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激光生物学报ACTA LASER BIOLOGY SINICAVol. 32 No. 4Aug . 2023第32卷第4期2023年8月收稿日期：2023-05-05；修回日期：2023-05-29。
基金项目：湖南省研究生科研创新项目（QL 20210136）；2021年湖南省企业科技特派员项目（2021GK 5015）；湖南省自然科学基金面上项目（2021JJ 30453）；国家自然科学基金面上项目（81872256）。
作者简介：李志伟，博士研究生。
∗ 通信作者：李立民，讲师，主要从事生物材料与医用电子学方面的研究。
E-mail: fblwlee@ 。
功能化氧化石墨烯携带PD -L1 siRNA 抑制肝癌细胞的恶性生物学行为李志伟a ，单丽红a ，刘曦冉a ，闵 洋a ，丁小凤a ，李立民b*（湖南师范大学 a. 生命科学学院基因功能与调控研究室；b. 工程与设计学院，长沙 410081）摘 要：程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L 1）信号通路主要参与免疫负调控作用，且在许多类型的肿瘤的恶性发展中具有关键作用。
PD-L 1的高表达可促进肝细胞癌（HCC ）的侵袭，提高肿瘤复发的风险。
另外，PD-L 1常作为免疫检查点的阻断靶点，主要通过单抗将其中和，引发抗肿瘤免疫反应。
因此，PD-L 1是HCC 免疫治疗中极具潜力的靶点之一。
本文主要探究纳米级功能化氧化石墨烯（GO-PEI-PEG ）携带PD-L1 siRNA 对肝癌细胞的恶性生物学行为的影响。
研究结果显示，将GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA 转染至MHCC 97H 细胞后，细胞的增殖和迁移均被抑制，细胞周期阻滞在G 1期，且细胞凋亡的数目增多。
进一步研究发现，GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA 对MHCC 97H 细胞的抑制作用是通过阻碍AKT 信号通路激活实现的。
这些试验结果表明，GO-PEI-PEG 具备优秀的递送性能，携带PD-L1 siRNA 可有效干扰PD-L 1表达，进而抑制肝癌细胞的恶性生物学行为，这为治疗HCC 提供了更安全、有效的递送新策略。
石墨烯在生物医学领域的特性及应用简介石墨烯是一种由碳原子形成的单层薄片，具有独特的二维结构和特殊的物理化学性质。
近年来，人们对石墨烯在生物医学领域的应用给予了广泛的关注和研究。
石墨烯具有优异的导电性、热传导性、力学性能和光学性质，同时具备良好的生物相容性和生物活性，从而为生物医学领域的研究和应用提供了新的可能性。
特性1. 优异的导电性和热传导性石墨烯是一种高电导率材料，远远优于传统的金属和半导体材料，具有极高的电子迁移率。
其优异的导电性和热传导性使得石墨烯在生物传感器、电极材料和生物电子学等领域具有广泛的应用前景。
2. 高强度和柔韧性石墨烯具有出色的力学性能，其强度超过任何已知材料。
同时，石墨烯的柔韧性使其成为可拉伸的材料，并且能够适应生物组织的形态和运动。
这为石墨烯在仿生材料、组织工程和生物医学传感器等领域的应用提供了可能性。
3. 超高比表面积石墨烯的二维结构使其具有极高的比表面积，有利于吸附和储存分子。
这为石墨烯在药物传输、分子探测和生物分离等方面的应用提供了条件。
4. 良好的生物相容性和生物活性石墨烯具有良好的生物相容性和生物活性，能够与细胞和生物体相互作用，并且不会引发明显的细胞毒性。
这使得石墨烯在生物医学领域的应用得以实现。
应用1. 生物传感器石墨烯能够通过电荷传递、表面增强拉曼散射和发射光谱等方式，实现对生物分子的高灵敏度和高选择性检测。
因此，石墨烯在生物传感器和生物成像方面的应用具有巨大的潜力，可以用于早期癌症检测、蛋白质检测和DNA测序等。
2. 组织工程石墨烯作为一种材料支架，可用于促进细胞增殖、定向细胞分化和组织修复。
它的高强度和柔韧性使其成为组织工程领域的理想候选材料，可以用于修复和再生骨组织、神经组织和心血管组织等。
3. 药物传输和治疗石墨烯可以用作药物传递的载体，并通过调整其形态和表面性质来实现药物的控释和靶向输送。
此外，石墨烯还可以通过其独特的光热性质，实现光热联合治疗，为癌症治疗提供新的策略。
石墨烯对细胞生长和分化的影响研究石墨烯是一种由碳原子构成的六元环的平面晶体。
它的结构分为单层和多层，是一种具有独特物理和化学性质的材料，具有高导电性、高导热性、高强度和高透明度等特性。
石墨烯已经成为了材料科学和化学领域的研究热点，其在生物领域的研究也引起了广泛关注。
近年来，越来越多的研究表明，石墨烯对于细胞生长和分化有着积极的影响。
首先，石墨烯可以促进细胞增殖。
一些研究表明，将石墨烯纳米片添加到培养基中，可以显著促进细胞增殖。
其中，石墨烯纳米片能够通过增加细胞外基质蛋白质的表达和调节细胞内信号通路来促进细胞增殖。
此外，由于石墨烯具有出色的生物相容性和低毒性，它在组织工程和再生医学等领域有着广泛的应用前景。
其次，石墨烯可以促进细胞分化。
有研究表明，将石墨烯添加到干细胞培养基中，可以显著促进干细胞向神经细胞、肝细胞等细胞类型的分化。
这主要是由于石墨烯能够模拟生物细胞的生理和生化环境，提高细胞的分化率和分化质量。
同时，石墨烯还可以通过调控细胞内信号和代谢途径等机制来促进细胞分化。
最后，石墨烯还可以促进细胞黏附。
细胞黏附是细胞与基质之间相互作用的重要过程，对细胞的生存、增殖和分化等过程具有重要意义。
石墨烯具有高度的表面积和表面能，可以提供优异的细胞黏附表面，并且能够增加细胞外基质蛋白质的表达，对于细胞的黏附和迁移都有积极的促进作用。
总的来说，石墨烯对于细胞生长和分化具有积极的影响。
虽然目前石墨烯在生物领域的应用还处于起步阶段，但是随着研究的深入，其在生物医学、组织工程等领域的应用前景仍然非常广阔。
但是在应用中，还需要进一步研究石墨烯的生物相容性和毒性，以确保其在生物领域的安全应用。
氧化石墨烯的电化学性能研究氧化石墨烯是一种石墨烯的氧化物，具有独特的电化学性能，对于储能与传感器等领域具有重要的应用前景。
本文将探讨氧化石墨烯的电化学性能研究，并对其应用进行讨论。
首先，氧化石墨烯具有很高的电子迁移率和导电性能。
由于石墨烯的单层结构和π共轭等特点，氧化石墨烯在氧化过程中保留了石墨烯的导电性质。
研究表明，氧化石墨烯的电子迁移率约为10000 cm^2V^(-1)s^(-1)，是其他碳基材料的十几到几百倍。
这使得氧化石墨烯在电子器件领域具有广阔的应用前景，如柔性显示器、有机太阳能电池等。
其次，氧化石墨烯具有良好的储能性能。
研究发现，氧化石墨烯具有较高的比表面积和丰富的官能团。
这些特点使得氧化石墨烯作为电容器电极材料具有较高的电容量和较低的内阻。
同时，氧化石墨烯还能够与锂等离子体发生化学反应，形成锂离子储能材料，具有较高的充放电容量和较长的循环寿命。
这使得氧化石墨烯在储能领域有着广泛的应用前景，如锂离子电池和超级电容器等。
此外，氧化石墨烯还具有优异的传感性能。
由于氧化石墨烯的大量官能团和高比表面积，它能够与许多分子发生作用，形成有效的传感器。
研究表明，氧化石墨烯可以用于检测气体、离子和生物分子等，并具有高灵敏度和高选择性。
例如，它可以用作生物传感器，用于检测DNA、蛋白质和细胞等生物分子，具有很高的应用潜力。
最后，虽然氧化石墨烯具有很多优异的电化学性能，但仍然存在一些挑战。
首先，氧化石墨烯的合成方法多样，但仍然面临着较高的成本和复杂的操作。
其次，氧化石墨烯的稳定性相对较差，容易在长时间使用中发生结构变化和降解。
此外，氧化石墨烯还面临制备大规模材料和与其他材料的界面相容性等问题。
综上所述，氧化石墨烯作为一种具有独特电化学性能的材料，对于储能与传感器等领域具有重要的应用前景。
然而，目前仍需要进一步的研究来解决其合成方法、稳定性和大规模制备等问题。
相信随着科学技术的不断发展，氧化石墨烯将在未来取得更多的突破，为我们的生活带来更多的便利。
石墨烯材料在生物体内的应用随着科技的不断进步，石墨烯作为一种新型材料，已经成为引领未来科技发展的主要趋势之一。
近年来，人们发现石墨烯具有复杂的物理和化学性质，在生物医学领域得到了广泛的应用。
一、石墨烯的特性石墨烯是由一层石墨相连而成的超薄晶体，其具有高强度、高导电性、高热导性、高表面积、超强的拉伸强度和电化学反应性等特殊的物理和化学性质。
因此，石墨烯是一个十分有潜力的材料。
二、石墨烯在生物医学领域的应用1. 生物传感器：石墨烯具有极高的表面积和导电性质，可用于制作高灵敏度的生物传感器，可以实现高灵敏的检测和分析。
2. 细胞成像：石墨烯作为一种有利于光学成像的材料，可以在生物体内被光源激活，发出不同颜色的荧光，可以用于细胞成像。
3. 药物传递：利用其高表面积，石墨烯可以被用作药物或其他生物大分子的载体，能够有效地传递药物到患者的身体内。
4. 细胞治疗：石墨烯可以被用于治疗癌症和其他疾病。
石墨烯可以被利用来引导由DNA和RNA构成的特殊分子以精确定位分子关键位置，这些关键位置是药物传递的有效靶点。
5. 细胞培养：石墨烯薄片可以用作细胞培养基底，具有良好的生物相容性。
同时，具有优良的化学和物理性质，对细胞的生长和发展是有益的。
三、石墨烯在生物体内的安全性问题虽然石墨烯具有很多有利的特性，但是在生物体内的安全性始终是一个有待解决的问题。
在使用中，要重视石墨烯的生物相容性，尽可能减少石墨烯对细胞和组织的损伤。
此外，在研究和开发新的石墨烯应用时，应具备先进的技术和科学实验室，并要严格控制石墨烯的制备、处理和使用过程中产生的毒性物质。
四、未来展望石墨烯在生物学领域的研究将是一个长期的课题，未来的应用范围将会更加广泛。
石墨烯可以被用于治疗各种疾病，特别是癌症。
虽然目前还存在一些未解决的安全性问题，但是相信未来随着科技的进步和研究的不断深入，石墨烯必将成为一种十分有潜力的医疗工具。
