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Mut Express同源重组法快速定点突变技术

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Mut Express同源重组法快速定点突变技术

Mut Express同源重组法快速定点突变技术

将上述反应体系置于37℃恒温反应1～2小时。如4.3扩增特异，产物条带单一， DpnI消化产物无需纯化，可直接用于后续重组反应。如扩增不特异，DpnI消化结束 后应胶回收纯化目标扩增产物。 ４．５ 进行重组反应 正反向扩增引物5’端包含完全反向互补的一段序列，因此在ExnaseTM II催化下扩增 产物5’末端和3’末端可以发生同源重组，完成扩增产物环化过程。于冰水浴中，将 下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘 在管壁，请务必通过短暂离心使其沉入管底。 ddH2O 5 × CE II Buffer DpnI消化产物 ExnaseTM II DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
５／不连续双碱基定点突变实验方案 （两突变位点相距超过５０ ｂｐ）
５．１ 实验流程概览 （图三） 1).引物设计(参见5.2)； 2).目标质粒分段扩增(图三，I，参见5.3)； 3).扩增产物DpnI消化，去除甲基化模板质粒(图三，I，参见5.4)； 4).进行重组反应(图三，II，参见5.5)； 5).反应产物转化、涂板、克隆鉴定(图三，III，参见5.6)；
Super-Fidelity DNA Polymerase (1 U/μl)
DpnI (10 U/μl) 5 × CE II Buffer ExnaseTM II
３／贮藏条件
本产品应置于-20℃储存。
４／单碱基（或连续多碱基）定点突变实验方案
４．１ 实验流程概览 （图一） 1). 引物设计 (参见4.2)； 2). 目标质粒扩增 (图一，I，参见4.3)； 3). 扩增产物DpnI消化，去除甲基化模板质粒 (图一，I，参见4.4)； 4). 进行重组反应 (图一，II，参见4.5)； 5). 反应产物转化、涂板、克隆鉴定 (图一，III，参见4.6)。

Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明

Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明

咨询电话：4006663029Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明一、产品概述本试剂盒是Fasta快速定点突变试剂盒的升级版，采用同源重组的原理，用PCR手段将目标质粒从待突变位点反向扩增，其产物经重组环化后直接转化即可完成定点突变。

与原Fasta试剂盒相比具有以下优势：1.升级了原有的高保真酶，采用新型的2×Fasta-II Mix高保真扩增体系，扩增速度比原有酶快了一倍（15s/kb）且降低了扩增过程中引入新突变的可能性。

2.酶、buffer、dNTP均整合到2×Fasta-II Mix里，PCR体系只需要加引物和模板。

3.长片段扩增能力卓越，可以广泛适用于长度不超过20kb的任何质粒扩增。

4.省略了Dpn酶消化的步骤，节省1h时间。

PCR扩增产物对模板的数量优势已足够保证突变成功率。

5.大多数情况下PCR产物无需纯化即可直接做下一步重组反应。

由于使用高效的同源重组反应替代了传统的退火成环或连接成环，因此使用本试剂盒进行定点突变不但引物设计灵活，还可以同时突变距离较远的两个点。

二、产品组成（15次反应）2×Fasta-II Mix：375ul5×Fasta-II Recombination Buffer：30ulFasta-II Recombination Enzyme:15ul三、贮藏与保质期本产品应置于-20℃储存，保质期一年。

四、单碱基或连续多碱基定点突变实验方案图1实验流程概况4.1引物设计向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变，只需设计一对引物将质粒进行反向PCR扩增即可。

引物设计原则为：(1)正、反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，GC含量40-60%为佳。

