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喹诺酮类药物测定作业指导书

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ABC食品有限公司

生效日期：201-10-20 喹诺酮类药物测定作业指导书 页 码： 1/1

1．1检测方法：ELISA

1．2所用仪器、试剂

1．2．1仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

1．2．2微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

1．2．3试剂：氢氧化钠、二氯甲烷乙酸乙酯、正己烷、乙腈

1．3样本处理前需配制

1．3．1配液1：0.1M NaOH溶液 0.4g NaOH用去离子水100ml溶解

1．3．2配液2：乙腈-0.1M NaOH溶液 V乙腈：VNaOH＝ 84：16

1．3．3配液3：pH7.20.02M PB缓冲液 5.16g Na2HPO4·12H2O+0.87gNaH2PO4·2H2O

加去离子水1L溶解

1．3．4配液4：用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1稀释（1份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本复溶。

1．4样品处理

1．4．1高检测限样本

1．4．1．1称2.0±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中；

1．4．1．2加入乙腈-0.1M NaOH溶液10ml，充分上下混合10min，4000r/min以上，15℃离心10min；

1．4．1．3取上清5ml，加入5ml 0.02M PB缓冲液，再加入正己烷4ml，混合2min，4000r/min以上，15℃离心10min；

1．4．1．4去除上层正己烷，加入二氯甲烷8ml，充分混匀10min，4000r/min以上，15℃离心10min去上层，取下层有机相至干燥溶器中（清亮无杂质），50℃氮气吹干/旋转蒸发至干；

1．4．1．5用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合2min，4000r/min以上，15℃离心5min；

1．4．1．6轻吸掉上层和中间部份液体，取下层100µl，加入100µl稀释后的复溶液；

1．4．1．7取50µl用于分析。

1．4．1．8样本稀释倍数：2

1．4．2低检测限样本

1．4．2．1称2±0.05g匀浆的组织样本，加入8ml 0.02M PB缓冲液，充分上下混合振荡10min，15℃，4000r/min以上离心10min（如果上清液太浑浊需取出 2-4ml再次离心）；

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1．4．2．2取上清液50µl加入200µl已稀释好的复溶液混匀；

1．4．2．3取50µl用于分析。

1．4．2．4样本稀释倍数：20

1．5酶标免疫分析程序

1．5．1将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

1．5．2配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用（或按需量稀释）。

1．5．3按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷冻。

1．5．4编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品均需做2孔平行，并记录标准孔的样本孔所在的位置。

1．5．5加标准品/样本50µl /孔，然后加酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应1h。

1．5．6取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡10秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

1．5．7显色：每孔加入底物液A液50µl，再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。（见注意事项17.7.8）

1．5．8测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。

1．6结果判定

利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

1．7注意事项

1．7．1室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

1．7．2在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

1．7．3混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。

1．7．4反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

1．7．5将不用的微孔板放进自封袋重新密封; 标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

1．7．6不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

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1．7．7显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。

1．7．8该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化

1．8储藏条件和保质期

1．8．1储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。

1．8．2保质期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

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高效液相色谱法测定氟喹诺酮类药物

高效液相色谱法测定氟喹诺酮类药物

第󰀁󰀂

卷

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高效液相色谱法测定鱼肉中氟喹诺酮类药物的研究

高效液相色谱法测定鱼肉中氟喹诺酮类药物的研究

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高效液相色谱法测定鱼肉中氟喹诺酮类药物的研究

作者：薄怀艳 陈燕 葛翠莲 张延龙

来源：《农家科技》2017年第09期

摘 要：采用高效液相色谱—荧光法（HPLC-FLD）检测鱼肉中两种氟喹诺酮类药物。鱼肉样品经磷酸盐缓冲溶液匀浆后转入离心管，离心并提取上清液，上清液过固相萃取柱用水淋洗，济干，用流动性（乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺调pH2.4）体积比20：80）定容。通过对鱼肉样品中氟喹诺酮类药物的检测表明该方法具有准确、快速、灵敏的特点。

关键词：高效液相色谱法；氟喹诺酮类药物；残留分析；鱼肉

氟喹诺酮类药物是喹诺酮类药物的第三代产品，它代指一族人工合成的具有6-氟-4-喹诺酮环基结构的广谱杀菌性抗菌剂，对革兰氏阳性菌和阴性菌、支原体、某些厌氧菌均有效，主要通过抑制细菌DNA螺旋酶作用，阻碍DNA合成而导致细菌死亡。因具抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强等特点，目前氟喹诺酮类药物在医学和兽医学中应用广泛，但其残留可导致人体病原体的耐药性，而且有关氟喹诺酮类药物还有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药性，所以欧盟和北美等国家只批准恩诺沙星为动物专用的抗菌药了，环丙沙星已禁止在水产养殖业中使用。动物源性食品的安全性，对其残留量的检测越来越受到关注。目前，常用于氟喹诺酮类药物残留的检测方法可分为4大类：微生物法、仪器分析法、化学发光与电化学发光分析法及免疫分析法。其中仪器分析法常见的有高效液相色谱法、液-质联用分析法等；本文是用高效液相色谱-荧光法检测方法，用磷酸盐缓冲溶液作为提取液，可同时检测鱼肉中环丙沙星、恩诺沙星两种氟喹诺酮类药物，该方法操作方便快捷、节约成本，能够满足我国现行兽药残留检测分析的要求。