Vol.33高等学校化学学报No.112012年11月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2378~2384羧基化氧化石墨烯的可控合成及血液相容性汤毅达1,2,周宁琳1,2,3,陆春燕1,2,金素星1,2,吴 悦1,2,3,沈 健1,2,3(1.南京师范大学化学与材料科学学院,江苏省生物医药功能材料工程研究中心,南京210046;2.江苏省生物功能材料重点实验室,南京210046;3.南京大学江苏省表面与界面工程技术研究中心,南京210093)摘要 采用自由基引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)作为功能改性剂,通过AIBN 分解产生的异丁腈自由基进攻氧化石墨烯上五元环与七元环的缺陷点,形成氰基改性氧化石墨烯中间体,再通过水解反应制得羧基化氧化石墨烯[GeneO C(CH 3)2 COOH]纳米材料.采用傅里叶变换红外光谱(FTIR),X 射线衍射(XRD),热重分析(TGA)和原子力显微镜(AFM)等方法对合成的材料进行了表征,并采用复钙时间测试考察了材料的血液相容性.研究结果表明,氧化石墨烯中羧基的含量可以通过调整AIBN 和GeneO 的投料比来控制.本方法不但可提高氧化石墨烯的羧基含量,而且可使其具有良好的血液相容性.关键词 羧基化氧化石墨烯;偶氮二异丁腈;血液相容性中图分类号 O613.71 文献标识码 A doi :10.7503/cjcu20120342收稿日期:2012⁃04⁃13.基金项目:江苏省自然科学基金(批准号:BK2009408)㊁国家自然科学基金(批准号:20874047)㊁江苏高校优势学科建设工程资助项目和江苏省产学研前瞻性联合研究项目(批准号:BY2011109)资助.联系人简介:周宁琳,女,博士,教授,博士生导师,主要从事生物医用功能材料的制备与研究.E⁃mail:zhouninglin@ 自从2004年Firsov 等[1]发现石墨烯以来,石墨烯以其优良的性能成为科学研究的一个热点[2~6].氧化石墨烯(GeneO)与石墨烯的结构相似,也是碳原子在一维平面的无限延伸,只是在其表面含有羟基㊁环氧基和羧基等基团[7].由于氧化石墨上键连了大量的羟基㊁羧基和环氧基以及层间水的支撑作用,更利于实现氧化石墨烯的单片剥离及连续化制备.同时,各种官能团还赋予氧化石墨烯片优良的化学活性和浸润性能,并使其表面带负电,能够在水中(或碱水中)形成纳米级分散,从而为氧化石墨烯的复合应用或纳米有序组装奠定良好的基础[8,9].石墨通过氧化得到氧化石墨,再通过超声分散得到氧化石墨烯,目前比较常用的氧化石墨的合成方法是化学氧化法,包括Brodie 法[10]㊁Standenmaier 法[11]和Hummers 法[12].近年来,随着石墨烯的开发,关于氧化石墨烯的功能化改进与开发也成为研究热点,氧化石墨的表面富含大量的含氧功能团,剥离后的氧化石墨片层具有很大的比表面积.氧化石墨烯的表面化学组成对材料的力学性能和生物学性能有很大影响.氧化石墨烯在溶剂中的分散性能不佳,在溶剂中的溶解性也有待提高,在高分子基体中存在分散不均匀等问题,因此需要对氧化石墨烯进行改性.Paredes 等[13]研究了氧化石墨烯在不同有机溶剂中的溶解性能;Dai 等[14]利用氯乙酸法合成了一种羧基改性的氧化石墨烯,并将氧化石墨烯聚乙二醇化形成NGO⁃PEG 复合物用于药物载体和细胞成像等方面的研究.羧基改性的氧化石墨烯在功能化氧化石墨烯的制备中占有重要地位,通过氧化石墨烯表面活泼羧基的酰胺化或酯化反应,可使各种有机小分子㊁高分子㊁生物大分子以及含有活泼基团的功能材料被共价键合到氧化石墨烯上.目前,主要是利用氯乙酸对氧化石墨烯进行羧基功能化,以活化氧化石墨烯表面的环氧基和羟基,使其转变成为羧基,从而提高其溶解性和生物学性能[14~16].然而,氯乙酸是一种有毒试剂,使其在应用中受到了限制,因此开发一种绿色环保且羧基含量可控的羧基化氧化石墨烯的方法具有重要意义.本文采用一种新的功能改性剂对氧化石墨烯进行羧基化改性.将氧化石墨烯均匀分散在有机溶剂中,加入改性剂偶氮二异丁腈(AIBN),在惰性气体中反应形成氰基改性氧化石墨烯中间体,再经过水解反应制得羧基化氧化石墨烯;并对其结构和血液相容性进行了研究.1 实验部分1.1 试剂与仪器石墨(国药集团化学试剂有限公司,粒度≤30μm);发烟硝酸(A.R.级,上海化学试剂有限公司);氯酸钾(A.R.级)和偶氮二异丁腈(C.P.级)(上海试四赫维化工有限公司);N ,N′⁃二甲基甲酰胺(A.R.级)和甲醇(A.R.级,国药集团化学试剂有限公司);氢氧化钠(A.R.级,西陇化工有限公司);成人全血由江苏省血液中心提供;其它试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水.KQ⁃400KDE 型高功率数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);透析袋(透过分子量:8000~10000,中号).1.2 羧基功能化氧化石墨烯的制备1.2.1 氰基改性氧化石墨烯的制备 氧化石墨采用改良的Brodie 法[17]进行制备.GeneO 胶状溶液参照文献[15]方法制备.将偶氮二异丁腈进行重结晶,储存在阴凉干燥处待用.将0.1g 合成的GeneO 溶于40mL DMF 中,超声分散均匀,搅拌下加入不同质量比的AIBN [m (GeneO)∶m (AIBN)=1∶10~1∶60],抽真空,通入氮气,于70℃搅拌反应5h.将反应产物抽滤,用DMF 洗涤3次,于40℃真空干燥过夜,得到中间体GeneO C(CH 3)2 CN.1.2.2 羧基化氧化石墨烯的制备 将上述氰基改性氧化石墨烯0.1g 溶于10mol /L 的NaOH /CH 3OH溶液中,于90℃搅拌回流反应48h.反应结束后,用HCl 调节pH 至3.0,抽滤,用二次水洗涤产物至中性,得羧基化改性氧化石墨烯[GeneO C(CH 3)2 COOH].1.3 分析测试1.3.1 红外光谱分析 红外光谱分析采用FTIR Nexus670型(Nicolet)红外光谱仪,KBr 压片,分辨率4cm -1,扫描次数64次,扫描范围4000~400cm -1.1.3.2 X 射线衍射分析 X 射线衍射分析采用日本理学D /MAX_rC 型转靶X 射线衍射仪,Cu 靶,Kα射线,管电压40kV,管电流100mA,扫描速度2°/min.1.3.3 热重分析 热重分析采用美国Perkin⁃Elmer 公司的7系列热重分析仪,测试条件:高纯氮气氛围,升温速率为10℃/min,气流量为50mL /min.1.3.4 原子力显微镜表征 考察了GeneO C(CH 3)2 COOH 材料在疏水性溶剂(N ,N′⁃二甲基甲酰胺)与亲水性溶剂(水)中的分散情况.配置适宜浓度的GeneO C(CH 3)2 COOH 溶液,将样品溶液滴加在新鲜剥离的云母片层上,自然晾干.用Aglient Series 5100AFM /STM 仪器在轻敲模式下观测,针尖为硅针尖(Olympus ACT160TS,Japan),图像通过Flatten 软件处理.1.3.5 羧基官能团含量的测定 采用透析法与返滴定法相结合,测定了GeneO C(CH 3)2 COOH 中酸性官能团的含量.配制HCl 标准溶液,标定备用.称取一定量的GeneO C(CH 3)2 COOH 溶解于水中,加入过量的NaOH 固体,将上述液体加入到透析袋中,将透析袋浸入到水中,每隔12h 换一次水,收集换取后的水.向所收集的水样中滴入甲基橙试剂2滴,用HCl 标液进行滴定,当溶液由黄色变成橙色时即为滴定终点.记录所用HCl 的体积,通过返滴定法公式计算 COOH 的含量.返滴定法公式如下:Content of COOH =m (NaOH)M r (NaOH)×1000-c (HCl)×V (HCl)m (Sample)1.4 血液相容性评价采用复钙实验评价了羟基化氧化石墨烯的血液相容性.取10mL 血液,以1000r /min 转速离心分离10min,取上清液及血浆备用.取不同浓度的样品溶液㊁离心后的血液上清液和CaCl 2各100μL 加入到96孔板中,用BioTek synergy2型酶标仪在405nm 下测定复钙时间动力学曲线.9732 No.11 汤毅达等:羧基化氧化石墨烯的可控合成及血液相容性2 结果与讨论2.1 氧化石墨烯的羧基功能化采用自由基引发剂偶氮二异丁腈作为功能改性剂,利用其在一定温度下分解形成的异丁腈自由基进攻氧化石墨烯上五元环和七元环的缺陷点,形成氰基改性氧化石墨烯中间体,再通过水解反应形成羧基改性氧化石墨烯纳米材料(见Scheme 1).其羧基含量可通过调整偶氮二异丁腈的加入量来控制,且接枝在氧化石墨烯上的长链基团的空间位阻作用及极性基团间的相互作用能有效避免氧化石墨烯片层的聚集作用,形成分散性良好的羧基化氧化石墨烯片层.Scheme 1 Reaction process of carboxyl graphene oxide2.2 FTIR 分析图1为合成的氰基改性氧化石墨烯中间体的红外光谱图.可见,随着AIBN 含量的增加,2250cm -1处的氰基特征峰逐渐增强,表明已经形成氰基改性的氧化石墨烯(低含量时由于检测仪器所限,氰基特征峰不明显).Fig.1 FTIR spectra of GeneO (a ),GeneO AIBN withdifferent mass ratios of GeneO to AIBN (b g )and AIBN (h )m (GeneO)∶m (AIBN):b .1∶10;c .1∶20;d .1∶30;e .1∶40;f .1∶50;g .1∶60. Fig.2 FTIR spectra of synthesized GeneO C (CH 3)2 COOH with different mass ratios of GeneO to AIBN m (GeneO)∶m (AIBN):a .1∶10;b .1∶20;c .1∶30;d .1∶40;e .1∶50;f .1∶60.将合成的氰基改性氧化石墨烯进行水解反应即可制得羧基改性氧化石墨烯.图2为合成的GeneO C(CH 3)2 COOH 的红外光谱图.可见,水解产物的羧基吸收峰比较明显(1740和1630cm -1),3440cm -1附近具有强的羟基特征吸收峰,这可能是由于改性氧化石墨烯表面吸附的水分子所致.当m (GeneO)∶m (AIBN)=1∶50时,GeneO C(CH 3)2 COOH 的羟基吸收峰明显增强,同时峰宽也增大,可以认定m (GeneO)∶m (AIBN)=1∶50为较好的反应比例.由图2可见,2250cm -1附近的CN 特征吸收峰基本消失,表明水解反应后GeneO C(CH 3)2 CN 接枝的 CN 已基本水解为羧基.2.3 XRD 分析图3为GeneO,GeneO C(CH 3)2 CN 和GeneO C(CH 3)2 COOH 的X 射线衍射图.