(2)各引物非互补区域长度至少为15bp。

(3)待突变位点至引物3’端区域Tm值高于60℃为佳。

(4)需要引入突变的位点首选使其包含在互补区域内，即两条引物均引入点突变。

蛋白质工程的定点突变

蛋白质工程的定点突变

20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。

可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。

这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。

定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。

寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。

为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。

如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。

单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。

在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。

由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。

由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。

环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。

待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。

RedET同源重组技术概述

RedET同源重组技术概述

RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。

该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。

本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。

RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。

酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。

在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。

RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。

该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。

RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。

然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。

最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。

RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。

首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。

其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。

此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。

然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。

首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。

其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。

此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。

生物技术制药期末复习

生物技术制药期末复习

名词解释1.Cassette mutagenesis:盒式突变（cassette mutagenesis)，又称片段取代法（DNA fragment replacement)，利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段2.DNA shuffling:DNA改组(DNA shuffling)将DNA拆散后重排, 一种模仿自然进化的体外DNA重组的新技术. 这种方法不仅可以对一种基因人为进化, 而且可以将具有结构同源性的几种基因进行重组, 共同进化出一种新的蛋白质. 在实验室中把DNA改组与有效的筛选方法结合起来可为多领域的应用快速进化基因.3. Yeast centromeric plasmid：酵母着丝粒载体，一种在YRp质粒结构基础上增加了一段来自酵母染色体着丝粒DNA片段的载体4.yeast artificial chromosome酵母人工染色体型载体，具有酵母染色体的主要构件包括酵母染色体自主复制序列(ARS)、着丝粒序列(CEN)和端粒序列(TEL)。

5. Inclusion Bodies6. Refolding：7.Interferon：干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白8.Interleukin:白细胞介素(interleukin，IL),简称白介素:是由多种细胞分泌的一类具有免疫调节活性的细胞因子。

这类物质主要是由白细胞合成，且主要介导白细胞间的相互作用。

一类低相对分子量的蛋白多肽，通常由一个或几个基因表达合成9. Antisense technology：反义技术(antisense technology)是采用反义核酸分子(人工合成或生物合成的DNA或RNA，它们能与DNA、RNA互补)抑制、封闭或破坏与疾病发生相关的靶基因表达的一种手段10.siRNA :RNAi是一个依赖ATP的过程，在此过程中，dsRNA (外源或内生)首先被降解为具3’端有2～3nt突出、长21～23bp 的小分子双链RNA，这种RNA称为小干扰RNA(siRNA)。

一步PCR法对拟南芥ATPK64基因的快速定点突变

一步PCR法对拟南芥ATPK64基因的快速定点突变
一
类方 法 ， 中普 遍 使 用 的 方法 有 重 叠 延 伸 法 和 大 其
引物 法［ ］ ３ 。近 年 来 国 外 研 究 者 普 遍 使 用 由 美 国
Ｓｒｔｇ ｎ 公司 开发 的 Ｑｕｃ Ｃ ａ ｇ Ｔ 定 点 突 变试 ｔ ａｅ ｅ ａ ｉ ｈ ｎ ｅＭ ｋ
剂盒 进行快 速 定 点 突变 。其 基 本 原 理 是 ， 用 完 全 利 互 补 的引物 Ｐ Ｒ扩增 含突变 碱 基 的整 个 载体 ， Ｃ 然后 利用 Ｄｐ 工酶 切 消 化 甲基 化 的 模 板 ＤＮＡ （ 通 的 ｎ 普 大肠杆 菌含 有 Ｄ ＮＡ 甲基 化 酶 ， 因此 提 取 出 的作 为 模 板 的 ＤＮＡ 都 是 甲基 化 的 ） 由于 得 到 的 Ｐ Ｒ产 ， Ｃ 物 线性 载体 不含 甲基 化位 点 ， 而不 被 Ｄｐ 工酶消 因 ｎ 化 。扩 增得 到 的含突 变基 因 的线 性 载体直 接转 化 大 由于可直接 利 用表 达载 体 作为 Ｐ Ｒ模 板 ， Ｃ 因此 通 过
笔 者 尝试 改 进 了引物 的 设计 方 案 ， 用 部 分互 １ Ｄ Ａ的提取 利 ． ２ Ｎ
件加 以改进 ， 优化 了整 个定 点突 变过程 ， 拟南 芥 的 法 ［ 将 。质粒 ＤＮ 的提 取采 用 碱裂法 ［ Ａ 。
收稿 日期 ：０ ７０ —１ ２ ０ —５２ ＊ 国家 自然科学基金项 目（０ ０ ０ １ 和辽东学院科研基金项 目（ ０ ６Ｚ １ 资助 ３５０１） ２ ０一 ｌ ） ．
Ｆｅ ． ２ ０ １ ～ ２ ｂ ０ ８， ９ １
一
步 Ｐ 法对拟南芥 Ａ Ｐ ６ ＣＲ Ｔ Ｋ ４基 因 的 快 速 定 点 突 变
王宏梅Ｄ 赵心清。
（ 东 学院 医学 院 ， 东 １８ ０ ； 大连 理 工 大 学 生 物科 学 与 工 程 系 ， ”辽 丹 １ ０ ２ 大连 １６ ２ ） １ ０４