一、材料与方法

1.仪器与设备

高效液相色谱仪（配荧光检测器），高速匀浆均质器，离心机，天平，涡旋机，固相萃取柱，微孔滤膜。

高效液相色谱法测定石岐乳鸽中氟喹诺酮类药物残留

高效液相色谱法测定石岐乳鸽中氟喹诺酮类药物残留

石岐乳鸽是中山市著名特色小吃袁为20世纪30年代后期中山市先后从日本尧澳大利亚引进的钦麻鸽和澳洲地鸽与本地优良鸽种杂交而获得的优良品种遥石岐乳鸽在孵化后饲养22~25d袁体重达600~700g即可食用遥因其羽翼未丰袁故名乳鸽[1]遥石岐乳鸽因具有体形大尧胸肉厚尧肌肉饱满尧肉质嫩滑爽口的特点而饮誉广东省以及港澳市场遥氟喹诺酮类药物渊Fluoroquinolones袁FQNS冤是新一代广谱全合成抗菌素袁高效低毒袁价格低廉袁少量使用还具有一定的促生长作用[2]袁近年来逐渐在预防和治疗畜禽及鱼类疾病中广泛应用遥但是该类药物在动物体内代谢缓慢袁过量或不当使用易导致细菌耐药性问题袁并对中枢神经系统造成不良反应[3]遥本方法采用水饱和正己烷进行除脂袁回收效果良好袁能高效准确检测石岐乳鸽中所含氟喹诺酮类药物的残留[4-5]遥1材料与方法1.1仪器与试剂Agilent1260高效液相色谱仪袁配Agilent1260FLD检测器曰百分之一电子天平渊CP2102袁Ohaus冤曰高速分散均质机渊T-18digital袁IKA冤曰poxwar漩涡混合器渊TZL-5009袁苏州珀西瓦尔实验设备有限公司冤曰台式冷冻高速离心机渊A2316R袁上海安戈仪器有限公司冤曰固相萃取装置渊天津奥特赛思仪器有限公司冤曰多功能超纯水系统渊Spring-S20袁厦门锐思捷科学仪器有限公司冤曰pH计渊STARTER3100袁Ohaus冤遥前处理所用试剂磷酸二氢钾尧氢氧化钠尧正己烷均为分析纯袁广州化学试剂厂生产曰流动相用85%磷酸袁为色谱纯袁天津市科密欧化学试剂有限公司生产曰三乙胺袁阿拉丁试剂曰C18固相萃取小柱渊AgilentBondElut100mg袁3mL冤尧0.22滋m有机滤膜袁天津津腾实验室设备有限公司生产遥标准品由农业部环境保护科研监测所生产袁浓度均为100mg/L袁使用前用甲醇将其稀释成所需浓度的混合标准溶液遥1.2试验方法1.2.1样品提取与净化遥称取2.0g捣碎的乳鸽试样袁置于30mL匀浆杯中袁加磷酸盐缓冲溶液10mL袁5000r/min匀浆5min遥匀浆液转移到离心管中袁中速振荡5min袁5000r/min离心5min后取其上清液待用遥用磷酸盐缓冲溶液10mL清洗刀头及匀浆杯袁转入离心管袁混合均匀袁中速振荡5min袁5000r/min离心5min袁合并2次上清液袁加入15mL水饱和正己烷混合均匀袁待用[6]遥固相萃取柱依次用甲醇尧磷酸盐缓冲溶液各2mL预冲洗遥取上清液5.0mL过柱袁用1mL水淋洗袁挤干遥用1.0mL流动相洗脱袁挤干袁收集洗脱液袁经滤膜过滤后作为试样溶液袁待检测遥1.2.2色谱条件遥色谱柱院C18柱袁250mm伊4.6mm袁粒径5滋m曰流动相院0.05mol/L磷酸溶液/三乙胺-乙腈渊V颐V=82颐18冤袁使用前经微孔滤膜过滤曰流速1mL/min曰检测波长院激发波长280nm曰发射波长450nm曰柱温院25益曰进样量院10滋L曰定量方法院外标法遥2结果与分析2.1氟喹诺酮类药物标准色谱图由于待测氟喹诺酮类药物极性较低袁故选择C18柱渊250mm伊4.6mm冤作为分析色谱柱袁结合药物结构和化学性质袁按照上述色谱条件进行测定袁得到氟喹诺酮类药物标准色谱图渊图1冤遥结果表明袁氟喹诺酮类药物在15min内可实现良好分离袁且峰形对称袁满足检测要求遥2.2标准曲线尧线性范围及检出限将不含待测药物的鸽肉空白基质溶液稀释标准品分别配制成为50尧75尧100尧500滋g/kg的氟喹诺酮药物混合标准溶液袁过0.45滋m滤膜后袁按上述色谱条件进行测定遥摘要研究了石岐乳鸽中环丙沙星尧达氟沙星尧沙拉沙星和恩诺沙星4种氟喹诺酮类药物残留量的高效液相色谱测定方法遥采用磷酸缓冲液提取袁水饱和正己烷除脂袁C18固相萃取小柱净化分离袁LC-FLD检测器检测遥结果表明袁氟喹诺酮类药在15min内获得良好的分离袁线性相关系数r2为0.9995~0.9996袁检测限可达0.02mg/kg袁回收率范围为74.2%~93.2%遥该方法净化效果良好袁操作简便遥关键词高效液相色谱法曰石岐乳鸽曰氟喹诺酮类药物中图分类号O657.7+2文献标识码A文章编号1007-5739渊2018冤11-0241-02DeterminationofFluoroquinolonesResiduesinShiqiPigeonbyHPLCMAShi-zhuCHENNanLIXiao-pengZHOUJia-chengLIANGJin-tianGAOWen-binLINJun-jie渊SanxiangTownAgriculturalServiceCenterinZhongshanCityofGuangdongProvince渊InspectionandTestingStationforAgriculturalProducts冤袁ZhongshanGuangdong528463冤AbstractAHPLCmethodforthedeterminationof4kindsoffluoroquinolonesinShiqipigeonssuchasciprofloxacin袁danofloxacin袁sarafloxacinandenrofloxacinwasstudied袁extractingbyphosphoricacidbuffersolution袁degreasingbywatersaturatedhexane袁purifingandseparatingbyC18solidphaseextractioncolumn袁detectingbyLC-FLDdetector.Theresultsshowedthatthefluoroquinoloneswereseparatedwellin15min袁thelinearcorr-elationcoefficientr2was0.9995-0.9996袁thedetectionlimitwas0.02mg/kg袁andtherecoveryratewas74.2%-93.2%.Thismethodhavegoodpurifi-cationeffectandsimpleoperation.KeywordsHPLC曰Shiqipigeon曰fluoroquinolones高效液相色谱法测定石岐乳鸽中氟喹诺酮类药物残留马世柱陈楠黎小鹏周嘉诚梁锦填高文彬林俊杰渊广东省中山市三乡镇农业服务中心渊农产品检验检测站冤袁广东中山528463冤