可见,氧0832高等学校化学学报 Vol.33 化石墨烯的层间距为0.84nm,经过偶氮二异丁腈改性后的层间距为0.90nm,表明改性使大片层间的距离变大;经过进一步的水解后,GeneO 的d (001)级衍射峰消失(图3谱线c ),表明GeneO C(CH 3)2 COOH 得到了完全剥离.Fig.3 XRDpatterns of GeneO (a ),GeneO C (CH 3)2 CN (b )and GeneO C (CH 3)2 COOH (c )Fig.4 TGA curves of GeneO (a ),GeneO C (CH 3)2 CN (b )and GeneO C (CH 3)2 COOH (c )2.4 TGA 分析图4为GeneO,GeneO C(CH 3)2 CN 和GeneO C(CH 3)2 COOH 的热重曲线.对于GeneO,120℃以前表观水的失重为3%,初始分解温度为382℃;382~450℃时GeneO 片层上的极性基团失重约18%.对于GeneO C(CH 3)2 CN,120℃以前表观水的失重约为3%,初始分解温度为194℃;194~220℃时氧化石墨烯表面接枝的极性基团失重约为26%.而对于GeneO C(CH 3)2 COOH,120℃以前表观水的失重约为4%,初始分解温度为380℃;120~380℃时失重约为9%;380~690℃时GeneO C (CH 3)2 COOH 片层上的极性基团失重约为43%.由表观失水比例可见,GeneO C(CH 3)2 COOH 的吸水率高于GeneO 和GeneO C(CH 3)2 CN.由极性基团失重比例可见,GeneO C(CH 3)2 COOH 片层上极性基团的数量明显高于GeneO 片层上极性基团的数量,表明经过改性后GeneO C(CH 3)2 COOH 片层接枝了更多的极性基团.Fig.5 AFM images of GeneO C (CH 3)2 COOH dispersed in different solutions (A)DMF solution,5mg /mL;(B)aqueous solution,0.4mg /mL;(C)aqueous solution,2mg /mL.2.5 AFM 分析图5的AFM 照片示出了GeneO C(CH 3)2 COOH 在不同分散液中的分散状态.由图5(A)可见,在DMF 溶液中,GeneO C(CH 3)2 COOH 主要呈小片层状分布,宽约0.5μm,长约0.8μm,片层厚度约0.8nm,表明GeneO C(CH 3)2 COOH 基本剥离成单片层状态.虽然表面有接枝基团,但根据相似相容原理, C(CH 3)2 COOH 作为亲水性基团与DMF 存在一定的排斥作用,使GeneO 表面亲水1832 No.11 汤毅达等:羧基化氧化石墨烯的可控合成及血液相容性性链段 C(CH3)2 COOH并未完全地展开,导致片层厚度小于1nm.由图5(B)和(C)示出了GeneO C(CH3)2 COOH分散于水溶液中的形貌,在低浓度(0.4mg/mL)时, GeneO C(CH3)2 COOH主要呈小片层状分散,片层的长和宽均约为0.5μm,片层厚度约1.2nm.通常,越是亲水的表面,水与表面的相互作用越大,在界面易形成水化层[15],使GeneO表面接枝的 C(CH3)2 COOH基团能充分伸展,因此GeneO C(CH3)2 COOH在亲水性溶液中片层厚度比疏水性溶液中的大.在高浓度(2mg/mL)时,GeneO C(CH3)2 COOH主要呈现大片层分散形貌,可能是由于溶液中GeneO C(CH3)2 COOH片层上接枝的 C(CH3)2 COOH基团之间具有一定的氢键作用,使小片层趋于团聚,形成的大片层团聚长约4μm,宽约3.5μm,厚度约1.2nm,与低浓度下的片层厚度基本一致.2.6 羧基官能团的含量所合成的GeneO C(CH3)2 COOH表面羧基的含量决定了后续反应中通过酰胺化或酯化反应接枝的有机小分子㊁高分子或生物大分子的数量.采用透析法与返滴定法相结合测定了GeneO C(CH3)2 COOH中的 COOH含量.图6为AIBN与GeneO以不同配比合成的GeneO C(CH3)2 COOH中羧基的含量曲线.可见,随着AIBN与GeneO反应比例的增大,水解后的产物GeneO C(CH3)2 COOH中的羧基含量逐步增加,当GeneO与AIBN反应比例为1∶50时,羧基含量的增速逐步减缓;继续增加二者的比例,羧基含量变化不大,基本趋于平缓.结合粒径分析及考虑到反应的优化性,实验选取GeneO与AIBN的质量比为1∶50作为改性反应的最佳比例.Fig.6 Carboxyl content curve of GeneO C(CH3)2 COOH synthesized with different ratios of AIBN to GeneO Fig.7 Solubility of GeneO C(CH3)2 COOH in H2O(A)and DMF(B)The concentrations are2mg/mL.将合成的GeneO C(CH3)2 COOH分别溶于水和DMF中(浓度均为2mg/mL),在室温下超声10min后,静置5min拍摄其照片(图7).可见,GeneO C(CH3)2 COOH在水和DMF中均能均匀分散,有利于后续的改性反应.2.7 血液相容性分析表面亲水性被认为是具有良好的血液相容性的特征之一[18].前文[19,20]利用计算机模拟初步探讨了材料表面不同官能团与血液蛋白片断相互作用的分子动力学原理,表明亲水性表面通常具有良好的生物相容性.羧基化氧化石墨烯作为潜在的生物应用材料,需要考察其血液相容性.因此利用复钙实验评价了GeneO C(CH3)2 COOH材料的血液相容性.复钙时间实验是一种评价内源性凝血系统功能的方法,其原理是在去Ca2+的血浆中重新加入适量的Ca2+,使可溶性的纤维蛋白原转化为可溶性纤维蛋白,进而使可溶性纤维蛋白交联成不溶物 血栓,其内源性凝血过程得以重新恢复所需要的时间即为复钙时间.当血液中纤维蛋白原及凝血酶原等凝血因子缺乏或有抗凝物质存在时,复钙时间会有所延长.通常血浆凝固时间越长,其血液相容性越好.由图8可见,不同浓度的GeneO C(CH3)2 COOH样品的复钙时间均比纯血浆(Platelet⁃Poor Plasma,PPP)明显延长,且呈现一种先增大后下降的趋势,总体复钙时间均大于纯血浆的复钙时间.在1,5和10μg/mL的低浓度下,其复钙时间分别为69,126和139min,比纯血浆复钙时间分别增加2832高等学校化学学报 Vol.33 了200%,447%和504%.在50和100μg /mL 的高浓度下,溶液的复钙时间有所降低,但也达到了96和63min,比纯血浆复钙时间分别增加了317%和173%.正常人体血管壁内皮细胞的电位值为负值,血液中的红细胞㊁白细胞及血小板等均为负电性,在水溶液中羧基修饰材料的 COOH 可以部分电离而带负电,带负电的 COO -不易与血液中的物质发生黏附及其它相互作用[15].在低浓度下,GeneO C(CH 3)2 COOH 可较好地分散,与血液接触充分,易于发挥其表面羧基的特性,不易发生黏附;而在高浓度下,GeneO C(CH 3)2 COOH 本身趋于集中,使表面的 COOH 官能团被包裹,反而不利于其与血浆进行作用,导致复钙时间有所降低.Fig.8 Plasma recalcification time of different concentrations of GeneO C (CH 3)2 COOH samples(A)a .1μg /mL;b .5μg /mL;c .10μg /mL;d .50μg /mL;e .100μg /mL;f .positive control;g .negative control.(B)a.1μg /mL;b.5μg /mL;c.10μg /mL;d.50μg /mL;e.100μg /mL;f.PPP+CaCl 2.3 结 论采用自由基引发剂偶氮二异丁腈作为功能改性剂,合成了新型的羧基化氧化石墨烯GeneO C(CH 3)2 COOH,其在H 2O 和DMF 中呈现单片层或多片层分散.通过FTIR,XRD,TGA 和AFM 等对该化合物的结构进行了表征.采用透析法与反滴定法相结合,考察了改性氧化石墨烯的羧基含量,结果表明,通过调控AIBN 和GeneO 的配比,能可控合成具有不同羧基含量的改性氧化石墨烯,为后续的功能化改性奠定了基础,实现了可控合成羧基化氧化石墨烯.采用复钙时间实验对合成的GeneO C(CH 3)2 COOH 进行血液相容性表征.结果表明,不同浓度下GeneO C(CH 3)2 COOH 悬浊液的复钙时间比纯血浆空白样明显延长,其最高值也明显低于纯血浆空白样,表明材料具有良好的血液相容性,在生物医用领域具有潜在的应用价值.参 考 文 献[1] Novoselov K.S.,Geim A.K.,Morozov S.V.,Jiang D.,Zhang Y.,Dubonos S.V.,Grigorieva I.V.,Firsov A.A..Science[J],2004,306(5696):666 669[2] Geim A.K.,Novoselov K.S..Nature Materials[J],2007,6:183 191[3] FU Qiang(傅强),BAO Xin⁃He(包信和).Chin.Sci.Bull.(科学通报)[J],2009,54:2657 2666[4] YUAN Xiao⁃Ya(袁小亚).J.Inorg.Mater.(无机材料学报)[J],2011,26(6):561 570[5] HE Wei(何卫),ZOU Liang⁃Liang(邹亮亮),ZHOU Yi(周毅),LU Xiang⁃Jun(卢向军),LI Yuan(李媛),ZHANG Xiao⁃Gang(张校刚),YANG Hui(杨辉).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2012,33(1):133 138[6] LI Lin⁃Ru(李林儒),FU Hong⁃Gang(付宏刚),LU Tian⁃Hong(陆天虹).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2012,33(1):102 106[7] Park S.,Lee K.S.,Bozoklu G.,Cai W.,Nguyen S.T.,Ruoff R.S..Nano[J],2008,2(3):572 578[8] Chen C.,Yang Q.,Yang Y.,Lv W.,Wen Y.,Hou P.X.,Wang M.,Chen H.M..Advanced Materials[J],2009,21:30073011[9] WANG Xiao⁃Dan(王晓丹),ZHOU Ning⁃Lin(周宁琳),WANG Wei⁃Yan(汪炜燕),TANG Yi⁃Da(汤毅达),ZHANG Jun(章峻),MO Hong(莫宏),SHEN Jian(沈健).J.Func.Mater.