天根 快速定点突变试剂盒说明书

l primers (5 μM, each) FDM competent cells
KM101 （20 rxn）
30 μl 200 μl 20 μl 40 μl 80 μl 20×50 μl
储存条件
收到本产品后， 请立即将FDM competent cells置于-70℃条件下保存，试剂盒其他组分 置于-20℃条件下保存。感受态细胞可在-70℃条件下保存3个月，试剂盒其他组分可在-20℃ 条件下保存1年。
50 μl 体系 2 μl 4 μl 10 μl 1.5 μl
至50 μl
终浓度 0.2 ng/μl 400 nM
1× 0.075 U/μl
－
4、将实验组及对照组按照如下PCR反应程序进行PCR反应。
PCR反应程序： 注：下表中PCR程序按照对照组实验条件设置，客户可根据自身实验进行相应调整。
阶段 预变性
■ PCR、RT-PCR系列 ■ 核酸DNA、RNA分离纯化系列 ■ DNA分子量标准 ■ 克隆载体、感受态细胞 ■ 细胞生物学产品 ■ 蛋白分子量标准 ■ 蛋白质染色、检测及定量相关产品
版本号: KM131204
Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD
PCR反应
补充延伸
循环 1×
18×
1×
温度 95℃ 94℃ 55℃ 68℃ 68℃
时间 2 min 20 sec 10 sec 2.5 min 5 min
二、质粒模板的消化
1、按照下表所述配制酶切体系： 组成成分
PCR产物 Dpn I restriction enzyme （20 U/μl） Total Volume 2、充分混匀后，将上述酶切体系于37℃条件下消化1 h。

Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明

咨询电话：4006663029Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明一、产品概述本试剂盒是Fasta快速定点突变试剂盒的升级版，采用同源重组的原理，用PCR手段将目标质粒从待突变位点反向扩增，其产物经重组环化后直接转化即可完成定点突变。

与原Fasta试剂盒相比具有以下优势：1.升级了原有的高保真酶，采用新型的2×Fasta-II Mix高保真扩增体系，扩增速度比原有酶快了一倍（15s/kb）且降低了扩增过程中引入新突变的可能性。

2.酶、buffer、dNTP均整合到2×Fasta-II Mix里，PCR体系只需要加引物和模板。

3.长片段扩增能力卓越，可以广泛适用于长度不超过20kb的任何质粒扩增。

4.省略了Dpn酶消化的步骤，节省1h时间。

PCR扩增产物对模板的数量优势已足够保证突变成功率。

5.大多数情况下PCR产物无需纯化即可直接做下一步重组反应。

由于使用高效的同源重组反应替代了传统的退火成环或连接成环，因此使用本试剂盒进行定点突变不但引物设计灵活，还可以同时突变距离较远的两个点。

二、产品组成（15次反应）2×Fasta-II Mix：375ul5×Fasta-II Recombination Buffer：30ulFasta-II Recombination Enzyme:15ul三、贮藏与保质期本产品应置于-20℃储存，保质期一年。

四、单碱基或连续多碱基定点突变实验方案图1实验流程概况4.1引物设计向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变，只需设计一对引物将质粒进行反向PCR扩增即可。

引物设计原则为：(1)正、反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，GC含量40-60%为佳。

