1.1 DNA重组技术的基本工具
（一）思考与探究（P7）
1．限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：（略）你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？
答： 2和7；4和8 ；3和6；1 和 5；
2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？
提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。
细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。
生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露DNA分子。
是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。
这些供目的基因插入的限制酶的切点，还必需是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。
（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA 的复制而同步复制。
（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
（二）寻根问底
1.根据你所掌握的知识，你能推测出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？（P4）
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病源物的侵害。
限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，限制酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
2.DNA连接酶与DNA聚会酶是一回事吗？为什么？（P6）
答：不是一回事。
基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。
另一种是从T4噬菌体中分离得到的，称之为T4连接酶。
这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。
DNA连接酶和DNA聚会酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚会酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA 连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA 双链上的两个缺口同时连接起来，因此它不需要模板。
此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。
（三）模拟制作讨论题（P7）
1.你模拟插入的DNA片段能称得上一个基团吗？
提示：不能。
因为一般基因有上千个碱基对。
2.如果你操作失误，碱基不能配对。
可能是什么原因造成的？
提示：可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。
（四）旁栏思考题（P6）
想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？
提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因及对受体无害等。