(功能材料),2011,42(1):104 107[10] Brodie B.C..Annales de Chimie et de Physique[J],1860,59:466 472[11] Staudenmaier L..Ber.Dtsch.Chem.Ges.[J],1898,31(2):1481 14873832 No.11 汤毅达等:羧基化氧化石墨烯的可控合成及血液相容性4832高等学校化学学报 Vol.33 [12] Hummers W.,Offeman R..J.Am.Chem.Soc.[J],1958,80(6):1339[13] Paredes J.I.,Villar⁃Rodil S.,Martinez⁃Alonso A.,Tascon ngmuir[J],2008,24(19):10560 10564[14] Sun X.,Liu Z.,Welsher K.,Robinson J.T.,Goodwin A.,Zaric S.,Dai H..Nano Research[J],2008,1:203 212[15] XU Dong(徐东),ZHOU Ning⁃Lin(周宁琳),SHEN Jian(沈健).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2010,31(12):2354 2359[16] Wang X.D.,Zhou N.L.,Yuan J.,Wang W.Y.,Tang Y.D.,Lu C.Y.,Zhang J.,Shen J..J.Mater.Chem.[J],2012,22:1673 1678[17] ZHOU Ning⁃Lin(周宁琳),XU Dong(徐东).Antibacterial and Anticoagulation Properties of Graphene Oxide and Its Preparation Method(具有抗菌㊁抗凝血功能的氧化石墨烯及其制备方法),CN201110262856.2[P],2011⁃09⁃07[18] ZHOU Xue⁃Feng(周雪峰),JIANG Xiao⁃Li(江筱莉),GU Ning(顾宁).J.Chem.Ind.Eng.(化工学报)[J],2009,60(6):13411350[19] Zhu H.M.,Li B.,Li L.,Shen J..Science in China Series B:Chemistry[J],2008,51(1):78 85[20] Yan H.,Zhu H.M.,Shen J..Science in China Series B:Chemistry[J],2007,50(5):660 664Controlled Synthesis and Blood CompatibilityProperties of Carboxyl Graphene OxideTANG Yi⁃Da1,2,ZHOU Ning⁃Lin1,2,3*,LU Chun⁃Yan1,2,JIN Su⁃Xing1,2,WU Yue1,2,SHEN Jian1,2,3(1.Jiangsu Engineering Research Center for Biomedical Function Materials,Nanjing210046,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Materials,College of Chemistry and Environmental Science,Nanjing Normal University,Nanjing210046,China;3.Jiangsu Technological Research Center for Interfacial Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing210093,China)Abstract Carboxyl modifiedgraphene oxide is important in the preparation of functionalized graphene oxide (GeneO).In this work,the free radical initiator agent azobisisobutyronitrile(AIBN)was functioned as a modifier.AIBN could be separated into isobutyronitrile radicals to attack the five⁃membered ring and seven⁃membered ring defects in the graphene oxide.Then the cyanogroup⁃modified graphene oxide intermediates were formed,and the carboxyl graphene oxide[GeneO C(CH3)2 COOH]could be obtained through the hydrolysis reaction.The structure and properties of GeneO C(CH3)2 COOH were characterized by Fourier transform infrared spectroscope(FTIR),X⁃ray diffraction(XRD),thermo gravimetric analyzer(TGA)and atomic force microscope(AFM).And the blood compatibility of GeneO C(CH3)2 COOH was evaluated by recalcification time test.It was showed that the recalcification time gradually decreased as the increasing con⁃centration of GeneO C(CH3)2 COOH,indicating that the material had good blood compatibility.Carboxyl group content could be controlled by the mass ratio of AIBN to GeneO.This method not only could increase the carboxyl content of oxidized graphene,but also made the material have a good blood compatibility. Keywords Carboxyl graphene oxide;Azobisisobutyronitrile;Blood compatibility(Ed.:H,Z,K)。
收稿日期：2011-06-02。
收修改稿日期：2011-08-12。
国家自然科学基金(No.51072059)和广东省科技计划(No.2010A080802003)资助项目。
＊通讯联系人。
E -mail ：mcwshma@KH -570功能化石墨烯的制备与表征时镜镜马文石＊林晓丹(华南理工大学材料科学与工程学院，广州510640)摘要：采用Hummers 法对天然石墨进行氧化处理制备了氧化石墨烯，通过γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与氧化石墨烯反应得到功能化氧化石墨烯，然后在水合肼的作用下制备了功能化石墨烯。
未烘干的功能化石墨烯在超声处理下，能稳定分散在体积比为9∶1(V /V )的乙醇/水、丙酮/水或N ，N -二甲基甲酰胺/水的混合溶剂中。
用傅立叶变换红外光谱、原子力显微镜、X 射线光电子能谱及X 射线衍射对样品结构、形貌进行了分析。
结果表明，KH -570上的硅氧烷与氧化石墨烯上的羟基发生了反应，经水合肼还原后，功能化石墨烯的无序度增加，层间距也比功能化氧化石墨烯的缩小了。
功能化石墨烯在DMF/水中呈高度剥离状态，片层厚度为1.1~2.3nm 。
关键词：γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷；氧化石墨烯；石墨烯；功能化中图分类号：O613.71文献标识码：A文章编号：1001-4861(2012)01-0131-06Synthesis and Characterization of Functionalized Graphene with KH -570SHI Jing -JingMA Wen -Shi ＊LIN Xiao -Dan(College of Materials Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China )Abstract:The graphene oxide (GO)was prepared from natural graphite by the Hummers method,and then was modified by introducing 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane(KH -570).The functionalized graphene wassubsequently prepared in the presence of hydrazine hydrate.The functionalized graphene can be stably dispersed in ethanol/H 2O (9∶1,V /V ),acetone/H 2O (9∶1,V /V )or N ,N -dimethyl formamide (DMF)/H 2O (9∶1,V /V ).The samples were characterized by using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR),Atomic Force Microscope (AFM),X -ray Photoelectron Spectroscopy (XPS)and X -ray diffraction (XRD).The results show that siloxane of KH -570reacted with hydroxy group of graphene oxide;the disorder of functionalized graphene increased and the distance between functionalized graphene sheets decreased after the modified graphene oxide was reduced with hydrazine hydrate.Functionalized graphene were exfoliated into single layer or few -layers in DMF/H 2O,and the thickness of sheets is between 1.1nm and 2.3nm.Key words:3-glycidoxypropyltrimethoxysilane;graphene oxide;graphene;functionalized引言石墨烯是单层碳原子二维蜂窝状结构的碳质材料，可以看作是构建富勒烯、碳纳米管、石墨的基本结构单元[1]。