(2)各引物非互补区域长度至少为15bp。

(3)待突变位点至引物3’端区域Tm值高于60℃为佳。

(4)需要引入突变的位点首选使其包含在互补区域内，即两条引物均引入点突变。

体外定点突变PCR法构建abl T315I突变的重组质粒标准品

体外定点突变PCR法构建abl T315I突变的重组质粒标准品石淙;张长林;简正伟;江梅;闻芳;万腊根【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2013(031)002【摘要】目的利用聚合酶链反应(PCR)定点突变技术构建含人类abl基因第6号外显子片段的野生型及含T315I突变型重组质粒,作为检测abl T315I基因突变的阳性对照和阴性对照标准品.方法先设计包括突变位点的两对引物,以健康人外周血基因组DNA为模板,扩增获得野生型和突变型abl基因第6号外显子片段,将其插入pSG5M-flag载体质粒中,并将所获重组质粒分别进行酶切与测序鉴定,通过紫外分光光度计检测标本的浓度和纯度.结果 DNA测序表明在预期位点上发生突变,abl 基因第315位氨基酸密码子由苏氨酸(Thr)残基突变为异亮氨酸(Ile)残基,所构建abl基因野生型和突变型质粒,经酶切和测序鉴定与目的片段完全一致.结论 PCR技术诱导定点突变准确、高效.所构建含野生型和T315I突变的abl基因重组质粒,可为检测abl基因T315I突变提供阴性和阳性对照以及质控品,同时也为T315I突变的相关研究奠定了基础.【总页数】4页(P111-114)【作者】石淙;张长林;简正伟;江梅;闻芳;万腊根【作者单位】南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R733.72;Q343.1+3【相关文献】1.PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究 [J], 杨云霞;熊文碧;冯云;王伯瑶2.采用定点突变PCR构建c-kit D816V突变的重组质粒标准品 [J], 徐芬;张长林;简正伟;江梅;万腊根3.用PCR体外定点突变技术诱导霍乱毒素A亚基突变体的构建 [J], 司艺玲;苏堤;李付广4.利用PCR介导的基因定点突变技术构建L.plantarum P-8亚油酸异构酶突变体[J], 贾丽;赵国芬;李晨曦;张和平;包秋华5.利用PCR介导的基因定点突变技术构建L.plantarum P-8亚油酸异构酶突变体[J], 贾丽;赵国芬;李晨曦;张和平;包秋华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

酶突变基因定向选择

1引言1.1酶突变基因定向选择简介酶突变基因的定向选择是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所设定的进化方向对突变的基因进行选择，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的过程。

1.2突变技术酶基因体外随机突变的技术有多种多样，常用的有易错PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术等。

1.2.1易错PCR技术易错PCR是从酶的单一基因出发，改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应（PCR-polymerase chain reaction），使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

聚合酶链反应技术的基本过程包括：双链DNA的变性、引物与单链DNA退火结合、引物延伸三个步骤。

三个步骤反复进行，一般经过30次循环，可以使目的基因扩增几百万倍。

然后通过改变条件，增加碱基配对错误出现频率，即为易错PCR技术。

1.2.2 DNA重排技术DNA重排技术即DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程1.2.3 基因家族重排技术基因家族重排是从基因家族的若干同源基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。

2酶基因突变的定向选择通过上述易错PCR、DNA重排或基因家族重排等技术对酶基因进行体外随机突变，可以获得丰富多样的突变基因。

然而由于采用随机突变，所获得的基因大多数是负突变或中性突变，只有少数是正突变。

为此需要在特定环境条件下进行定向选择，以便排除众多的无效突变，把具有新催化特性的酶突变基因筛选出来。

要从众多的突变基因中将人们所需的突变基因筛选出来，首先要通过DNA重组技术将随机突变获得的各种突变基因与适宜的载体进行重组，获得重组载体；在通过细胞转化等方法将重组载体转入适宜的细胞或进行体外包装成为有感染活性的重组λ噬菌体，形成突变基因文库；然后采用各种高通量的筛选技术，在人工控制条件的特定环境中对突变基因进行筛选，从突变基因文库中筛选得到所需的突变基因。