探讨喹诺酮类药物的不良反应情况及临床用药指导

探讨喹诺酮类药物的不良反应情况及临床用药指导

·147·中国现代药物应用2017年4月第11卷第7期　Chin J Mod Drug Appl, Apr 2017, Vol. 11, No. 7

3　讨论

随着2型糖尿病疾病进展, B细胞功能进一步降低, 传

统治疗中口服胰岛素或降糖药方式无法逆转B细胞功能, 很

容易出现血糖控制不稳、低血糖风险增加、耐受性差等问题［6, 7］。尤其是对老年糖尿病患者来说, 临床用药必须考虑到

安全性与有效性。老年糖尿病患者自身耐受性较低、对低血

糖感应差、体重管理困难, 且需要联合服用多种降糖药物,

很容易发生药物不良反应［8-11］。格列奈类药物以及磺脲类药

物很容易导致低血糖事件, 糖苷类药物容易导致餐后血糖水

平上升, 还会出现排气限制、腹胀等情况, 双胍类药物容易

增加患者乳酸中毒危险性［12, 13］。现阶段, 逆转或延缓糖尿病

病程是新药研究的重点, 以肠促胰岛素为基础的降糖药物一

经应用, 便起到了良好的降糖效果以及降糖外益处, 受到了

社会各界的广泛关注。磷酸西格列汀属于二肽基肽酶Ⅳ抑制

剂, 其能有效提升肠促胰岛素水平, 并通过葡萄糖依赖的方

式有效释放胰岛素, 并控制餐后胰高糖水平, 进而全面达到

降糖效果［14］。西格列汀是一种高选择性药物, 1次/d, 常规

100 mg剂量, 就能维持有机体中24 h肠促胰岛素水平。相关

研究资料指出, 单独应用西格列汀不会产生低血糖、水钠潴

留、体重增加等问题。79%的药物会通过肾脏排出, 药物与

肝脏同工酶之间的相互作用非常少［3］。通过本文研究提示口

服格列本脲联合磷酸西格列汀治疗老年糖尿病的安全性与有

效性。

综上所述, 口服格列本脲联合磷酸西格列汀治疗老年糖

尿病效果显著, 能有效改善患者血糖水平, 安全可靠, 值得

临床推广。

参考文献

［1］ 李静. 关于降低糖尿病发病率措施的几点思考. 中国医药指南, 表2　两组血糖水平比较( x-±s)

组别例数糖化血红蛋白(%)空腹血糖(mmol/L)餐后2 h血糖(mmol/L)对照组306.7±1.79.4±1.516.2±2.2观察组30 5.1±1.1a 6.1±1.2a 9.1±1.9at4.3289.40913.378P<0.05<0.05<0.05