氧化石墨烯表面功能化修饰一、本文概述随着纳米科技的快速发展，石墨烯及其衍生物在多个领域展现出了巨大的应用潜力。
其中，氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）作为一种重要的石墨烯衍生物，因其独特的物理化学性质，如良好的水溶性、易于表面修饰等，受到了广泛关注。
本文旨在深入探讨氧化石墨烯的表面功能化修饰技术，旨在通过对表面修饰方法的详细分析，理解其如何改善氧化石墨烯的性能，拓展其应用范围，以及在未来科技领域可能发挥的重要作用。
我们将从氧化石墨烯的基本性质出发，介绍其制备方法，重点阐述表面功能化修饰的原理、方法和应用实例，以期为相关领域的科研工作者和技术人员提供有价值的参考信息。
二、氧化石墨烯的制备方法氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）的制备是石墨烯化学修饰和功能化的前提。
目前，常用的氧化石墨烯制备方法主要包括Brodie法、Staudenmer法和Hummers法。
其中，Hummers法因其反应条件温和、产物质量高、安全性好等优点而被广泛应用。
Hummers法通常使用石墨粉、浓硫酸、硝酸钠和高锰酸钾作为原料，通过控制反应温度和时间，将石墨粉氧化成氧化石墨烯。
该过程中，高锰酸钾在浓硫酸的作用下，与石墨粉发生氧化还原反应，生成氧化石墨烯。
同时，硝酸钠作为氧化剂，可以提高氧化反应的效率和产物的氧化程度。
在Hummers法制备氧化石墨烯的过程中，反应温度的控制至关重要。
一般来说，反应温度应保持在0℃左右，以防止反应过于剧烈，导致产物质量下降。
反应时间的控制也是影响产物质量的重要因素。
通常，反应时间需要控制在几小时到十几小时之间，以确保石墨粉被充分氧化。
制备得到的氧化石墨烯需要经过洗涤、离心和干燥等后续处理，以去除残余的酸和其他杂质。
洗涤过程中，可以使用稀盐酸或去离子水多次洗涤，直至洗涤液呈中性。
离心操作则用于分离氧化石墨烯沉淀和洗涤液，以获得较为纯净的氧化石墨烯。
将离心得到的氧化石墨烯在真空或惰性气氛下干燥，即可得到最终的氧化石墨烯产物。
氧化石墨烯的优势及应用氧化石墨烯是指石墨烯表面被氧化处理后的产物，具有一定的氧含量。
相比于纯石墨烯，氧化石墨烯具有一些优势，并有广泛的应用。
首先，氧化石墨烯具有良好的可分散性。
由于石墨烯的特殊结构，纯石墨烯很难与溶剂相溶，在应用中难以进行涂覆或制备薄膜等处理。
而氧化石墨烯由于表面带有氧官能团，使其在水和有机溶剂中具有良好的分散性，可以方便地制备出各种形态的石墨烯复合材料。
其次，氧化石墨烯具有较好的生物相容性。
石墨烯具有优异的导电性和导热性，因此在生物领域有广泛的应用前景。
然而，纯石墨烯的应用受到其在体内难以降解的限制。
而经过氧化处理后的石墨烯表面带有氧官能团，使其亲水性增加，更易于与生物体中的水分子相互作用，提高了其在体内的生物相容性。
此外，氧化石墨烯还具有良好的化学活性。
经过氧化处理后，石墨烯上的氧官能团可以与其他化学物质发生反应，进一步改变其性质和功能。
例如，通过在氧化石墨烯上引入氮原子，可以制备出氮化石墨烯，具有类似半导体的电学性能，扩展了石墨烯的应用领域。
氧化石墨烯在许多领域都有广泛的应用。
首先，在能源领域，氧化石墨烯作为电极材料具有优异的导电性和电化学性能，被用于锂离子电池、超级电容器和燃料电池等设备中，提高其电化学性能。
其次，在催化领域，氧化石墨烯也具有良好的应用潜力。
氧化石墨烯的氧官能团可以提供丰富的官能团位点，用于催化反应的活性中心。
例如，氧化石墨烯可以被用作催化剂载体，将金属纳米颗粒固定在其表面，提高催化反应的活性和选择性。
此外，氧化石墨烯还在传感器、生物医药、柔性电子器件等领域有广泛的应用。
石墨烯具有高度的表面积、良好的生物相容性和导电性，使其成为制备生物传感器和柔性电子器件的理想材料。
通过在氧化石墨烯上修饰特定功能的官能团，可以实现对生物分子或环境污染物的高灵敏检测。
总之，氧化石墨烯具有可分散性好、生物相容性高和化学活性强等优势，被广泛应用于能源储存、催化、传感器等领域。
随着对石墨烯材料理解的深入和研究的不断推进，相信氧化石墨烯和其他功能化石墨烯材料的应用前景还会进一步拓展。
[Article]物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao )Acta Phys.⁃Chim.Sin .2012,28(6),1520-1524JuneReceived:November 25,2011;Revised:March 11,2012;Published on Web:March 13,2012.∗Corresponding authors.YANG Rong,Email:yangr@;Tel:+86-10-82545616.HENG Cheng-Lin,Email:hengcl@.The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (20911130229,21073047)and Main Direction Program of Knowledge Innovation of Chinese Academy of Sciences,China (KJCX2.YW.M15).国家自然科学基金(20911130229,21073047)和中国科学院知识创新工程重要方向项目(KJCX2.YW.M15)资助ⒸEditorial office of Acta Physico ⁃Chimica Sinicadoi:10.3866/PKU.WHXB 201203131功能化氧化石墨烯的细胞相容性张晓1,2杨蓉2,*王琛2衡成林1,*(1北京理工大学物理学院,教育部簇科学重点实验室,北京100081;2国家纳米科学中心,中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室,北京100190)摘要:采用改进的Hummers 方法制备了纳米尺度的氧化石墨烯.对氧化石墨烯的表面进行羧基化,并连接上聚乙二醇(PEG)使其在细胞培养液中可溶并能稳定保存.采用透射电镜(TEM)、傅里叶变换红外(FTIR)光谱和zeta 电位测量等对修饰后的氧化石墨烯的结构和功能进行了表征.体外细胞实验表明PEG 修饰的氧化石墨烯在水中具有良好的可溶性,对A549细胞没有明显的毒性,在生物医药领域具有潜在的应用价值.关键词:氧化石墨烯;纳米材料;生物相容性;表面功能化中图分类号:O645Cell Biocompatibility of Functionalized Graphene OxideZHANG Xiao 1,2YANG Rong 2,*WANG Chen 2HENG Cheng-Lin 1,*(1Key Laboratory of Cluster Science of Ministry of Education,School of Physics,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,P .R.China ;2Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety,Chinese Academy of Sciences,National Center for Nanoscience and Technology,Beijing 100190,P .R.China )Abstract:We report on synthesis of nanoscale graphene oxide (NGO)by modified Hummers ’method.Synthesized NGO particles were surface functionalized by attaching carboxylic acid and polyethylene glycol groups to render them soluble in cell culture medium.The structures and properties of functionalized NGO were characterized by transmission electron microscopy (TEM),Fourier transform infrared (FTIR)spectroscopy,and zeta potential analyzer.Cell viability studies show that PEG-modified NGO particles are highly soluble and incur almost no cytotoxicity to A549cells,which suggest a great potential for the use of NGO in various biomedical applications.Key Words:Graphene oxide;Nanomaterials;Biocompatibility;Surface functionalization1IntroductionGraphene,a single layer of carbon atoms with excellent ther-mal,mechanical,and electrical properties,has attracted consid-erable