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5 × SF Buffer (with 10 mM MgSO4) 25 mM MgSO4 dNTP Mix (10 mM each) Phanta
TM
1.25 ml 1.25 ml 40 μl 40 μl 20 μl 40 μl 20 μl
1.25 ml 1.25 ml 100 μl 100 μl 50 μl 100 μl 50 μl
Super-Fidelity DNA Polymerase (1 U/μl)
DpnI (10 U/μl) 5 × CE II Buffer ExnaseTM II
３／贮藏条件
本产品应置于-20℃储存。
４／单碱基（或连续多碱基）定点突变实验方案
４．１ 实验流程概览 （图一） 1). 引物设计 (参见4.2)； 2). 目标质粒扩增 (图一，I，参见4.3)； 3). 扩增产物DpnI消化，去除甲基化模板质粒 (图一，I，参见4.4)； 4). 进行重组反应 (图一，II，参见4.5)； 5). 反应产物转化、涂板、克隆鉴定 (图一，III，参见4.6)。


Vazyme biotech co., ltd.
使用说明书
Version 3.2
目 录 Catalog
１／产品概要
Mut ExpressTM II Fast Mutagenesis Kit是基于ClonExpressTM快速克隆技术的定点突变系统 。使用本试剂盒，目标质粒扩增产物经DpnI消化、ClonExpressTM重组环化后直接进行转 化即可完成定点突变。该试剂盒由两个模块组成：PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase扩增模块和ClonExpressTM快速克隆模块。PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性。PhantaTM卓越的长 片段扩增能力，广泛适用于长度小于20 kb的任何质粒扩增。ClonExpressTM 快速克隆系统 利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应。因此使用Mut ExpressTM II 定点突变试 剂盒进行DNA定点突变时，引物设计更加灵活，且扩增反应不再需要以线性方式进行，极 大减少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的彻底降解。ClonExpressTM技术可以高效完 成两个PCR产物的无缝拼接，因此该试剂盒还能以单次扩增的方式对目标质粒上不连续的 两个位点同时进行突变。和上一代产品相比，Mut ExpressTM II Fast Mutagenesis Kit 配有 专门针对单碱基、不连续双碱基定点突变而优化的重组酶ExnaseTM II。此外，如扩增产物 特异，其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应缓冲液、 快捷的操作流程以及极高的成功率，使得Mut ExpressTM II Fast Mutagenesis Kit成为DNA 定点突变首选试剂盒。 产品优点 - PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase提供突变率最低的高保真PCR - PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase卓越的长片段扩增能力，广泛适用于20 kb以内 的任何质粒扩增
将上述反应体系置于37℃恒温反应1～2小时。如4.3扩增特异，产物条带单一， DpnI消化产物无需纯化，可直接用于后续重组反应。如扩增不特异，DpnI消化结束 后应胶回收纯化目标扩增产物。 ４．５ 进行重组反应 正反向扩增引物5’端包含完全反向互补的一段序列，因此在ExnaseTM II催化下扩增 产物5’末端和3’末端可以发生同源重组，完成扩增产物环化过程。于冰水浴中，将 下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘 在管壁，请务必通过短暂离心使其沉入管底。 ddH2O 5 × CE II Buffer DpnI消化产物 ExnaseTM II DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
注意： 我们推荐您使用转化效率>108 cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率<108 cfu/μg (例如用 CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107 cfu/μg之间)，请将培养菌液在5,000 rpm离心3 min 收集菌体，用100 μl LB培养基重悬后全部涂板。
反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测。如目标质粒正确扩增，则可进行 下步实验。 ４．４ 扩增产物ＤｐｎＩ消化，去除甲基化模板质粒 因4.3扩增产物中包含原始模板质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在 进行重组环化之前进行DpnI消化。推荐 μl
图二：向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变引物设计示意图
注意：计算引物Tm值时，应计算待突变位点至引物3’端这一区域内的碱基，待突变位点至引物5’端 区域内的碱基不应参与计算。
４．３ 目标质粒扩增 使用 PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase对目标质粒进行扩增。反应各组分解冻后 请充分摇匀，使用完毕后及时放回-20℃。5 × SF Buffer请勿长时间敞口放置。为了增加 扩增特异性，反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶最后加入反应体系中。推荐反应体系 如下： ddH2O 5 × SF Buffer (with 10 mM MgSO4) 25 mM MgSO4 a dNTP Mix (10 mM each) b 模板DNA c 引物1 (10 μM) 引物2 (10 μM) PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase (1 U/μl) d Up to 50 μl 10 μl Optional 1 μl Optional 2 μl 2 μl 1 μl
产品概要 产品组成 贮藏条件 单碱基(或连续多碱基)定点突变实验方案 不连续双碱基定点突变实验方案(两突变位点相距超过50 bp) 注意事项 常见问题与解决方案
- 扩增以指数方式进行，极大减少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的彻底降解 - DpnI消除原始模板污染 - ClonExpressTM快速克隆系统高效环化PCR产物 - 扩增产物经DpnI消化后可直接用于重组反应 - 可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点 (相距超过50 bp)同时进行定点突变 应用范围 DNA定点突变 注意：如使用本品对质粒进行定点突变，请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌 (例如Top10、 DH5α、JM109)扩增原始质粒！
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体系配制完成后进行扩增反应，推荐PCR反应条件： 循环步骤 预变性a 变性a 退火b 延伸c 彻底延伸 温度 95℃ 95℃ 45℃～72℃ 72℃ 72℃ 时间 30 sec 5～10 sec 10～30 sec 15 sec/kb 5～10 min 1 30 d 循环数 1
ＤｐｎＩ消化产物最适使用量 ＝ ［０．０２ × 目标质粒碱基对数］ ｎｇ （０．０３ ｐｍｏｌ） 例如，向长度为5 kb的目标质粒引入单点突变，DpnI消化产物最适使用量应为：0.02 × 5000 = 100 ng。
注意：DNA量太多或者太少都将降低环化效率。请务必通过琼脂糖电泳预先确认DNA浓度，尽量严格 按照推荐量配制反应体系。当DpnI消化产物最适使用量计算值不足50 ng或者超过400 ng时，加入50 ng或400 ng即可。DpnI消化产物不纯化直接用于重组反应时，使用量不应超过反应总体积的1/5，即4 μl。
体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡 或者涡旋混匀)。置于３７℃反应 ３０ ｍｉｎ。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。 ４．６ 反应产物转化、涂板、克隆鉴定 取20 μl冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min 。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。加入900 μl SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。37℃摇菌45 min。取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将 平板倒置，于37℃过夜培养。

