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密码子偏性与异源蛋白表达原文：Claes Gustafsson, et al. TRENDS in Biotechnology, 2004,22(7): 346-353./corp/images/MS102504CG.pdf翻译：zhxm409511在1977年，当Genetech的科学家和他们的科研合作伙伴首次利用细菌生产出人类蛋白（生长激素释放抑制因子）时[1]，蛋白的异源表达在整个生物技术产业中发挥着关键的角色。
那时，仅知道生长激素释放抑制因子的氨基酸序列，还不知如何从人的基因组中克隆该基因，因此，Genetech小组采用数条寡核苷酸合成了14个密码子长的生长激素释放抑制因子基因。
Itakura和同事们设计这些寡核苷酸时遵循了三条标准[1]。
首先，优先使用MS2噬菌体偏爱的密码子——尽管当时对大肠杆菌的基因组DNA序列还知之甚少，却已刚刚完成了MS2噬菌体的测序，并认为该噬菌体的序列能够代表大肠杆菌高表达基因所使用的密码子。
其次，消除寡核苷酸不必要的分子内和分子间配对，因为这可能影响基因合成。
第三，避免那些先是富含GC随后是富含AT的序列，当时认为这种序列可能会导致转录终止。
结果，利用这条合成的基因首次制生产出来了具有功能活性的多肽。
25年后的今天，大多数基因克隆自cDNA文库或直接利用聚合酶链反应（PCR）从相应的基因组中扩增获得。
要尽量避免从头合成基因，因为这样做需要消耗大量的财力和人力[2]。
尽管基于PCR的克隆被广泛使用，但很多情况下它还是不及所描述的那样快捷和容易。
它经常需要一些不易得到的模板（对于具有内含子的生物，需要cDNA模板），此外还需要进行PCR条件的优化，需要对PCR产物进行测序，如果PCR引入了任何的配对错误，还经常需要通过定点突变进行修复。
然而，当扩增出的基因克隆入表达载体后，真正有趣的事情就发生了：经常是没有蛋白表达或表达水平很低。
人们已经进行了大量的研究，以提高克隆基因的表达水平，包括优化宿主的生长条件，建立新的宿主系，改用新的宿主，和无细胞系统[3]。
稀有密码子对大肠杆菌蛋白表达影响摘要外源基因中的稀有密码子是影响大肠埃希菌(大肠杆菌)表达的重要因素。
稀有密码子尤其是串联稀有密码子能降低甚至耗竭胞内同源tRNA,降低蛋白表达水平,并具有显著的位置效应。
另外,稀有密码子可以引起外源mRNA翻译过程中的移码翻译、核糖体跳跃和氨基酸错配等异常事件。
本文就稀有密码子影响大肠杄菌蛋白表达的机制研究作一糸统综述。
在所有生物的基因中,对同义密码子的使用都不是随机的,不同的生物对同义密码子的选择有着不同的偏性。
对大肠杆菌基因密码子使用频率分析表明,几乎所有简并密码子家族都对其中一个或两个密码子有偏性,高表达基因比低表达基因的密码子偏性更显著。
同义密码子的使用频率与细胞内同源tRNA的相对数量有直接关联,通常反映出其同源tRNA的浓度。
很多外源基因尤其是真核基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,这些稀有密码子的存在是很多外源基因不能在大肠杆菌得到高效表达的原因之一。
目前有关稀有密码子的研究主要限于精氨酸稀有密码子AGA/AGG,究主要限于精氨酸稀有密码子AGA/AGG,子。
本文就有关稀有密码子影响大肠杆菌蛋白表达的机制研究作一系统综述。
一、稀有密码子的解码速率核糖体在稀有密码子位点翻译速率降低的发现最早来自于对分泌蛋白内称之为暂停位点的研究12。
在这些蛋白的跨膜运输过程中,在暂停位点存在不完全多肽中间物,研究发现暂停位点由几个稀有密码子组成。
这是由于稀有密码子的同源tRNA丰度很低,在核糖体的A位以随机方式寻找与稀有密码子配对的同源氨酰tRNA需要花费比偏性密码子更长的时间,导致多肽延伸的翻译速率降低。
蛋白合成速率由翻译起始速率(Ri)和核糖体在mRNA的移动速率所决定通常偏性密码子的解码速率(Ra)与稀有密码子的解码速率(Rb)都在大于Ri,因而对蛋白合成速率并无影响。
只有在某些条件下当稀有密码子的同源tRNA供应不上时,Rb就会大大低于Ri,引起核糖体停在稀有密码子处,并阻碍了随后的核糖体蛋白合成mRNA上形成核糖体串,这串核糖体的数目由Ra和Rb的速率比所决定。
如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆？影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。
一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
根据载体复制的特点，可分为严谨型和松弛型。
严谨型载体伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主中拷贝数很少（1~3个）；松弛型的复制而不依赖于宿主染色体，在宿主细胞中的拷贝数可多达3000个。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
阻遏子的阻遏作用可由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。
因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖。
而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。
例如可使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时可减少表达产物的降解。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。
诱导表达时，由于强终止子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。
因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