attention in recent years.1-3Graphene oxide (GO)4-10is one of the most important graphene derivatives which contains aromatic regions randomly interspersed with oxidized aliphatic rings.These oxidized rings containing epoxide (C ―O ―C)and hydroxyl (C ―OH)groups,and the GO sheets terminated with both carbonyl (C ＝O)and carboxylic acid (―COOH)groups 5-7can provide reactive sites for chemical modification to obtain new derivatives for biology application.8-10It is known that many pharmaceutical ingredients are poorly solu-ble in water.As a result,their clinical applications are seriously influenced.Therefore,finding a nanoscale drug carrier is criti-cal in biology application.Recently,researchers started to ex-plore the ability of GO in attachment and delivery of aromatic,water insoluble drugs.Yang et al.11investigated loading doxo-rubicin hydrochloride,an anticancer drug,on GO sheets,and1520ZHANG Xiao et al.:Cell Biocompatibility of Functionalized Graphene Oxide No.6found that the loading ratio(mass ratio of loaded drug to carri-ers)of GO could reach200%,much higher than those of other nanocarriers such as nanoparticles that usually have a loading ratio lower than100%.Liuʹs group12studied the in vitro behav-iors of GO in animal experiments.However,before GO material can be used in biology,two main problems should be resolved.First,GO is known to dis-perse well in water but it generally aggregates in salt or other biological solutions.8-10Second,it is not easy to get GO sheets with uniform and suitable size.Size control or size separation on various length scales is necessary to suitably interface with biological systems in vitro or in vivo.12-14Here,we have employed a modified Hummersʹmethod15-18 to fabricate water-soluble nanoscale graphene oxide(NGO), and then performed surface functionalized modification to syn-thesize the PEG functionalized carboxylic acid modified na-noscale graphene oxide(NGO-COOH-PEG)structure.Finally, we have examined the solubility of NGO-COOH-PEG and cy-totoxicity of NGO-COOH-PEG to human lung adenocarcino-ma cells(A549)pared to carbon nanotubes15and nanohorns16loading drugs mainly via surface and tip,our modi-fied NGO has a large specific surface area and loads aromatic anticancer drugs via its two faces and edges,which makes it a promising material as a drug carrier substance.2Materials and methods2.1MaterialsGraphite flake(325mesh),polyethylene glycol(PEG), 1-(3-dimethylamlnopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)and3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli-um bromide(MTT)were supplied by Sigma-Aldrich Chemi-cal;Sulfuric acid(98%H2SO4),KMnO4,H2O2,NaOH, ClCH2COONa,and dimethyl sulfoxide(DMSO)were supplied by Sinopharm Chemical Reagent.All the reagents are of analyt-ical reagent grade and used without further purification.The A549were supplied by Beijing Union Medical College.2.2Synthesis of surface functionalized nanoscalegraphene oxideA modified Hummersʹmethod15-18was used to obtain graph-ite oxide from graphite flake,and then the graphite oxide was dispersed in ultra-pure water to form graphite oxide suspen-sion.The suspension was sonicated for3h so that the graphite oxide became mostly single layered.After that,the suspension was centrifuged for20min to remove undesired impurities, and then the GOs left in suspension are in nanoscale level.In order to attach PEG with NGO,―COOH functional group must be introduced to the NGO surface.First,the NGO suspension was prepared with a concentration of2g·L-1.Then, 0.06mol NaOH and0.03mol ClCH2COONa were added to the suspension and sonicated for2h.The hydroxyl,epoxide,and the carbonyl groups of NGO were reacted chemically and con-verted into―COOH groups upon sonicating the mixture.17Af-ter removing the salt and NaOH from the reacted residual by centrifuging against distilled water,the final product carboxyl-ic acid modified graphene oxide(NGO-COOH)was precipitat-ed and dispersed in water.The color of the NGO suspension changed from brown to black during the reaction,probably due to partial reduction of the NGO under the strong alkaline condi-tion.18After that,the PEG with a concentration of2g·L-1was add-ed to the NGO-COOH solution.The solution was sonicated with EDC for4h.Then the solution was stored for24h so that PEG-amine can combine the NGO-COOH with EDC.The sus-pension was centrifuged for several times.Finally,we got the PEG functionalized carboxylic acid modified graphene oxide (NGO-COOH-PEG).2.3CharacterizationThe structure of the asprepared NGO-COOH-PEG were characterized by