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２／产品组成
组 分 C212-01 (10 rxn) C212-02 (25 rxn)
４．２ 引物设计 向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变，只需设计一对引物将质粒进行反向PCR扩增 即可。引物设计基本原则为：正反向扩增引物5’端包含至少20 bp反向互补区域，各引 物非互补区域长度至少为20 bp。所需引入突变可以包含在互补区域内 (需要两条引物 上均引入点突变)，也可以包含在任一条引物的非互补区域 (只需在一条引物上引入点 突变)，请勿将突变位点置于引物末端。以向pUC18引入单碱基突变为例，引物设计具 体方案如图二所示。
图一：使用Ｍｕｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ ＩＩ 进行单碱基定点突变实 验流程 设计部分反向互补的引物，对原始质粒进行反向扩增 (图一，I)。扩增产物经DpnI消化(图一，I)后，进行重 组环化(图一，II)。重组产物直接进行转化即可完成 定点突变(图一，III)。

a. 对于大多数PCR反应，Mg2+最佳终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+，如有需要 ，可用 25 mM MgSO4，以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+浓度梯度。 b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。 c. 在质粒能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量，推荐≤1 ng。 d. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。可将PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl 之间进行优化，但不要超过2 U/50 μl，尤其当扩增子长度大于5 kb时。
Mut ExpressTM II