学功能Anionic fraction Non-polar cationic fractionAnion -exchangecolumnANon-polar, cation (DEAEchromatography )lower 3 Kd (Super filtration)Anionic fraction Serum-free fractionBOver 3 Kd fraction Serum-free fractionABA: 前期研究筛选的某天然药材特征性细胞图谱；B：抗细胞有丝分裂的6种已知小分子化合物呈现的特征性图谱（即该类化合物的细胞功能标识图谱）五、技术服务1.服务内容●细胞趋化和迁移检测●肿瘤细胞迁移和侵袭●抗肿瘤转移药物筛选●实时动态细胞功能检测（增殖、凋亡、粘附等）●天然药物生物活性成份筛选与功能预测与评估2.试验流程●客户提供服务要求与实验预约；●与客户沟通后确定试验方案；●方案实施与实验操作●实验结果分析，提供检测报告。
3.服务价格4.受检样品与细胞质控要求1)客户提供测试样品如化合物、趋化因子、生长因子、天然药物等，并不提供测试样品的理化性质，如质量、浓度、分子量、溶解度等。