transmission electron microscope(FEI Tecnai G220),Fourier transform infrared spectrometer(Perkin Elmer).2.4MTT assay for cell viability testA549cells were cultured in RPMI1640medium(Thermo Scientific)with10%(φ)fetal bovine serum(FBS)and100IU·mL-1penicillin and100µg·mL-1streptomycin,respectively. The culture plates were incubated at37°C in a humidified in-cubator containing5%CO2.The cell viability was tested using MTT assay,which is based on the mitochondrial conversion of tetrazolium salt.19The A549cells were seeded in96-well mi-croplates(Costar,Corning,NY)at densities of8000and5000 cells·well-1respectively in100μL RPMI1640medium(devel-oped by Moore et.al.at Roswell Park Memorial Institute)con-taining10%fetal bovine serum(FBS).After attachment for24 h,the cells were incubated with NGO-COOH-PEG at various concentrations(3.4,13.6,54.4,85.0,and102.0mg·L-1)for an-other48h in a final volume containing150μL medium;then, the medium were removed.After that,150μL of fresh medium and10μL of MTT(5g·L-1in PBS)were added to each well and the culture plates were incubated at37°C with5%CO2for 4h.After removal of the medium,150μL of DMSO was add-ed to each well to dissolve the dye.The absorbance at492nm was measured using a microplate reader.Each data point was derived from three parallel samples.3Results and discussionThe nanoscale graphene oxide(NGO)was synthesized by a modified Hummersʹmethod.Then the NGO was surface func-tionalized by attaching carboxylic acid and polyethylene glycol groups.Fig.1shows the schematic illustration of pegylation of graphene oxide.We have characterized the size of NGO-COOH-PEG using transmission electron microscopy.Fig.2shows the TEM image of NGO-COOH-PEG.One can see that the NGO-COOH-PEG (black dots)exists as platelet having lateral size less than40 nm.The structural evolution from NGO to NGO-COOH and to NGO-COOH-PEG was investigated using FTIR,the results are1521Acta Phys.⁃Chim.Sin .2012V ol.28shown in Fig.3.It can be seen that NGO has three evident ab-sorption bands at ~1053,1629,and 3411cm -1,which are from C ―O ―C ―,―C ＝O and ―OH stretching modes,respective-ly.20-22Besides when carboxylic acid group (―COOH)was connected to NGO to form NGO-COOH,the absorption at around 3430cm -1(from ―OH stretching mode)becomes weak.This is likely due to partial reduction of NGO so that some ―OH groups were consumed under strong alkaline con-dition.When PEG was attached further with the NGO-COOH to form NGO-COOH-PEG,the methylene (―CH 2―)stretch-ing vibration at 2850cm -1from the PEG-ylated reaction is more evident,consistent with the grafting of PEG molecules onto NGO-COOH sheets.The colloid solution zeta potential distributions were studied by measuring zeta potential.Fig.4shows the transformed zeta potential values of the synthesized NGO,NGO-COOH,and NGO-COOH-PEG in their water solution.It can be found thatthe potential distribution curve of NGO has a negatively charged peak with position centered at about -53.4mV ,indi-cating that the NGO water suspension can be stored stably.As for NGO-COOH,the peak position of its zeta potential shifts to -36.1mV .This means that the NGO-COOH water suspen-sion can also be stably stored.However,the peak position of the zeta potential for NGO-COOH-PEG shifts to -11.3mV .In-deed,the NGO-COOH-PEG solution is less stable compared to NGO solution,and NGO-COOH-PEG will precipitate from the water after a longer time store.For a material being used in biomedical area,its biocompati-bility and toxicology must be evaluated.Here,the NGO-COOH-PEG was suspended in water,phosphate buff-ered saline (PBS),and cell culture medium,respectively.We have examined the dispersive abilities of NGO and NGO-COOH-PEG in these three solutions.The results are shown in Fig.5.The experiment was performed at room tem-perature.Fig.5A shows the dispersion status of NGO in water,PBS,and cell culture medium,respectively.We find that NGO is able to uniformly disperse in water to form homogenous and stable solution for several days,but can not dispersed well in PBS and cell culture medium.However,NGO-COOH-PEG could be uniformly dispersed not only in water,but also in PBS and cell culture medium as shown in Fig.5B.The NGO-COOH-PEG could be stably dispersed in PBS and cell culture medium for several days.This is likely due to the screening of electrostatic charge and nonspecific binding of proteins on the NGO-COOH-PEG.14The use of nanomaterials in vitro and in vivo requires that they are biocompatible.23-27The cytotoxic behavior of NGO-COOH-PEG nanomaterials on cells was examined by the MTT assay.A549cell (lung adenocarcinoma cells)viability was as-sessed after exposure to different concentrations of NGO-COOH-PEG for 48h.Control experiments were conducted in a similar manner without the presence of the NGO-COOH-Fig.1Schematic illustration of PEG decoratedNGO-COOHFig.2TEM image ofNGO-COOH-PEGFig.3FTIR spectra of NGO (a),NGO-COOH (b),andNGO-COOH-PEG (c)Fig.4Zeta potential of NGO (A),NGO-COOH (B),andNGO-COOH-PEG(C)1522ZHANG Xiao et al .:Cell Biocompatibility of Functionalized Graphene OxideNo.6PEG.As shown in Fig.6,cell viability data indicated that the NGO-COOH-PEG did not significantly affect A549cell prolif-eration up to the concentration of 102.0mg ·L -1.The results showed that the NGO-COOH-PEG was reasonably nontoxic and biocompatible up to the given concentrations.The similar results were also found by other groups.For example,Zhang et al .14covalently conjugated graphene oxide with dextran (DEX)and incubated it with Hela cells.Their cellular experiments showed that DEX coating on GO offers remarkably reduced cell toxicity.However,our PEG-modified GO showed more uniform size which would be helpful for the next step experi-ments.4ConclusionsWe have adopted a modified Hummers ʹmethod to obtain graphite oxide and then dispersed them in ultra-pure water to form graphite oxide suspension.After multiple sonication and centrifugal screening,water-soluble NGO were received.The NGO sheets were surface functionalized by attaching ―COOH and PEG groups to form NGO-COOH-PEG struc-ture,which is well soluble in PBS and cell culture medium without agglomeration.Cell viability studies show that the functionalized NGO sheets have good solubility.Owing to itssmall size,large specific surface area,low cost,and almost no cytotoxicity to A549cell,the NGO-COOH-PEG could be con-sidered a promising material to have broad biology and medi-cine applications.References(1)Geim,A.K.;Novoselov,K.S.Nat.Mater .2007,6,183.(2)Rozhkov,A.V .;Giavaras,G.;Bliokh,Y .P.;Freilikher,V .;Nori,F.Phys.Rep.2011,503,77.(3)Novoselov,K.S.;Geim,A.K.;Morozov,S.V .;Jiang,D.;Zhang,Y .;Dubonos,S.V .;Grigorieva,I.V .;Firsov,A.A.Science 2004,306,666.(4)Xu,D.;Zhou,N.L.;Shen,J.Chem.J.Chin.Univ .2010,31(12),2354.[徐东,周宁琳,沈健.高等学校化学学报,2010,31(12),2354.](5)Gu,X.G.;Yang,G.;Zhang,G.X.;Zhang,D.Q.;Zhu,D.B.ACS Appl.Mat.Interfaces 2011,3,1175.(6)Schniepp,H.C.;Li,J.L.;McAllister,M.J.;Sai,H.;Herrera-Alonso,M.;Adamson,D.H.;Prud ʹhomme,R.K.;Car,R.;Saville,D.A.;Aksay,I.A.J.Phys.Chem.B 2006,110,8535.(7)Zhang,Q.;He,Y .Q.;Chen,X.G.;Hu,D.H.;Li,L.L.;Yi,T.Chin.Sci.Bull.2010,55,620.[张琼,贺蕴秋,陈小刚,胡栋虎,李林江,尹婷.科学通报,2010,55,620.](8)Liu,Y .;Yu,D.S.;Zeng,C.;Miao,Z.C.;Dai,ngmuir2010,26,6158.(9)Yan,X.B.;Chen,J.T.;Yang,J.;Xue,Q.J.;Miele,P.ACS Appl.Mat.Interfaces 2010,2,2521.(10)Zhang,L.M.;Xia,J.G.;Zhao,Q.H.;Zhang,Z.J.Small 2010,4,537.(11)Yang,X.Y .;Zhang,X.Y .;Liu,Z.F.;Ma,Y .F.;Huang,Y .;Chen,Y .S.J.Phys.Chem.C 2008,112,17554.(12)Yang,K.;Zhang,S.;Zhang,G.X.;Sun,X.M.;Lee,S.T.;Liu,Z.Nano Lett.2010,10,3318.(13)Chang,Y .L.;Yang,S.T.;Liu,J.H.;Dong,E.;Wang,Y .W.;Cao,A.;Liu,Y .F.;Wang,H.F.Toxicol.Lett.2011,200,201.(14)Zhang,S.;Yang,K.;Feng,L.Z.;Liu,Z.Carbon,2011,49,4040.(15)Dikin,D.A.;Stankovich,S.;Zimney,E.J.;Piner,R.D.;Dommett,G.H.B.;Evmenenko,G.;Nguyen,S.T.;Ruoff,R.S.Nature 2007,448,457.(16)Stankovich,S.;Dikin,D.A.;Dommett,G.H.B.;Kohlhaas,K.M.;Zimney,E.J.;Stach,E.A.;Piner,R.D.;Nguyen,S.T.;Ruoff,R.S.Nature 2006,442,282.(17)Li,D.;Müller,M.B.;Gilje,S.;Kaner,R.B.;Wallace,G.G.Nat.Nanotechnol.2008,3,101.(18)Hummers,W.S.,Jr.;Offeman,R.E.J.Am.Chem.Soc.1958,80,1339.(19)Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques./science/book/9780123705013.(20)Fan,X.B.;Peng,W.C.;Li,Y .;Li,X.Y .;Wang,S.L.;Zhang,G.L.;Zhang,F.B.Adv.Mater.2008,20,4490.Fig.5Status of NGO (A)and NGO-COOH-PEG (B)dispersed inwater,PBS,and cell culturemediumFig.6Effect of graphene oxide on A549cellgrowth1523Acta Phys.⁃Chim.Sin.2012V ol.28(21)Rana,V.K.;Choi,M.C.;Kong,J.Y.;Kim,G.Y.;Kim,M.J.;Kim,S.H.;Mishra,S.;Singh,R.P.;Ha,C.S.Macromol.Mater.Eng.2011,296,131.(22)Wang,G.X;Wang,B.;Park,J.;Yang,J.;Shen,X.P.;Yao,J.Carbon2009,47,68.(23)Shan,C.S.;Yang,H.F.;Han,D.X.;Zhang,Q.X.;Ivaska,A.;Niu,ngmuir2009,25,12030.(24)Si,Y.C.;Samulski,E.T.Nano Lett.2008,8,1679.(25)Liu,Z.;Robinson,J.T.;Sun,X.M.;Dai,H.J.J.Am.Chem.Soc.2008,130,10876.(26)Sun,X.M.;Liu,Z.;Welsher,K.;Robinson,J.T.;Goodwin,A.;Zaric,S.;Dai,H.J.Nano Res.2008,1,203.(27)Nguyen,T.T.T.;Tran,E.;Nguyen,T.H.;Do,P.T.;Huynh,T.H.;Huynh,H.Carcin2004,25,647.(28)Wu,H.H.;Yang,R.;Song,B.M.;Han,Q.S.;Li,J.Y.;Zhang,Y.;Fang,Y.;Tenne,R.Wang,C.ACS Nano2011,5,1276.1524。
